人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况。结果PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank序列号NM_000209)序列一致。证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中。Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达。结论成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达。     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致。重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体。     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的 构建人PCK1基因的真核表达载体.方法 以人内脏脂肪细胞cDNA为模板, 聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定.结果 PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致.重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和 2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+) 中.结论 成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体.     

人UROC28基因真核表达载体的构建

目的:构建人UROC28基因的真核表达载体,观察其在HEK293细胞中的表达。方法:以PUC-19-UROC28质粒为模板,扩增UROC28基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3中,酶切鉴定目的基因。重组质粒用脂质体转染HEK293细胞,Western blot观察基因表达情况。结果:PCR扩增的特异性片段长度为430bp,以此构建的重组质粒pcDNA3-UROC28,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5.4kb和430bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人UROC28cds序列一致。证明UROC28因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcD-NA3中。Western blot证实pcDNA3-UROC28转染HEK293细胞24 h后有UROC28的表达。结论:成功构建了pcD-NA3-UROC28重组真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。     

嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建嗜肺军团菌主要免疫原基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip,并观察其在真核细胞中的表达.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip.经限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ip转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot分别鉴定pcDNA3.1-ip的瞬时和稳定表达.结果 成功构建了嗜肺军团菌ip基因的真核表达重组质粒.在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-ip成功转入NIH3T3细胞,并在NIH3T3细胞中得到了瞬时表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA3.1-ip稳定转染的NIH3T3细胞,在相对分子质量为29×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-ip在细胞内可稳定表达IP蛋白.结论 本研究构建的嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒pcDNA3.1-ip能够成功表达IP蛋白,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性.     

辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3（＋）-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示：UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

小鼠MME基因真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆小鼠巨噬细胞金属弹力酶(MME)基因结构域Ⅰ和Ⅱ,构建真核细胞表达载体,用于动物肿瘤原位种植模型的研究.方法通过PCR选择性扩增MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ,克隆入pGEM-T载体中,限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切及PCR鉴定.结果以MME cDNA为模板进行PCR扩增的特异性片段在750 bp和1 000 bp之间.以此构建的pGEM-T-MME克隆载体和表达载体, 经限制性内切酶酶切证实载体中带有MME目的基因片段; 与小鼠MME cDNA序列的碱基符合率为99.63%; 证明MME基因已正确克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中.结论成功构建了pcDNA3.1-MME重组质粒,奠定了转基因研究MME表达与肿瘤生长转移关系的实验基础.     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

大鼠干扰素诱导蛋白-10的体外表达和鉴定

目的 构建大鼠干扰素诱导蛋白-10(IP-10)真核表达载体,在NIH3T3细胞中表达重组载体pcDNA3.1(+)-IP-10,并对其表达产物进行鉴定.方法 通过PCR扩增IP-10基因片段,通过酶切和连接反应,构建IP-10的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,免疫荧光技术检测pcDNA3.1(+)-IP-10在NIH3T3细胞的表达情况.转染的Nm3T3细胞通过G418筛选出稳定表达的细胞克隆,Western Blotting鉴定IP-10蛋白在细胞培养上清的表达情况.结果 酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10基因被成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),免疫荧光技术检测证实重组载体可在NIH3T3细胞表达.Western Blotting结果显示细胞培养上清有IP-10蛋白表达.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,为进一步研究其对Th1型自身免疫性疾病的治疗效果奠定基础.     

增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记的原核表达栽体,并观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况.方法 据已知的EGFP基因序列,设计引物,并引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.采用PCR技术从含有EGFP的质粒pEGFP-C1中克隆EGFP编码序列;将其亚克隆入表达载体pTWIN1,得到以EGFP为标记的原核表达载体pTWIN-EGFP.转化大肠杆菌ER2566菌株,IPTG诱导EGFP基因表达.结果 经过IPTG诱导后,细菌培养物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光.结论 成功构建了原核表达载体pTWIN-EGFP,为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础.     

