幽门螺杆菌VacA毒素的初步纯化

早期发现幽门螺杆菌 (Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ)液体培养上清中含有导致哺乳动物上皮细胞产生空泡的物质 ,后来证实是由一种相对分子质量 (Ｍｒ)约为870 0 0或 95 0 0 0的Ｈｐ分泌蛋白引起 ,因而命名为致空泡变性细胞毒素 (ＶａｃＡ)。本研究采用多种液相层析方法的组合 ,对ＨｐＭｒ 为 95 0 0 0的ＶａｃＡ蛋白进行分离纯化 ,为进一步研究ＶａｃＡ的作用机制奠定基础。采用经硫酸铵沉淀及透析后得到的ＨｐＣＣＵＧ 17874菌株液体培养浓缩上清 ,应用吸附层析、疏水层析、阴离子交换层析及凝胶过滤等液相层析方法进行Ｖａｃ…     

产空泡毒素幽门螺杆菌感染的临床意义

幽门螺杆菌 (Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ)感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡和萎缩性胃炎的重要病因之一 ,并与胃癌、胃淋巴瘤的发生密切相关 ,其中人群中的感染率超过 50 % ,目前已被世界卫生组织列为一级致癌因子〔1〕。Ｈｐ的致癌因子包括 :尿素酶、脂多糖、热休克蛋白、磷脂酶和空泡毒素 (ｖａｃｕｏ ｌａｔｉｎｇｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ,ＶａｃＡ)等。其中ＶａｃＡ蛋白仅有部分菌株产生 ,可引起上皮细胞出现空泡样变及胃粘膜病变。为了解重庆地区ＨｐＶａｃＡ 株的感染与不同消化道疾病的关系 ,我们采用ＥＬＩＳＡ法和细…     

幽门螺杆菌空泡毒素基因克隆、表达及其重组蛋白免疫学特性的鉴定

已发现幽门螺杆菌 (Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ ,Ｈｐ)疫苗具有预防和治疗Ｈｐ感染的效果〔1〕。大多数Ｈｐ菌株均能产生空泡毒素 (ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ,ｖａｃＡ) ,其前体蛋白在分泌过程中只有相对分子质量 (Ｍｒ)约87× 10 3的ＶａｃＡ被转运到细胞外 ,Ｍｒ 为 4× 10 3氨基末端信号肽和 5 0× 10 3羧基末端多肽分别留于细菌内、外膜中〔2〕。Ｈｐ感染者血清中可出现ＶａｃＡ抗体 ,重组ＶａｃＡ在ＨｐＳＳ1株小鼠感染模型中有 80 %的保护率〔3〕。我们构建了ｖａｃＡ原核表达系统 ,所表达的重组ＶａｃＡ…     

幽门螺旋菌(HP)空泡毒素编码基因的变异

采用ＰＣＲ技术由一ＨＰ临床分离菌株的基因组ＤＮＡ扩增其空泡毒素基因（ＶａｃＡ）的基因片段（ＶａｃＡ８１１１３５４,５４３ｂｐ）,以ＴＡ克隆方法构建了此目的基因片段的重组克隆。纯化的重组菌质粒ＤＮＡ经ＥｃｏＲＩ消化后做１％ａｇｒｏｓｅ电泳。结果显示：...     

体外快速筛选和鉴别Coxsackievirus B3有毒株和无毒株方法

由于缺乏有效的体外鉴别柯萨奇病毒Ｂ3 (ＣｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓＢ3 ,ＣＶＢ3 )致病性的方法 ,长期以来接种乳鼠体内观察心肌病变。本研究所用的ＨｅＬａ细胞和人脐静脉内皮细胞均从中国典型物培养保藏中心 (武汉 )购买。标准病毒株ＣＶＢ3 /0 (非致病株 )由Ｂｅｃｋ教授 (ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｏｒｔｈ ｅｒｎＣｏｌｏｒａｄｏ,ＵＳＡ)惠赠 ,ＣＶＢ3ｍ(致病株 )由钟学宽教授 (哈尔滨医科大学 )惠赠 ,ＣＶＢ2 、ＣＶＢ6,脊髓灰质炎病毒由同济医科大学病毒室提供。阳性质粒 :Ｐｓｖｃｖｂ3 5 9(携带ＣＶＢ3 致病株全基因组 )和Ｐ…     

