异种EGFR口服DNA疫苗抑制小鼠Lewis肺癌的生长

目的：观察表达异种鸡EGFR(chicren EGFR, cEGFR)与 IgGγFc融合基因的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗对高表达EGFR 的肺癌Lewis细胞小鼠移植瘤生长的抑制作用。方法：将pVAX1-cEGFR-γFc质粒转化减毒沙门菌SL7207,重组菌SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,免疫荧光法检测cEGFR-γFc融合蛋白的表达。SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc重组菌口服免疫小鼠3次后接种Lewis细胞,Western blotting检测小鼠体内融合蛋白的表达,ELISA法检测免疫小鼠血清抗EGFR抗体的水平。接种Lewis细胞14 d后处死小鼠,瘤体称质量,检测SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc疫苗对Lewis肺癌生长的抑制作用,测定荷瘤小鼠的生存时间。结果：成功构建减毒沙门菌疫苗SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc,SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc感染后,在小鼠后体内外都能检测到cEGFR-γFc融合蛋白的表达;SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc疫苗口服免疫后小鼠能够产生高水平的抗EGFR抗体,口服SL7207/pVAX1-cEGFR-γFc疫苗能够有效抑制小鼠Lewis移植瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间。结论：异种EGFR口服DNA疫苗能够有效地抑制高表达EGFR肺癌的生长,是EGFR分子靶向治疗的一条新途径。     

口服型VEGFR 2 DNA疫苗的研制及其对小鼠的免疫效应

摘 要 目的: 血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial factor recepto-2,VEGFR-2)在肿瘤生长和转移过程中起着重要作用，制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗并研究其生物免疫效应。方法：采用基因重组技术构建VEGFR-2胞外区基因表达载体pcDNA3.1-VR-2， DNA序列分析证实后，脂质体法转染COS-7细胞， Western blotting检测其VEGFR蛋白表达；以氯化钙法将pcDNA3.1-VR-2转化减毒沙门菌SL3261，制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗。口服型疫苗免疫C57BL/6小鼠，ELISA法检测免疫后小鼠外周血VEGFR-2抗体水平，MTT法检测小鼠脾淋巴细胞对小鼠血管内皮细胞的体外杀伤活性。结果：成功制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗。ELISA法检测显示，疫苗组小鼠抗体滴度随着免疫时间和免疫次数的增加而增高，在免疫6周后产生了高水平抗VEGFR-2 IgG类抗体(1.07±0.018)，明显高于生理盐水组(0.14±0.033)和质粒对照组(0.14±0.038)，差异均有统计学意义（F=853.17，P=0.000）。MTT法检测显示，疫苗组小鼠脾淋巴细胞对靶细胞MS1的杀伤率随着效靶比的增加而增加，在效靶比8∶1时CTL活性(89.38±1.51)明显高于生理盐水组(15.17±2.54)和空质粒对照组(12.99±4.31)，差异有统计学意义(F=315.42,P=0.000)。结论：成功制备了口服型VEGFR-2 DNA疫苗，该疫苗可激活小鼠特异性的细胞免疫和体液免疫，为进一步抗肿瘤研究奠定了基础。     

口服型VEGFR-2 DNA疫苗的研制及其对小鼠的免疫效应

目的:血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial factor recepto-2,VEGFR-2)在肿瘤生长和转移过程中起着重要作用,制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗并研究其生物免疫效应.方法:采用基因重组技术构建VEGFR-2胞外区基因表达载体pcDNA3.1-VR-2, DNA序列分析证实后,脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其VEGFR蛋白表达;以氯化钙法将pcDNA3.1-VR-2转化减毒沙门菌SL3261,制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗.口服型疫苗免疫C57BL/6小鼠,ELISA法检测免疫后小鼠外周血VEGFR-2抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞对小鼠血管内皮细胞的体外杀伤活性.结果:成功制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗.ELISA法检测显示,疫苗组小鼠抗体滴度随着免疫时间和免疫次数的增加而增高,在免疫6周后产生了高水平抗VEGFR-2 IgG类抗体(1.07±0.018),明显高于生理盐水组(0.14±0.033)和质粒对照组(0.14±0.038),差异均有统计学意义(F=853.17,P=0.000).MTT法检测显示,疫苗组小鼠脾淋巴细胞对靶细胞MS1的杀伤率随着效靶比的增加而增加,在效靶比8∶1时CTL活性(89.38±1.51)明显高于生理盐水组(15.17±2.54)和空质粒对照组(12.99±4.31),差异有统计学意义(F=315.42,P=0.000).结论:成功制备了口服型VEGFR-2 DNA疫苗,该疫苗可激活小鼠特异性的细胞免疫和体液免疫,为进一步抗肿瘤研究奠定了基础.     

