肼化辣根过氧化物酶糖蛋白染色法

探索一种简便灵敏的糖蛋白半定量法。在ｐＨ５．０，碳二亚胺催化下，辣根过氧化物酶与己二酰二肼反应成肼化的ＨＲＰＨＲＰ－ＨＺ），固相于硝酸纤维素膜上的糖蛋白经过碘酸氧化其糖链中的糖基后生成的醛基可与ＨＲＰ－ＨＺ缩合，用ＨＲＰ的发色底物显色即可检出糖蛋白的存在与否。     

胆管癌胆汁糖蛋白及其糖链结构的初步研究

目的 寻找对胆管癌具有诊断价值的特异性标志物。方法 应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析４１例恶性胆道病变（胆管癌２７例、胆囊癌９例、壶腹癌５例）和２０例良性胆道病变病人胆管胆法中蛋白成分的差异。应用糖蛋白定性试验分析差异蛋白是否为糖蛋白。采用制备好的ＨＲＰ标记凝集素探针（ＤＳＡ－ＨＲＰ、ＷＧＡ－ＨＲＰ、ＬＣＡ－ＨＲＰ、ＣｏｎＡ－ＨＲＰ）对分离出的差异糖蛋白的糖链结构进行初步分析。结果 胆管癌胆汁中存在４种差     

人皮肤成纤维细胞纤连蛋白的纯化及其N-糖链结构

研究人皮肤成纤维细胞纤连蛋白及其片段 Ｎ－糖链结构。用明胶－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和柱纯化培养的人皮肤成纤维细胞所分泌的纤连蛋白（Ｆｎ），用胰糜蛋白酶限制性水解，获得明胶结合片段和肝素结合片段；用肼化的凝集素与经过碘酸氧化后的辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）缩合的方法制备 ４种 ＨＲＰ－凝集素（Ｃｏｎ Ａ， ＤＳＡ，ＷＧＡ，ＬＣＡ）探针，用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法检测明胶结合片段（Ｍｒ４３ × １０３）、肝素结合片段（Ｍｒ３０ ×１０３，２５ ×ｌ０３）在切除唾液酸及平分型 Ｎ－乙酰氨基葡萄糖（ＧＩｃＮＡｃ）前后的 Ｎ－糖链结构。结果： Ｆｎ的 Ｎ－糖链主要存在于 Ｍｒ分别为４３ × １０３、３０ ×１０３、２５ ×１０３的３个片段上，其结构为二、三（主要是Ｃ２Ｃ２６）或四天线的复杂型糖链；糖链末端连有唾液酸（ＳＡ）；都含有核心岩藻糖（ｃ－Ｆｕｃ；平分型 ＧｌｃＮＡｃ只存在于 ４３ × １０３片段所连的糖链中，而且很可能与 Ｃ—Ｆｕｃ共同存在于二天线或Ｃ２Ｃ２６三天线精链上；Ｆｎ的糖链中不含有Ｎ－乙酰乳糖胺重复顺序。结论：在Ｆｎ不同片段上均含有复杂型Ｎ糖链，并存在核心岩藻糖结构，平分型ＧｌｃＮＡｃ只存在于４３ ×１０３片段上。     

视网膜色素上皮细胞吞噬机理的研究

用富含甘露糖的糖蛋白（ＨＲＰ）作吞噬刺激物，Ｄ－甘露糖作抑制剂测定Ｗｉｓｔａｒ大鼠ＲＰＥ细胞内摄入的ＨＲＰ吞噬体的数量及其含量。结果表明ＲＰＥ细胞内ＨＲＰ吞噬体数量在３０分钟内迅速增加，其含量在４小时内呈稳定持续增加；加入１０ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｄ－甘露糖对其有明显抑制作用，提示ＲＰＥ细胞摄入ＨＲＰ主要是由特异性甘露糖受体所介导。     

6-[N-(4-氨基丁基)-N-乙基]氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮的合成

目的：建立一种合成化学发光标记试剂6－[N－（4－氨基丁基）－N－乙基]氨基－2，3－二氢－1，4－酞嗪二酮（ABEI）的简便，经济的新方法。方法：室温下用KOH将邻苯二甲酰亚胺转化为邻苯二甲酰亚胺钾盐，并进一步进行甲基化，硝化和还原反应，得到N－甲基－4－氨基邻苯二甲酰亚胺，N－（4－溴丁基）邻苯二甲酰亚胺与N－甲基－4－氨基邻苯二甲酰亚胺缩合之后，通过乙基化和肼解的反应得到目的的产物ABEI。结果：按起始原料计算，ABEI的总收率为4．4％，经熔点、核磁、质谱、红外，元素分析等方法鉴定，各中间体及目的产物均与其分子结构相符。结论：起始原料价廉易得，反应步骤操作简便，有利于降低反应成本。     

