SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测BMI-1 mRNA方法的建立

目的 建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人类BMI-1 mRNA的方法。方法 以含有目的基因BMI-1 cDNA的质粒pEGFP-BMI-1为阳性模板,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测BMI-1,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性。结果 该法检测的线性范围为6.4×10^1～6.4×10^7拷贝,相关系数r为-1.00,6.4×10^3拷贝/反应的标本批内变异系数（CV）和日间CV分别为1.6%和2.8%。熔解曲线分析显示单一的峰,Tm为（80.40±0.18）℃。结论 SYBR Green I实时荧光PCR定量检测BMI-1 mRNA是快速有效、灵敏度高、特异性好的方法,可为BMI-1的进一步研究奠定基础。     

人类SUZ12基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人类SUZ12基因的方法.方法:将SUZ12 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测SUZ12,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为14.2,线性范围为1.42×10~1-1.42×10~8拷贝,相关系数r为-1.00,1.42×10~7拷贝/L标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.8%和2.8%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(melting temperature,Tm)为(81.37±0.16)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测SUZ12基因,快速有效、灵敏度高、特异性好.     

实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法.方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为10,线性范围为101～108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法.     

犬库布病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立可检测狐狸物种中犬库布病毒(CaKoV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。方法利用PCR方法扩增狐狸CaKoV的3D基因504bp,将其克隆到pEASY-Blunt载体,构建重组质粒作为阳性质粒,以其为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,验证其灵敏度、特异性和重复性。结果建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法检测目的基因在6.12×10^(1)~6.12×10^(8)拷贝/μl时呈良好的线性关系,相关系数为0.994,斜率为-4.369,灵敏度6.12×10^(1)拷贝/μl。该方法对于CPV、CDV和CCV未出现特异性扩增。所有标准曲线在溶解温度为86.49℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测2021年辽宁、山东地区的253份狐狸临床标本,总阳性率为7.91%。结论建立的CaKoV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异,用于狐狸CaKoV感染的快速检测。     

SYBR GreenⅠ实时PCR检测甲型H1N1与季节性流感病毒方法的建立

目的：建立一种检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法。方法：设计针对甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒HA基因的引物,分别进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应,同时进行熔解曲线和Tm值分析,并作灵敏度和重复性试验。 结果：结果表明该方法与H5、H7、H9亚型流感病毒及副流感病毒1、2、3型均无交叉反应。构建的荧光定量标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为：95.588%,检测灵敏度为101copies/反应体系,结果重现性好。成功地验证性检验了32份盲样标本。结论：本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法敏感、不需荧光标记探针、成本低及高通量,能用于人类流感病毒的分型检测。     

人POT1基因实时荧光PCR相对定量法的建立

目的：建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人POT1基因的方法。方法：依据人POT1基因及参照基因TBP基因序列设计引物，以人类乳腺癌细胞系MCF-7总RNA逆转录合成的cDNA为模版，以TBP基因为参照基因，应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测POT1基因的表达。结果：POT1和TBP基因熔解曲线为单峰，无杂峰及二聚体。POT1基因及参照基因TBP基因扩增效率相同（直线斜率0．0171〈0．1）。POT1基因批内变异与批间变异分别为1.3％和2.1％；TBP基因批内变异与批间变异分别为1．2％和2．6％。结论：建立了SYBR Green Ⅰ实时定量检测人类POT1基因的方法，该方法简单快速，经济，灵敏度高，特异性和重复性好，可用于人类POT1基因的定量分析。     

猪圆环病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

目的建立针对PCV3的操作简单、重复性好、灵敏度较高的检测方法。方法利用PCR方法扩增PCV3保守区基因片段(312bp),将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-PCV3作为阳性标准品质粒。优化反应条件,建立定量检测PCV3的实时荧光定量PCR方法,并进行敏感性、特异性和重复性验证。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法的Ct值与标准品模板在4.24×10~1~4.24×10~8拷贝/μl范围内呈良好线性关系,其相关系数为0.996,斜率为-4.384。该方法特异性强,与PRRSV、FMDV、JEV、PCV2及PRV均无交叉反应;敏感性为4.24×10~1拷贝/μl,比常规PCR方法高10倍;组间和组内重复试验的变异系数均小于2%。利用实时荧光定量PCR方法对采集的155份猪肺组织进行检测,阳性率为36.13%,高于普通PCR阳性检出率的32.25%。结论建立的PCV3SYBR GreenⅠReal-time PCR方法敏感、特异,可用于猪体PCV3感染的快速检测。     