表达VEGFR-2的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗诱导特异性抗胶质瘤血管免疫应答

背景与目的:血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)及其主要受体血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelialgrowth factorreceptor-2,VEGFR-2)在肿瘤新生血管和肿瘤基质形成过程中起着重要作用。本研究的目的是观察表达鼠VEGFR-2的重组减毒沙门氏疫苗菌诱导的抗血管特异性免疫应答及抗胶质瘤作用。方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGFR2,通过电转化法将pcDNA3.1-VEGFR2导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,经由胃管饲予C57BL/6J小鼠,对小鼠进行基因免疫。采用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗VEGFR2-IgG抗体,分离免疫小鼠的脾细胞,分析重组疫苗菌免疫后小鼠体内的特异性细胞毒性T细胞(cytotoxic T lym phocyte,CTL)应答。用携带pcDNA3.1-VEGFR2的重组沙门氏菌免疫治疗胶质瘤荷瘤小鼠,通过测量荷瘤小鼠肿瘤大小,检测肿瘤微血管密度及肿瘤细胞凋亡,评价重组疫苗菌的抗血管及肿瘤生长抑制作用。结果:重组疫苗菌免疫后小鼠产生了高水平的抗VEGFR2-IgG抗体,诱导小鼠脾淋巴细胞产生针对VEGFR2的特异性CTL活性。重组疫苗菌的免疫能够明显抑制胶质瘤的生长。NaH CO3对照组、载体对照组、重组疫苗菌组的平均微血管密度分别为26.5±5.8、27.2±4.5、8.8±1.9,平均凋亡细胞数分别为4.41.2、3.     

KDR基因重组的T7噬菌体疫苗构建及其对小鼠Lewis肺癌抑制作用的研究

目的：构建KDR基因重组的T7噬菌体疫苗以及探讨其对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤作用。方法：克隆KDR的膜外Ⅱ区基因,构建KDR基因重组T7噬菌体疫苗,免疫小鼠,免疫四次后接种Lewis肺癌,观察肿瘤的生长情况,14 d后脱颈椎杀死小鼠,眼球取血、取出瘤体称重,计算抑瘤率,观察抗肿瘤效果。ELISA检测小鼠血清抗KDR抗体滴度。结果：实验组抑制程度明显,肿瘤生长速度最慢,肿瘤重量与生理盐水组和空白噬菌体组相比有统计学差异(P＜0．05),抑瘤率可达57．0%,远大于空白噬菌体组(16．0%)。小鼠血清稀释至1∶500,小鼠特异性抗人源KDR抗体仍呈阳性。结论：KDR基因重组的T7噬菌体疫苗对小鼠Lewis肺癌具有明显的抗肿瘤作用,用人源KDR作为免疫原免疫小鼠通过免疫交叉反应可以打破对自身抗原的免疫耐受,产生特异性的免疫反应。     

携带flk1的重组减毒沙门氏菌的构建及其抗肿瘤血管生成的研究

目的:观察携带鼠血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,flk1)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌诱导的flk1特异性免疫应答及抗肿瘤血管生成作用.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-flk1,并将其转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,体外感染小鼠巨噬细胞,用Western印迹对表达产物进行鉴定,将重组菌口服免疫小鼠,分析免疫后小鼠体内的特异性CTL应答.采用藻酸盐微囊实验观察其对体内肿瘤血管生成的影响.结果:免疫印迹试验表明携带pcD-NA3.1-flk1表达载体的重组菌感染的小鼠巨噬细胞能表达flk1蛋白,免疫小鼠脾淋巴细胞产生针对flk1的特异性CTL活性.重组疫苗菌的免疫能够明显抑制小鼠体内肿瘤血管的形成.结论:携带flk1的重组减毒沙门氏菌经口服免疫,诱导小鼠产生抗flk1的特异性免疫反应,且能明显产生抗肿瘤血管生成作用.     

血管生长因子与肿瘤血管生成

血管生成对恶性肿瘤的发生、发展和预后至关重要。就血管内皮生长因子、血小板源性内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等血管生成调节因子的研究进展进行综述,介绍了抗血管生存治疗肿瘤的现状和发展动向。     