抗独特型抑制法测定可溶性IL一2受体的实验研究

本研究用抗独特型抑制法测定可溶性ＩＬ一２受体（ｓＩＬ一２Ｒ）。主要步骤为：以抗ＩＬ一２Ｒａ单抗５Ｇ１包被，加入ｓＩＬ一２Ｒ及针对包被单抗的抗独特型酶标抗体ＨＲＰ一２Ｇ３。ｓＩＬ一２Ｒ与ＨＲＰ一２Ｇ３竞争结合包被单抗，其含量与显色ＯＤ值成反比。本法简便，灵敏，特异性好，可望用于基础及临床研究。     

抗独特型抑制法测定可溶性IL—2受体的实验研究

本研究用抗独特型抑制法测定可溶性ＩＬ－２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）。主要步骤为：以抗ＩＬ－２Ｒα单抗５Ｇ１包被，加入ｓＩＬ－２Ｒ及针对包被单抗的抗独特型酶标抗体ＨＲＰ－２Ｇ３。ｓＩＬ－２Ｒ与ＨＲＰ－２Ｇ３竞争结合包被单抗，其含量与显色ＯＤ值成反比。本法简便，灵敏，特异性好，可望用于基础及临床研究。     

恶性肿瘤患者外周血细胞P-糖蛋白表达与肿瘤多药耐药相关性研究

目的：本研究通过外周血单个核细胞（PBMC）、CD4 、CD8 细胞P-糖蛋白的表达与肿瘤组织P-糖蛋白表达的相关性研究以及PBMC、CD4 、CD8 细胞P-糖蛋白在化疗过程中的动态变化的观察，寻找动态诊断MDR的新途径。方法：本组共51例肿瘤病人，23例采用免疫组化检测PBMC及肿瘤组织的P-糖蛋白，28例用流式细胞术测定PBMC、CD4 、CD8 细胞P-糖蛋白，用免疫组化测定相应的肿瘤组织的P-糖蛋白。结果：①肿瘤患者PBMC、CD4 、CD8 细胞P-糖蛋白表达较正常人高（P＜ 0.05）。②PBMC、CD4 、CD8 细胞P-糖蛋白表达水平与肿瘤组织P-糖蛋白呈显著的相关性（r =0.419, P<0.05）；③PBMC、CD4 P-糖蛋白化疗后较化疗前显著增加，可通过PBMC、CD4 P-糖蛋白的变化动态反映肿瘤细胞的变化。④用FCM检测PBMC P-糖蛋白与IC法比较，FCM方法简单，精确度高，更适合血细胞的检测。结论：PBMC、CD4 、CD8 P-糖蛋白含量与肿瘤P-糖蛋白表达有明显相关性。通过PBMC、CD4 、CD8 P-糖蛋白的检测，为临床判断肿瘤耐药提供了一条简便的途径。     

P-170糖蛋白在多药耐药(MDR)K562/ADM细胞中的定位研究

目的：确定P-170糖蛋白在多药耐药（MDR）K562/ADM细胞中表达的位置，方法：通过免疫反应并利用流式细胞仪（FCM）检测表达P-170糖蛋白细胞的百分含量；用免疫电镜技术检测P-170糖蛋白在细胞中的位置及其表达水平。结果：敏感株K562细胞与耐药株K562/ADM细胞对P-170糖蛋白的表达有非常明显的差异；不同的K562/ADM细胞表达P-170糖蛋白的量差别较大；少量的K562细胞也有极少的P-170糖蛋白的表达，细胞表达的P-170糖蛋白位于细胞膜上，结论：多药耐药K562/ADM细胞表达的P-170糖蛋白最终被镶嵌在细胞膜上；在该蛋白质从被表达，修饰和转运到细胞膜上的过程中，该蛋白质不具有成熟P-170糖蛋白的特异构象。     

糖肾复元汤治疗糖尿病肾病临床研究

目的：观察糖肾复元汤治疗糖尿病肾病（DN）的疗效。方法：将120例DN患者分为治疗组85例，对照组35例。两组均常规应用洛汀新10mg／d，根据病情使用胰岛素或格列喹酮（糖适平）、二甲双胍控制血糖。治疗组在此基础上加用糖肾复元汤口服。疗程为8周。观察治疗前后空腹血糖（FPG），餐后2h血糖（PG），血尿素氮（BUN）、肌酐（Scr），24h尿蛋白定量（Uprot），尿微量白蛋白排泄率（UAER）的变化。结果：治疗组总有效率显著优于对照组（P〈0．01）：同时能明显减少Uprot，Scr，BUN，UAER水平，两组比较P〈0．05或P〈0．01。结论：糖肾复元汤治疗DN疗效显著．中西医结合治疗DN优于单用西药治疗。     

免疫印迹法检测信号蛋白的三种显示系统比较

目的:对比、分析用于检测信号蛋白的三种免疫印迹显示系统的敏感性.方法:用不同的免疫印迹显示系统检测Jurkat细胞中ZAP-70分子.结果:采用辣根过氧化物酶(HRP)-增强发光显示系统较HRP-双底物系统及碱性磷酸酶(AP)-双底物系统至少敏感50倍.结论:HRP-增强化学发光免疫印迹是一种较敏感的检测系统.     