SYBRGreenⅠ染料法定量PCR用于人体疟原虫定量检测及虫种鉴别的研究

目的 建立一种可用于疟原虫检测并同时鉴别虫种的荧光定量PCR方法.方法 根据人体疟原虫18SrRNA基因序列特征,在疟原虫种特异性区域两侧的属特异性保守区设计引物,对4种人体疟原虫进行PCR扩增,将得到的扩增产物采用TA克隆法插入pGEM-T载体制备标准质粒,用于制备标准曲线进行定量分析,并进行熔解曲线分析,测定各虫种扩增产物的熔解温度.结果 4种人体疟原虫均能扩增得到特异性片断,荧光定量PCR方法中建立的标准曲线相关关系较好(相关系数r =-1.00),熔解曲线分析结果显示,4种人体疟原虫的熔解温度相差较大,分别为三日疟原虫71.3℃、恶性疟原虫72.8℃、卵形疟原虫74.6℃和间日疟原虫75.8℃.结论 建立的SYBR Green Ⅰ染料法荧光定量PCR技术可同时进行人体疟原虫的定量检测和虫种鉴别.     

KLK4 mRNA实时荧光定量检测方法研究

应用SYBR Green I作荧光染料，利用磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作内对照，建立KLK4mRNA的实时荧光定量（FQ—PCR）检测方法。结果建立的FQ—PCR方法扩增GAPDH和KLK4mRNA的效率分别为0．98和0．96；检测GAPDH和KLK4的批内变异系数（CV）分别为0．8％和1．6％，批间CV分别为3．9oA和2．4％；基因扩增产物DNA序列分析及熔解曲线分析表明该方法特异可靠。认为本研究建立的FQ—PCR检测方法简便、特异、重复性好、可信度高，可为KLK4基因表达水平的研究提供基础。     

鹦鹉热嗜衣原体实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种简便、快速、特异的荧光定量PCR检测方法,用于鹦鹉热嗜衣原体的快速检测。方法以主要外膜蛋白(MOMP)基因为靶序列设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ随机渗入法建立实时定量PCR检测方法。结果循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102-1.0×107拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.989。该方法用于鹦鹉热嗜衣原体的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍。结论本研究建立的检测鹦鹉热嗜衣原体的实时定量PCR检测方法具有很高的特异性和敏感性,可以用于鹦鹉热嗜衣原体的检测。     

猪嵴病毒 SYBRⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究根据GenBank中登录猪嵴病毒（porcine kobuvirus,PKV）株的3D蛋白序列基因特征,设计特异性引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测PKV的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法检测PKV 3D蛋白在6.42×102 ~ 6.42×108拷贝/反应范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%,扩增产物的融解曲线分析只出现1个单特异峰,融解温度为（84.94±0.24）℃,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,特异性强。所建立实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.26%~1.14%,组间变异系数0.63%~1.79%,重复性好。本方法的建立为PKV的早期诊断及定量分析PKV感染程度和靶器官提供新的检测方法。     

实时荧光定量RT-PCR检测白血病细胞中BMI-1 mRNA的表达及其意义

目的：建立SYBR GreenI实时定量RT—PCR方法检测白血病细胞中BMI-1mRNA的表达并探讨其临床意义。方法：在TRIzol提取总RNA后,将mRNA逆转录成cDNA,再用SYBRGreenI实时定量PCR方法检测BMI—1 mRNA在白血病细胞系（K562、HL-60、Daudi、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1）、56例AML初治患者的骨髓ACDA抗凝标本和30例健康体检者的外周血EDTA抗凝标本以及6例细胞形态学正常的骨髓ACDA抗凝标本中的表达,扩增产物的特异性通过熔解曲线和凝胶电泳双重确认,以ABL为内参照,采用2^-ΔΔct法计算其相对表达量。结果：①BMI-1 mRNA在白血病细胞系（K562、HL-60、Daudi、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1）均存在表达,其中U937表达最高,而HL-60表达最低。②与对照组相比,BMI-1 mRNA在白血病细胞中的表达显著升高（P〈0．01）。结论：①SYBRGreenI实时RT-PCR是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测BMI-1mRNA的方法。②BMI-1参与白血病的发生,可能是一种新的肿瘤分子标记物。     