黄芪总皂甙对CVB_3感染心肌细胞cTnI、SERCA活性及mRNA表达的影响

目的 :探讨黄芪提取物 -黄芪总皂甙对柯萨奇Ｂ3(ＣＶＢ3)感染的培养ＳＤ乳鼠心肌细胞损伤模型的保护作用 ,对病毒引起的肌浆网钙泵 (Ｓａｒｃｏ/ＥｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍＣａ2 ＡＴＰａｓｅ,ＳＥＲＣＡ)活力及其ｍＲＮＡ表达变化的影响。方法 :将培养ＳＤ乳鼠心肌细胞分为正常组、模型组及黄芪组 ,模型组及黄芪组以柯萨奇Ｂ3亲心肌病毒株 (ＣＶＢ3ｍ,ＴＣＩＤ50 为 1 0 5 .83)感染心肌细胞。 72～ 96ｈ后 ,观察各组细胞病变作用 (ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆ ｆｅｃｔ,ＣＰＥ) ,检测其培养上清心肌肌钙蛋白Ｉ(ｃＴｎＩ)含…     

CagA+幽门螺杆菌滤液对胃上皮细胞GES1的作用及其机制

幽门螺杆菌 (Ｈｐ)的细胞毒素相关蛋白 (ＣａｇＡ)在胃癌发生中具有重要的作用〔1〕,然而 ,其发病机制尚不清楚。由于在Ｈｐ致胃癌发病过程中有引起癌基因活化及抑癌基因失活、细胞ＤＮＡ损伤及胃粘膜细胞的恶性转化等可能性 ,推测在Ｈｐ致胃癌过程中存在相应的基因改变。为了探讨Ｈｐ感染与胃癌发生的分子机制 ,我们研究ＣａｇＡ阳性 (ＣａｇＡ+ )的Ｈｐ培养滤液在体外对胃粘膜上皮细胞的作用 ,并采用经ＣａｇＡ+ Ｈｐ培养滤液诱导恶性转化的胃粘膜细胞 ,与ＣａｇＡ阴性 (ＣａｇＡ-)Ｈｐ培养滤液处理的胃粘膜细胞进行ｍＲＮＡ差异显示 ,以…     

霍乱弧菌中存在不含霍乱毒素基因的噬菌体CTXΦ基因组

目的近年研究发现产毒霍乱弧菌的毒素基因ｃｔｘＡＢ由其溶原性噬菌体ＣＴＸΦ编码,这种丝状噬菌体可携带ｃｔｘＡＢ传递给无毒素基因的霍乱菌株。研究认为ｃｔｘＡＢ基因与ＣＴＸΦ基因组中的其它基因是严格共存的。然而在本实验室研究中,于不含ｃｔｘＡＢ基因的ＥｌＴｏｒ型霍乱弧菌（ＥＶＣ）中发现部分菌株含有ＲＳ基因同源序列,为此对这些菌株作ＣＴＸΦ基因组的进一步研究。方法以ＣＴＸΦ基因组中的ｃｔｘＡ、ｃｔｘＢ、ｚｏｔ、ａｃｅ、ｃｅｐ和ＲＳ１结构基因制备探针,对ｃｔｘＡＢ－菌株染色体作Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测,并用ＰＣＲ方法检测ＣＴＸΦ的感染受体毒素共调菌毛（Ｔｃｐ）的ｔｃｐＡ基因。结果发现有４株分离自河水的霍乱毒素基因阴性ＥＶＣ菌株仍含有溶原噬菌体ＣＴＸΦ的基因组,为ｃｔｘＡ－ｃｔｘＢ－ｚｏｔ＋ａｃｅ＋ｃｅｐ＋ＲＳ＋菌株,另有一株分离自病人的ＥＶＣ菌株仅表现为ＲＳ＋。这些菌株均含ｔｃｐＡ基因。结论ｃｔｘＡＢ基因并不一定与ＣＴＸΦ其它基因共存于一个菌株中,发现了在霍乱弧菌中溶原噬菌体ＣＴＸΦ基因组内可以不携带毒素基因ｃｔｘＡＢ的存在形式     

幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的分离纯化

在对Ｈｐ毒力因子进行的研究中 ,发现ＣａｇＡ基因是Ｈｐ高毒力株的标志基因。其编码产物 细胞毒素相关蛋白Ａ(ＣａｇＡ)是引起人类严重胃部疾患的主要因素之一 ,ＣａｇＡ基因并不存在于所有的Ｈｐ菌株中 ,在中国人中约有 90 %感染者含有此基因。该基因已被克隆和测序 ,含有ＣａｇＡ基因与不含ＣａｇＡ基因的菌株在致病能力上存在显著的差异。目前一致认为含ＣａｇＡ基因的Ｈｐ菌株为高毒株 ,与消化性溃疡 ,萎缩性胃炎及胃癌的发生密切相关。ＣａｇＡ蛋白位于细胞表面 ,是一种亲水性免疫显性蛋白 ,可刺激患者机体产生相应的ＩｇＧ和ＩｇＡ抗…     

原位PCR检测人胃粘膜中幽门螺杆菌cagA

具有细胞毒素相关基因Ａ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅＡ,ｃａｇＡ）的幽门螺杆菌（Ｈｐ）感染可引发慢性萎缩性胃炎及胃癌等严重胃部疾病。因此,ＨｐｃａｇＡ的检测倍受临床重视。我们建立了检测ＨｐｃａｇＡ的原位ＰＣＲ技术,并对胃粘膜ＨｐｃａｇＡ进行了定位观察。临床标本１００份均为病理诊断明确的胃粘膜石蜡切片,其中慢性浅表性胃炎３０例、慢性萎缩性胃炎３０例、胃癌４０作者单位：４３００６０武汉,武汉市第三医院例。根据ＨｐｃａｇＡ的ＤＮＡ序列设计合成１对引物,分别采用原位ＰＣＲ和常…     

柯萨奇B3病毒引起心肌细胞凋亡的初步探索

目的 以病毒性心肌炎（ｖｉｒａｌ ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ,ＶＭＣ）细胞感染模型为基础,研究柯萨奇Ｂ３病毒（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＢ３ ｖｉｒｕｓ,ＣＶＢ３）感染与心肌细胞凋亡的关系。方法 在嗜鼠心肌柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３ｍ）感染心肌细胞后２４ｈ电镜观察细胞超微结构的改变,同时取细胞悬液以流式细胞仪检测“凋亡峰”,了解细胞亡率,并采用酶联免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）定量测定ＣＶＢ３ｍ病毒感染后１、２、４、     

人肺癌细胞中蛋白激酶C亚类与cAMP-PKA系统相关性的研究

为了探讨蛋白激酶Ｃａ及其与环腺苷酸－蛋白激酶Ａ信号系统的相关性，用六甲撑双乙酰胺（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｅｔａｍｉｄｅ，ＨＭＢＡ）和ＰＫＣ抑制剂ＣａｌｐｈｏｓｔｉｎＣ分别处理人肺癌细胞ＬＴＥＰａ－２，统计细胞生长百分类，测定ｃＡＭＰ水平。用斑点杂交方法检测ＰＫＣａ基因表达，并测定表达反义ＰＫＣａ的人肺癌ＬＴＥＰａ－２细胞中ＰＫＣ与ＰＫＡ激酶活性，结果显示：５μｍｏｌ／ＬＨＭＢＡ处     

慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞Fas和FasL的表达及临床意义

Ｆａｓ和ＦａｓＬ是介导细胞凋亡的主要系统 ,我们应用逆转录 ＰＣＲ方法 ,对 37例慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞Ｆａｓ和ＦａｓＬ的表达进行检测 ,初步探讨其在慢性乙型肝炎患者活化诱导的外周血淋巴细胞凋亡中的作用。对象与方法病例来源 :我院 1998～ 1999年 37例慢性乙型肝炎患者 ,男 2 6例 ,女 11例 ,年龄 16～ 6 0岁。诊断按1995年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎标准〔1〕。活动期 :ＡＬＴ >10 0Ｕ/Ｌ ,乙肝标志物 :ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｂ阳性 ,ＨＢＶＤＮＡ阳性。排除ＨＡＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、ＨＥＶ…     

preS2反义寡核苷酸降低端粒酶活性及诱导肝癌细胞凋亡的作用

反义核酸技术从分子水平破坏靶基因 ,已用于多种抗病毒的试验。我们以人工合成的硫代反义寡核苷酸研究针对ＨＢＶ不同区段反义寡核苷酸ＨＢＶ的抑制作用 ,从中筛选了效果最好的针对ＨＢＶｐｒｅＳ2的反义序列 (ａｓ ｐｒｅＳ2 )。为进一步探讨ａｓ ｐｒｅＳ2在肝癌治疗中的应用价值 ,以ＨＢＶＤＮＡ整合的肝母细胞瘤细胞ＨｅｐＧ2 .2 .15为研究对象 ,采用ＦＡＣ ＳＣＡＮ流式仪检测细胞凋亡率 ,ＴＲＡＰ银染测定细胞端粒酶活性 ,同时以ＲＩＡ法检测培养上清中的血清铁蛋白浓度。设计合成针对ｐｒｅ Ｓ2基因 (ｐｅｒ Ｓ2 )翻译起始区 (32 0 3…     

血管平滑肌细胞增殖与迁移的机制研究

目的 :研究血管平滑肌细胞 (ＶＳＭＣｓ)增殖与迁移在动脉粥样硬化 (ＡＳ)的早期、中期或ＡＳ进展期或血管事件的发病机制中的作用。方法 :采用改良的Ｂｏｙｄｅｎ小室法检测ＶＳＭＣｓ的迁移效应 ;以ＭＴＴ法、3 Ｈ ＴｄＲ掺入法、3 Ｈ 脯氨酸标记法和ＶＳＭＣｓ计数评价ＶＳＭＣｓ的增殖效应 ;将培养的ＶＳＭＣｓ分为 5组 :2 %胎牛血清 (2 %ＦＣＳ)组、ＡｎｇⅡ组(其浓度为 10 -10 ～ 10 -6Ｍｏｌ/Ｌ)、Ｌｏｓａｒｔａｎ组 (其浓度为10 -7～ 10 -5Ｍｏｌ/Ｌ)、ＭＣＰ 1ｍｃＡｂ组 (终浓度为 10 μｇ/ｍｌ)和阳性对照组 (含 5 %的酵母多糖…     

机体免疫反应和CagA对幽门螺杆菌长期感染转归的影响

10年前在我院行胃镜、病理和Ｈｐ检测确诊为Ｈｐ阳性者 6 3例 ,10年后到我院复查再次行上述检查 ,其中 16例转阴 ,47例仍为阳性。采用细菌培养和Ｇｉｅｍｓａ染色检测胃粘膜内Ｈｐ ,用间接ＥＬＩＳＡ法检测了 47例Ｈｐ持续感染 10年患者血清抗ＨｐＣａｇＡ ＩｇＧ和抗ＨｐＩｇＥ ,并检测了这些患者 10年前后胃镜和病理组织学变化。47例Ｈｐ持续阳性患者 10年前后消化性溃疡 (ＰＵ)的发生率由 14例(2 9 78% )发展至 2 5例 (5 3 19% ) (Ｐ <0 .0 5 ) ;胃粘膜糜烂由 8例 (17 0 2 % )发展至 18例 (38 2 9% ) (Ｐ <0 .0 5 ) ;肠上皮化生 (ＩＭ)由…     