人Leptin的高效表达、纯化及生物学活性研究

将人Leptin表达质粒pBV200-OB转化宿主菌E.coli JM109,热诱导获得目的蛋白的表达.经SDS-PAGE鉴定分析,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上,且以包涵体的形式表达.通过包涵体分离,Sephacryl S200HR凝胶和DEAE52离子交换层析及Hypersil C18柱反相色谱纯化,获得纯度在95%以上,内毒素含量小于10EU/Mg的高纯度的重组人Leptin.Western-blot鉴定表明,纯化表达产物能和抗Leptin抗体特异结合;蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和预期的序列一致.纯化产物经复性处理,其分子中Cys96和Cys146形成二硫键.体内活性检测显示,纯化和复性的rh-Leptin明显抑制BALB/c小鼠的进食和体重增长,提示其具有明显的生物学活性.     

gp350胞外段基因表达载体的构建与表达

目的 构建gp350与C3d融合基因表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 以pGEX-gp350为模板,经PCR获得长846bp的gp350胞外段(25-870),将该扩增片段插入pSG.SS.C3d3.YL载体,构建pSG.SS.gp350.C3d3.YL表达质粒.经限制性内切酶鉴定和DNA序列测定证实后,将该质粒转染Hela细胞,检测其体外表达.结果 免疫细胞化学分析结果表明转染细胞有目的 分子的表达. 结论 构建的重组载体可在真核细胞内正确表达,这为基于gp350的鼻咽癌预防性疫苗下一步的动物实验奠定了基础.     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

hTEFT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。     

maspin/pEFIRES-N表达载体的构建及应用

目的构建maspin/pEFIRES-N表达载体,为深入研究maspin基因抑制肝癌生长、转移、浸润作用和机制奠定基础.方法 PCR扩增maspin基因全长,将表达载体pEFIRES-N用EcoRⅠ XbaⅠ进行双酶切后,T4DNA连接酶连接成重组质粒,稳定转染到肝癌高转移细胞株mHCC-97中进行表达,检测稳定转染前后maspin表达的变化.结果重组质粒在大肠杆菌株JM109内扩增.提纯、纯化后用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明maspin基因已完整、正确的插入到pEFIRES-N表达载体,并在肝癌MHCC-97细胞中上调了maspin基因mRNA和蛋白水平表达,抑制了肝癌MHCC-97细胞增殖及浸润.结论成功构建了maspin/pEFIRES-N表达载体,能在真核细胞中表达.     

凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体的构建及表达

目的:构建凋亡抑制蛋白Livin真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livin。方法:设计合成扩增Livinα和Livinβ基因全长cDNA序列的特异性PCR引物,以食管鳞状细胞癌EC9706细胞总RNA为模板,进行RT-PCR,将获得的cDNA序列克隆入T载体,再用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切,亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP,将重组质粒用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,G418筛选得到稳定表达的细胞克隆,Western-blot检测转染细胞Livinα和Livinβ蛋白的表达情况。结果:构建了真核表达载体pIRES2-AcGFP-Livinα和pIRES2-AcGFP-Livinβ,测序分析证实插入序列正确;转染的NIH3T3细胞,可稳定表达Livinα或Livinβ蛋白。结论:成功构建Livinα和Livinβ真核表达载体。     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

小鼠GITR真核表达载体的构建及表达

目的:构建小鼠GITR(mGITR)的真核表达载体,转染COS-7 细胞表达小鼠GITR 蛋白.方法:用TRIzol 试剂抽提小鼠脾细胞总RNA,经RT-PCR 扩增出GITR 全长基因,构建真核重组载体pIRES2-EGFP-mGITR,经鉴定后采用脂质体介导DNA 法转染COS-7 细胞.结果:从小鼠脾细胞中成功扩...     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达

目的构建含有FLAG标签的人DC—SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC—SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES—neo中。构建的重组质粒pIRES—neO—FLAG—DC—SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及WesternBlot检测其表达情况。结果含FLAG标签的人DC—SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG—DC—SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES—neo中;检测结果显示重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。