基于SYBR Green检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR方法的建立及应用

目的建立一种方便快捷的检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法。方法根据GenBank公布的微小隐孢子虫18s rRNA基因序列设计1对引物,通过质粒DNA和卵囊检测标准曲线的绘制及特异性和重复性的研究,建立检测微小隐孢子虫的基于SYBR Green的Real-time PCR方法,进而对奶牛粪便进行检测。结果建立的Real-time PCR法对检测微小隐孢子虫具有很高的特异性,质粒DNA和卵囊的检测阈值分别达到1个拷贝和10个卵囊,奶牛粪便阳性率为25.93%（21/81）,高于普通PCR检测率20.99%（17/80）。结论建立的Real-timePCR方法简便、快速,特异性强,敏感度高,可用于微小隐孢子虫的快速定量检测。     

基因Ⅲ型乙型脑炎病毒Real-time PCR检测方法的建立及应用

目的建立针对云南地区流行的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒株Real-time PCR检测方法。方法根据云南地区分离株乙型脑炎病毒株(Yunnan0901)基因组核苷酸序列设计特异性引物,构建pMD18-T-JEV-E质粒,以此为模板进行SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增并制作标准曲线,摸索最佳反应体系条件,建立乙型脑炎病毒荧光定量PCR检测方法,并与普通RT-PCR方法相比较。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。与RT-PCR方法相比,SYBR GreenⅠReal-time PCR的灵敏度高10倍,而且不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒核酸发生非特异性扩增,具有良好的特异性。用该方法检测云南部分地区的蚊虫样品,其中库蚊、按蚊乙型脑炎病毒阳性率分别为17.4%和30.7%,且主要为基因型Ⅲ型。结论本实验建立的检测基因Ⅲ型乙型脑炎病毒的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等特点,可应用于乙型脑炎疫情的监测。     

基因Ⅲ型乙型脑炎病毒Real-time PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立针对云南地区流行的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒株Real-time PCR检测方法。方法根据云南地区分离株乙型脑炎病毒株(Yunnan0901)基因组核苷酸序列设计特异性引物,构建pMD18-T-JEV-E质粒,以此为模板进行SYBR GreenⅠReal-time PCR扩增并制作标准曲线,摸索最佳反应体系条件,建立乙型脑炎病毒荧光定量PCR检测方法,并与普通RT-PCR方法相比较。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线呈现良好的重复性和特异性,与模板浓度呈现良好的线性关系。与RT-PCR方法相比,SYBR GreenⅠReal-time PCR的灵敏度高10倍,而且不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒核酸发生非特异性扩增,具有良好的特异性。用该方法检测云南部分地区的蚊虫样品,其中库蚊、按蚊乙型脑炎病毒阳性率分别为17.4%和30.7%,且主要为基因型Ⅲ型。结论本实验建立的检测基因Ⅲ型乙型脑炎病毒的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等特点,可应用于乙型脑炎疫情的监测。     

应用SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR法对中国汉族人群HLA-B27进行快速基因分型

目的：建立一种快速、灵敏的实时荧光聚合酶链反应（PCR）对中国汉族人群的人白细胞抗原B27（HLA-B27）进行基因分型。方法：采用SYBR GreenⅠ荧光PCR法对120例已定型的标本、230例健康志愿者、54例类风湿因子（RF）阳性患者和36例抗核抗体（ANA）阳性患者的HLA-B27 DNA进行实时检测，并采用熔解曲线对HLA-B27进行基因分型。结果：①熔解曲线分析显示，伊珠蛋白PCR产物的Tm平均值为87．82℃，HLA-B27 PCR产物的Tm平均值为90．54℃，HLA-B27阴性标本仅在87．82℃处存在β-珠蛋白的熔解曲线峰，而阳性标本则于87．82℃和90．54℃处出现两个熔解曲线峰，且△Tm约为2．72℃；②对120个已定型的标本，SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR法与传统的PCR—SSP（序列特异性引物）结果完全吻合；③健康志愿者、RF阳性患者和ANA阳性患者HLA-B27 DNA阳性率分别为2．6%（6／230）、3．7％（2／54）和5．6％（2／36）。结论：SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR法是一种快速、灵敏的HLA-B27基因分型方法，具有传统的PCR所不可比拟的优点，可取代传统的PCR法用于中国汉族人群的HLA-B27的基因分型，辅助强直性脊柱炎等脊柱关节病的诊断。     