VEGF_(165)cDNA在酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的研究人 ＶＥＧＦ１６５基因在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的重组ｈＶＥＧＦ１６５。方法采用ＰＣＲ扩增ｈＶＥＧＦ１６５基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达载体中,构建重组质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ｈＶＥＧＦ１６５。经转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,用 １０ ｍＬ／Ｌ甲醇诱导表达。表达产物经Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化后,以人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）测定其生物学活性。结果ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,表达产物以可溶性分子的形式存在于上清中,诱导４ｄ的表达量达上清中总蛋白的６０％以上。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经Ｈｅｐ－ａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化, ｒｈＶＥＧＦ１６５的纯度可达到９０％以上。生物学活性检测证实,其具有刺激脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）增殖的活性。结论在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统中,实现了ｈＶＥＧＦ１６５的高效分泌性表达。     

幽门螺杆菌抗菌肽对消化道致病菌的杀伤作用

幽门螺杆菌 (Ｈｐ)可产生杀菌肽样抗菌多肽 (ｃｅｃｒｏｐｉｎ ｌｉｋｅａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｅｐ ｔｉｄｅ ,Ｈｐ ＣＡＢＰ)。这种来源于Ｈｐ核糖体蛋白Ｌ1(ｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎＬ1,ｒｐＬ1)的Ｎ 端肽 ,在结构与功能的许多方面与杀菌肽 (Ｃｅｃｒｏｐｉｎｓ)相似。我们通过研究Ｈｐ源杀菌肽样抗菌肽Ｈｐ( 2 2 0 )对消化道常见致病菌的杀伤作用 ,探讨Ｈｐ产生抗菌肽的临床及流行病学意义。Ｈｐ( 2 2 0 )按ＨｐＲｐＬ1Ｎ 端第 2至第2 0位多肽序列人工合成。采用琼脂扩散法检测Ｈｐ( 2 2 0 )对消化道常见致病菌的抗菌…     

血管平滑肌细胞增殖与迁移的机制研究

目的 :血管平滑肌细胞 (ＶＳＭＣｓ)增殖与迁移在动脉粥样硬化 (ＡＳ)的早期、中期或ＡＳ进展期或血管事件的发病机制中起着关键性作用。方法 :采用改良的Ｂｏｙｄｅｎ小室法检测ＶＳＭＣｓ的迁移效应 ;以ＭＴＴ法、[3Ｈ]-Ｔｄｒ掺入法、[3Ｈ]-脯氨酸标记法和ＶＳＭＣｓ计数评价ＶＳＭＣｓ的增殖效应 ;将培养的ＶＳＭＣｓ分为 5组 ;2 %胎牛血清 ( 2 %ＦＣＳ)组、ＡｎｇⅡ组 (其浓度为 1 0 - 1 0 ～ 1 0 - 6ｍｏｌ/Ｌ)、Ｌｏｓａｒｔａｎ组 (其浓度为 1 0 - 7～ 1 0 - 5ｍｏｌ/Ｌ)、ＭＣＰ - 1ｍｃＡｂ组 (终浓度为 1 0 μｇ/ｍＬ)和阳性对照…     

合成多肽体外诱导乙肝病毒抗原特异性CTL杀伤机制研究

为探讨合成多肽体外诱导乙肝病毒抗原特异性Ｔ细胞杀伤机制，应用免疫组化检测ＨＧＶ－ＣＴＬｓＦａｓ配体表达情况，燕分析培养上清一氧化氮含量与细胞毒活性的关系。结果显示，ＨＢＶ－ＣＴＬｓ对转染ＨＢＶ ＤＮＡ的肝癌细胞存在明显的特异性细胞毒活性，其Ｆａｓ配体表达阳性率分别为５８％，５６％，明显高于ＣＤ３－ＡＫ细胞组，细胞培养上清ＮＯ含量动态分析显示，ＨＢＶ－ＣＴＬｓ细胞培养上清ＮＯ含量与细胞毒活性存在正相