HRP标记DNA探针的制备及杂交条件探讨

目的：用辣根过氧化物酶(HRP)直接标记DNA探针,并对其斑点杂交条件进行探讨。方法：以对苯醌(PBQ)氧化HRP使其产生活化位点,并与聚乙烯亚胺PEI缩合形成HRP-PBQ-PEI复合物,再以戊二醛连接DNA,共价结合构建直接酶标探针进行斑点杂交,利用HRP可与底物发生颜色反应的特点观察结果,并对不同杂交条件进行研究。结果：成功构建了HRP标记的DNA探针,并进行了斑点杂交反应,归纳出较好的杂交条件。结论：直接酶标DNA探针有较高的特异性及敏感性,操作简便快速,经济可行。     

丁型肝炎抗体诊断试剂的研制

取乙型肝炎患者Delta抗体(抗—HD)阳性血清,经硫酸铵盐析和DE—52柱层析,得到纯化的抗—HD抗体,用辣根过氧化物酶标记。用丁型肝炎病毒(HDV)感染慢性携带土拨鼠肝炎病毒的东方土拨鼠(Woodchuck)后,取其肝组织制成匀浆,离心后经Sepharose 4B柱,免疫亲和层析柱,获得高丰度的HDAg。双抗体夹心法测定其滴度高达1∶10~6。制备成ELISA竞争抑制法检测抗HD试剂盒,其特异性、敏感性、重复性与爱尔兰同种试剂比较结果一致。     

肿瘤相关寡糖分子纯化及检测意义

用亲和层析法纯化出胃癌组织ConA识别的糖蛋白,经SDS-PAGE鉴定及检测活性后,用辣根过氧化物酶进行标记,建立了一种新的ELISA结合抑制寡糖分析方法。经351例肿瘤患者,126例良性疾病患者和100例正常人血清检测证实:肿瘤患者血清中ConA识别的寡糖分子水平增高。11种肿瘤检测平均阳性率为52.1％(185/351);诊断符合率为61.8％。提示肿癌相关寡糖的研究对于寻找新的肿瘤相关抗原和血清诊断有一定帮助。     

胶体金层析法检测恶性疟原虫HRPII抗原的应用研究

目的 :建立一种简易快速 ,适于基层或流行病学调查的自测式胶体金免疫层析法 (GICA)用于检测恶性疟原虫中 H RPII抗原 ,判定是否现症感染。方法 :用 GICA测试条检测全血及滤纸血样中的 H RPII抗原。结果 :40例恶性疟全血及滤纸血 H RPII抗原阳性检出率均为 1 0 0 ,与镜检结果相符合 ;2 5例间日疟均为阴性。结论 :GICA检测血中恶性疟原虫 H RPII抗原特异性强、灵敏度高、简便快速 ,无需特殊仪器设备 ,滤纸血的应用使样本的采集、保存和运输更为便利 ,适合大规模流行病学调查和基层使用 ,有广泛应用价值。     

双抗体夹心酶联免疫法检测不同样品中的蓖麻毒素

目的 应用酶联免疫吸附分析方法（ELISA）检测待测样品中的蓖麻毒素。方法 用蛋白 G亲和层析柱纯化蓖麻毒素单克隆抗体（4C13,3D74,5E4和5H6）,以3D74及辣根过氧化物酶(HRP)标记的4C13建立的双抗体夹心ELISA对含有蓖麻毒素的多种样品进行检测。结果 抗蓖麻毒素的单克隆抗体经亲和层析纯化后具有较高的蛋白纯度,应用HRP标记的4C13与3D74建立双抗体夹心ELISA,对于溶解于磷酸缓冲液中的蓖麻毒素标准品的检测灵敏度可达2.5 μg·L^-1;对于土壤、面粉、牛奶、咸菜汁、雪碧、可乐和腐乳汁中的蓖麻毒素样品检测的灵敏度为2.5～5.0 μg·L^-1;与磷酸缓冲液样品相比较,含有相同浓度蓖麻毒素的小鼠和人血清样品ELISA的阳性结果明显减弱。结论 双抗体夹心酶联免疫法能够有效用于含有蓖麻毒素样品的检测分析。     