应用SYBR GreenⅠ荧光聚合酶链反应检测人类白细胞抗原-B27

目的 采用SYBR GreenⅠ荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测人类白细胞抗原一B27(HLA-B27)。方法 对56例风湿科门诊及住院怀疑为强直性脊柱炎(AS)的患者，以HLA-B27的特异引物和内对照β-Globin引物对标本DNA分别进行常规PCR和SYBRGreen Ⅰ荧光PCR检测，并对HLA-B27阳性DNA进行不同倍数稀释后用两种方法进行检测比较。结果 常规PCR检测HLA-B27阳性的样本上具有136bp的条带，所有的阴性和阳性样本都有268bp的β-Globin条带，共有30例患者HLA-B27阳性。SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测结果显示，阴性标本的熔解曲线图上(86．3 0．5)℃处有B-Globin的Tm峰．HLA-B27阳性的样本在熔解曲线上有(90．2 0．6)℃HLA-B27的Tm峰。两种方法结果符合率达100％。即使1：100稀释的。DNA也可用SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测出结果，而常规PCR只有用原倍DNA才能检测出结果。结论 SYBR Green Ⅰ荧光：PCR法快速、准确、敏感、实时、简单和环保的特点是常规PCR法所没有的，完全能够替代常规PCR法，成为检测HLA-B27的新手段。     

染料法实时荧光聚合酶链反应检测人外周血αβT淋巴细胞克隆的条件优化及初步应用

目的 探讨实时荧光PCR检测人外周血αβT淋巴细胞克隆性扩增的反应条件及在监测慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者外周血克隆特异性T淋巴细胞上的初步应用.方法 染料法(SYBR Green Ⅰ)实时荧光PCR对6例健康献血者外周血单个核细胞(PBMC)来源的T淋巴细胞受体β链可变区(TCRBV)基因进行扩增,分别就退火温度、引物浓度、循环数等进行比较研究.优化后PCR检测12例慢乙肝患者PBMC来源的TCRBV的24个基因家族,作PCR产物的熔解曲线峰形图,并分析T淋巴细胞克隆性扩增情况.结果 染料法实时荧光PCR检测 TCRBV基因家族的最佳退火温度为60.6℃,引物终浓度为0.5 μmol/L,循环数为40个,且熔解曲线分析起始温度80℃优于75℃.PCR产物熔解曲线峰形图上发现,慢乙肝患者某些TCRBV基因家族表现为单峰,测序结果表明其为单克隆PCR产物.结论 本研究优化了染料法实时荧光PCR检测TCRBV基因家族方法,熔解曲线峰形图可用于检测人外周血T淋巴细胞的克隆性扩增,并可能用于检测慢乙肝患者外周血克隆特异性T淋巴细胞.     

猪逆转录病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的开发一种能够准确、灵敏、特异检测猪逆转录病毒(PERV)的荧光定量PCR方法。方法根据GenBank数据库中PERV Gag基因的高度保守序列,设计1对特异性引物,建立用于检测PERV的SYBR GreenⅠqPCR检测方法,并验证其灵敏性、重复性和特异性。结果建立的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.998。该方法检测PERV下限为2.04×10^(2)copies/μl,批内批间变异程度较低,变异系数小于2%,且与PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV和SVA等均无交叉反应。利用该qPCR方法对采集的49份猪组织样品进行检测,阳性率为81.63%,高于普通PCR阳性检出率的73.47%。结论建立的快速、定量检测PERV的SYBR Green I qPCR方法敏感、特异,具有一定的应用前景。     

登革Ⅱ型病毒SYBR GreenⅠqRT-PCR方法的建立

目的建立敏感、特异、快速的检测登革Ⅱ型病毒(DENV-2)SYBR GreenⅠqRT-PCR方法。方法根据GenBank上发表的DENV-2株核苷酸序列,应用Primer Express 3.0软件在保守区设计特异性引物,优化SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件,利用Sanger测序验证该方法的特异性和敏感性。结果该方法与其他血清型登革病毒、流感病毒等均无交叉反应,最低检出20个病毒拷贝/μl RNA。检测14份已知阳性和阴性血清,结果与预期一致。结论本研究建立的DENV-2 SYBR GreenⅠqRT-PCR特异性强、敏感性高,可用于输入性DENV-2早期感染诊断。