吉非替尼联合靶向EGFR DNA疫苗对小鼠Lewis肺癌细胞体内外的抑制作用

目的：探讨吉非替尼（gefitinib）联合靶向EGFR DNA疫苗对小鼠Lewis肺癌体内外的抑制作用。方法：用鸡EGFR与兔IgG Fc段异种融合DNA疫苗pVAX1/cEGFRrFc免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法测定抗血清的效价。MTT法检测Lewis细胞的生长情况。建立Lewis肺癌鼠移植瘤模型,随机分为疫苗组、吉非替尼组、吉非替尼+疫苗组和对照组,观察各组小鼠肿瘤体积、重量及生存情况。结果：pVAX1/cEGFRrFc DNA疫苗免疫小鼠后抗EGFR血清效价为1∶1 000。与抗血清组或吉非替尼组相比,抗血清+吉非替尼组可显著抑制Lewis细胞的生长（P<0.05)。体内实验显示,吉非替尼+疫苗组小鼠移植瘤生长缓慢, 荷留小鼠生存率显著提高（P<0.01） 。结论：以EGFR为靶点的DNA疫苗和靶向药物吉非替尼之间具有协同性抗肿瘤作用,DNA疫苗主动免疫可以提高吉非替尼的疗效。     

VEGF、VEGFR及其在肝癌血管生成中的研究进展

肝癌是富血管性的恶性肿瘤.血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)在肿瘤血管生成中发挥了重要作用.而针对VEGF和VEGFR的肝癌治疗药物如索拉非尼、贝伐单抗、干扰素a、PTK787等也日益受到重视.     

胃肠道肿瘤的抗血管生成治疗

抗血管生成是治疗肿瘤的新途径。血管内皮生长因子(VEGF)是目前已知作用最强的促血管形成因子,因而是抗血管生成治疗的主要靶点。本文重点综述贝伐单抗等几种抗血管生成药物治疗结直肠癌的研究进展,并简要叙述消化道其他肿瘤抗VEGF研究的情况。     

COX-2与VEGF在人肺癌组织中的表达

背景与目的　已有研究发现环氧化酶2(COX 2)和血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤组织中有高表达且对患者的预后有重要影响。本研究拟探讨肺癌组织中COX 2及VEGF的表达及作用。方法　应用组织芯片技术制成126例肺癌组织芯片,采用免疫组化方法对标本中COX 2及VEGF的表达进行检测,并对COX 2的表达情况与疾病生物学特点、患者生存时间等关系进行了回顾性队列研究。结果　COX 2 阳性表达86例(68.25%)。COX 2在肿瘤中的表达与肿瘤T分期、N分期及疾病临床分期等具有密切关系(P<0.05)。VEGF同样在肺癌组织中有高表达(98/126,77.78%),且与COX 2的表达在统计学上具有显著正相关(χ2=6.72,P<0.05)。COX 2和VEGF表达水平与患者生存时间有密切关系(P<0.05)。结论　COX 2与VEGF在人肺癌组织中均有高表达,两者能分别作为患者生存时间预测的单因素影响因子,且同是外科手术切除后的肺癌病例预后较差的标志。     

CTX小剂量化疗在抗肺癌血管生成中的作用

目的：研究小剂量环磷酰胺（CTX）对肺癌血管生成的影响及其机制。方法：培养人肺腺癌A549细胞，建立裸鼠移植瘤模型，随机分为小剂量CTX组、大剂量CTX组和对照组进行化疗，观察裸鼠体重变化和抑瘤效果，免疫组化检测肿瘤微血管密度（MVD）、缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF-1α）和VEGF的表达。结果：小剂量组肿瘤生长缓慢，体重减轻等副作用明显小于大剂量组和对照组（P〈0．01或P〈0．05）；与大剂量组、对照组比较，小剂量组MVD、HIF-1α和VEGF表达均明显减少（P〈0．01），且小剂量组移植瘤中HIF-1α和VEGF、HIF-1α和MVD、VEGF和MVD之间均有相关性。结论：与大剂量组和对照组相比，小剂量CTX化疗组能更显著地抑制肺癌血管生成，抑瘤效果更明显，其机制可能与下调HIF-1α蛋白表达有关。     

CT增强时间密度曲线与肺癌血管生成关系的研究

背景与目的 新生血管形成与肿瘤细胞无限增殖密切相关.本研究的目的是分析肺癌组织中环氧化酶-2(COX-2)、血管内皮生长因子(VEGF)表达,微血管密度(MVD)与CT增强表现的相关性.方法 对经病理证实的25例肺癌及35例肺良性疾病患者行CT增强扫描,并应用PV法对病理标本进行免疫组化分析.结果 肺癌组COX-2(P＜0.05)、VEGF(P＜0.05)、MVD(P＜0.05)及CT强化峰值(P＜0.01)均明显高于肺良性肿瘤组.肺癌组织中COX-2、VEGF、MVD与组织学类型、临床分期、淋巴结转移及CT强化峰值之间有密切关系,与肺癌的分化程度无明显关系.结论 COX-2、VEGF、MVD可作为临床评价肿瘤发展、估计肿瘤预后的重要分子生物学指征.CT增强检查可以反映肺癌的血供特点,可根据CT增强峰值来推测肿瘤的侵袭、转移及预后情况.     