结核分枝杆菌低氧反应蛋白HRP1（Rv2626c）的分泌致病机制初探

  目的  验证结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）基因Rv2626c编码的低氧反应蛋白1（hypoxic response protein 1, HRP1）为分泌蛋白。  方法  从Mtb H37Rv标准毒力株基因组上扩增目的基因并添加His标签;运用扩增产物构建重组质粒,电转入耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis, Ms）（MC2 155）构建重组菌;热诱导重组菌表达蛋白,检测培养滤液及细菌裂解液中蛋白的表达情况,将10 kDa培养滤液抗原（CFP-10）（Ms）和CFP-10（Mtb）设为阳性对照,将胞质蛋白热休克蛋白65（GroEL2）（Mtb）作为阴性对照。  结果  PCR成功扩增 HRP1 、GroEL2（Mtb）、CFP-10（Mtb）、CFP-10（Ms）,并且重组质粒测序峰单一且信号稳定,鉴定重组质粒构建成功。成功构建重组Ms并实现蛋白GroEL2（Mtb）、CFP-10（Mtb）、CFP-10（Ms）、HRP1在Ms中的表达。在重组菌裂解液中和培养基滤液中均检测到目标蛋白HRP1;结果与阳性对照CFP-10一致;阴性对照GroEL2（Mtb）仅在细菌裂解液中检测到,在培养滤液在未检测到。  结论  Mtb基因Rv2626c编码的蛋白HRP1可以通过Ms的分泌系统分泌到细菌外,作为Mtb分泌蛋白,在Mtb致病机制中发挥作用。     

应用FITC系统建立非均衡竞争游离三碘甲腺原氨酸（FT3）化学发光法

目的制备抗人T3多克隆抗体,应用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanat,FITC)系统开发新型非均衡竞争技术,建立一种能广泛应用于临床检测游离三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)的方法。方法以T3-牛血清白蛋白(bovin serum albumin,BSA)为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗人T3多克隆抗体,亲和层析法纯化并联接辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)。用FITC标记T3-类似物。采用抗FITC抗体包被发光板,FITC-T3类似物与抗FITC抗体结合形成固相抗原,通过非均衡竞争法原理,固相抗原与血清中FT3竞争结合抗T3抗体-HRP,通过标准曲线计算FT3浓度,建立方法学评价并与直接用T3-牛血清γ球蛋白(Bovine serum gamma globulin,BGG)包被(非FITC系统)的检测系统相比较。将本方法应用于临床120份血清标本的检测,定量结果与德国罗氏2010电化学发光全自动免疫分析系统(Elec-sys 2010)定量结果进行比较。结果抗体经酶联免疫吸附实验证明对T3、具有高度特异性。应用FITC系统建立的非均衡竞争化学发光免疫分析标准曲线的线性R>0.99,线性范围0.25～50 pg/ml,分析灵敏度为0.25 pg/ml,精密度测试批内、批间变异系数CV<5%,检测结果优于非FITC系统的检测。对于临床血清标本的检测,其定量结果与德国Elecsys2010定量试剂盒的定量结果具有很好的相关性,相关系数r=0.962 2,两者的测定值无显著性差异。结论制备的抗人T3多克隆抗体特异性强,以FITC系统为平台建立的非均衡竞争FT3检测化学发光法具有精密性好、灵敏度高、稳定性强,有良好的准确性,达到临床测定的需求,可代替进口化学发光产品用于临床样本的检测。     

大鼠延髓腹外侧区向伏核投射的定性定位的研究

应用HRP顺、逆行追踪结合免疫细胞化学双重标记等方法对大鼠延髓腹外侧区(VLM)向伏核(Acb)的投射进行了研究。主要结果如下:1.将HRP注射到Acb尾侧的腹、内侧区,结果在VLM尾段出现大量的标记细胞和终末,以同侧为主。2.HRP注射Acb并结合免疫细胞化学反应,在VLM尾侧发现HRP/TH、HRP/NT、HRP/CCK样双标细胞。3.根据以上结果本文得出如下结论:VLM有纤维投射到Acb,有的纤维含有TH、NT、CCK样活性物质。     

CEM／ADM多耐药细胞株的P170－糖蛋白的表达

本文利用免疫荧光法对肿瘤细胞ＣＥＭ，ＣＥＭ／ＡＤＭＰ１７０－糖蛋白进行了检测，结果显示：敏感细胞全部为阴性，而耐药细胞株Ｐ１７０－糖蛋白呈过度表达，其过度表达细胞数随肿瘤细胞对抗癌药物耐受性增强而增加，其中ＣＥＭ／ＡＤＭ多耐药细胞株的Ｐ１７０－糖蛋白过度表达细胞为９２％。