基因枪介导的neu基因DNA疫苗抗肿瘤作用的实验研究

目的 探讨DNA疫苗pWRG-neu的皮内免疫,对高表达neu基因的小鼠移植瘤生长和转移的抑制作用。方法 向小鼠黑色素瘤B16F10细胞系转染pcDNA-neu,用有限稀释法筛选一株高表达neu基因的细胞株B16F10-neu。在基因枪介导下,向C57BL／6小鼠导入DNA疫苗pWRG-neu,通过观察免疫动物的生存期,评价DNA疫苗的抗肿瘤作用。分离免疫动物脾细胞,经自体淋巴细胞混合培养实验,分析DNA疫苗体内免疫后机体的CTL应答。结果 筛选到一株高表达neu基因的B16F10-neu细胞株,转基因过程和外源基因的表达没有改变细胞系的增殖特性。用基因枪轰击,进行DNA疫苗pWRG-neu皮内免疫,对小鼠黑色素瘤B16F10-neu进行预防、治疗和抗转移的实验研究,结果表明,DNA疫苗的免疫能够明显推迟移植瘤的生长,延长小鼠生存期,获得明显的抗肿瘤效果。DNA疫苗免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞CTL活性。结论 基因枪介导的DNA疫苗pWRG-neu经皮内免疫,能够有效的诱导机体的细胞免疫应答,预防和治疗小鼠移植瘤的发生,并有一定的预防肿瘤肺转移的作用。     

bFGF单克隆抗体抑制小鼠Lewis肺癌转移及血管新生

背景与目的:碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种具有广泛生物学功能的细胞因子,在肺癌等多种肿瘤组织高表达,并参与其发生、发展进程.本研究旨在探讨bFGF单克隆抗体对C57 BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、转移及血管新生的抑制作用.方法:采用皮下接种肿瘤细胞的方法,建立Lewis肺癌自发转移小鼠模型,随机分为PBS组、bFGF单克隆抗体MabF7治疗组,以及正常小鼠IgG阴性对照组,每组8只.自接种第9天开始给药,每3天1次,连续6次.同时观察Lewis肺癌小鼠健康状况,游标卡尺测量皮下移植瘤体积,给药6次后处死小鼠,称瘤质量,取肺组织计数各组小鼠肺表面转移瘤结节数,并用免疫组化法检测CD31的表达,以计算肿瘤组织微血管密度(microvessel density,MVD).结果:MabF7治疗组小鼠肿瘤体积与PBS组相比生长缓慢,小鼠瘤质量为(2.6±1.0)g,较PBS组的(5.1±1.3)g显著降低(P＜0.05);MabF7组小鼠肺表面转移瘤结节数为(3.0±2.1)个,显著低于PBS组的(12.3±2.4)个(P＜0.05).另外MabF7组可显著抑制肿瘤组织MVD表达水平.结论:bFGF单抗可明显抑制C57 BL/6小鼠Lewis肺癌生长及转移,其作用与抑制肿瘤增殖及微血管生成相关.     

异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用

背景与目的:肿瘤的生长、转移和新生血管生成有密切关系,血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是已知作用最强、最专一的促血管生成因子。本实验采用噬菌体展示技术,构建人血管内皮生长因子重组T7噬菌体疫苗,并检验疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用。方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人肺癌组织克隆出人VEGF165基因,将人VEGF165基因与T7Select10-3b噬菌体基因重组,构建T7Select10-3b_VEGF噬菌体疫苗,制备噬菌体效价达到1×1013pfu/ml。将C57BL/6J小鼠随机分为3组,T7-VEGF疫苗组10只、空白噬菌体组(T7)10只、生理盐水组(NS)10只。将各组样品与等体积弗氏佐剂混合,各组小鼠每只每周分别免疫1×1012pfu/200!l重组噬菌体疫苗、空白噬菌体、生理盐水,共免疫4周。接种Lewis肺癌细胞,观察肿瘤的生长情况和小鼠状态.接种肿瘤14天后,处死小鼠,剥离肿瘤称重,检测小鼠血清中特异性抗VEGF抗体滴度、肿瘤微血管密度(microvesseldensity,MVD)。结果:T7-VEGF疫苗组,T7组、生理盐水组肿瘤均重分别为:(0.543±0.259)g、(0.982±0.359)g、(1.169±0.460)g。疫苗组肿瘤重量明显小于生理盐水组(P<0.01)。疫苗组血清产生抗VEGF抗体滴度为1∶1000。疫苗组、空白噬菌体组、生理盐水组MVD分别为:8.5±0.8,16.4±1.3,18.5±1.6。疫苗组MVD明显小于生理盐水组。结论:异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗可干扰机体对自身VEGF的免疫耐受,可产生较高水平的特异性抗VEGF抗体,并具有抑制小鼠Lewis肿瘤生长的效应。