脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的探索脐血CD34 细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞(DCs)的方法。方法Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34 细胞,以rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1及TNF-α体外诱导培养14d,进行形态学观察、表型检测及上清液IL-12测定。结果体外培养14d后,细胞呈现典型的成熟DCs形态学及表型特征:胞体表面粗糙,可见大量突起,高水平表达CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子;同时,IL-12浓度随着培养时间的增加而升高,且在加入TNF-α刺激成熟后,IL-12浓度较未成熟时显著升高(P<0.05)。结论体外联合运用rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1、TNF-α,能够成功诱导脐血CD34 细胞分化为大量活力好的DCs。     

脐血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞体外培养体系的优化

目的：优化脐血CD34^＋造血干细胞（HPC）来源的树突状细胞（DCs）诱导培养方法，为体外研究CD34^＋HPC诱导产生功能性树突状细胞（DCs）的影响因素奠定基础。方法：淋巴细胞分离液（Ficoll）分离获得脐血单个核细胞，免疫磁珠阳性分选CD34^＋HPC，并用流式细胞术鉴定CD34^＋HPC纯度：比较GT（GM-CSF＋TNF—α）方案和GTI（GM—CSF＋TNF—α＋IL-4）方案及GTI方案中TNF—α．和IL-4不同时段加入对诱导培养产生的DCs成熟的影响：通过激光共聚焦显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析细胞表型及3H—TdR检测DCs激发异体T细胞增殖能力。结果：免疫磁珠阳性分选CD34＋HPC纯度可达90％以上：将CD34＋HPC按GT方案和GTI方案进行培养，均可诱导产生DCs．但经GT方案诱导的DCsCD14表达较高，CD80、CD86、CD83、CD1a表达不如经GTI方案诱导的高；而GTI方案中，以TNF—α．0h加入、IL-448h加入诱导培养的DCs各表型表达相对较佳．并具有激发异体T细胞增殖能力。结论：CD34^＋HPC经过合适的培养体系能够诱导分化为功能性DCs，以GM—CSF与TNF-α 0h加入、IL-448h加入的GM—CSF＋TNF—α＋IL-4方案更为可取。     

人脐血不同前体细胞体外诱导分化为树突状细胞的研究

目的从人脐血不同的前体细胞体外诱导分化树突状细胞(DCs),并对生成的细胞进行鉴定,探讨脐血在DC体外大量扩增的组织来源作用.方法用免疫磁珠法分离人脐血CD34 细胞,以GM-CSF、TNF-α、FL、SCF、IL-4诱导生成DC;用Ficoll分离脐血单个核细胞,2h贴壁后的细胞,以GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导生成DC.电镜观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞表型,并检测其刺激同种T细胞增殖的能力.结果人脐血CD34 细胞和贴壁细胞体外诱导生成的DC均具有典型的DC 形态特征,表达高水平的DC特异性标志CDla,MHCⅡ类抗原递呈分子HLA-DR和CD80共刺激分子.两种方法获得的DC的形态、CDla表面抗原的表达没有显著的差异,两者均具有刺激同种T细胞增殖的能力,前者扩增DC的效率更高.结论从人脐血中CD34 细胞和贴壁细胞两种DC的前体细胞均可诱生出DC,脐带血是DC理想的组织来源.     

白细胞介素-10对人树突状细胞表型及致炎细胞因子分泌的影响

目的观察白细胞介素(IL)-10对体外培养人树突状细胞(DC)表型和致炎细胞因子IL-12分泌的影响,探讨IL-10对DC炎性成熟过程中的负调节作用.方法通过SCF、GM-CSF、TGF-β1、Flt-3和TNF-α体外培养体系,从脐血CD34+造血干细胞中诱导扩增获得DC,并于细胞成熟中用重组人IL-10进行干预.流式细胞仪分析细胞表型CD1a、CD11c、CD83、CD80、CD86和HLA-DR;RT-PCR检测IL-12 p35、p40mRNA表达;ELISA法测定IL-12p70分泌的含量.结果IL-10可下调成熟中DC表面CD11c、CD83、CD80和CD86的表达,同时可抑制DC内IL-12p35、p40mRNA的转录和IL-12p70的分泌.结论IL-10可抑制DC黏附共刺激分子表达和致炎细胞因子的合成,提示其不仅可调抑DC的递呈抗原功能,且参与了炎症局部微环境的调节.     

脐血单个核细胞体外诱导树突状细胞联合CTLs抗肿瘤效应的研究

目的探讨从人脐血中定向诱导扩增树突状细胞(dendritic cells,DCs)的方法及其在抗肿瘤免疫治疗中的作用.方法常规无菌采集新鲜脐血,密度梯度离心分离脐血单个核细胞(cord b lood mononuc learcells,CBMCs),加入细胞因子(GM-CSF IL-4 TNF-α)定向诱导培养并进行相应的表型鉴定.观察肿瘤抗原负载后诱导特异性细胞毒T淋巴细胞生成和对肿瘤细胞杀伤作用.结果从人脐血分离到的CBMCs经GM-CSF IL-4 TNF-α共同培养后,第7天镜下即可见典型形态的DCs,细胞表型检测见CD1 a 细胞比例增加到(20.8±1.62)%.DCs负载肿瘤抗原后能诱导产生肿瘤特异性淋巴细胞,并可特异性抑制YTMLC肿瘤细胞.结论经细胞因子组合可以从脐血中诱导出DCs,并可诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cyto-toxic T-lymphocytes,CTLs)的产生,为进一步开展DCs的实验研究及临床应用奠定了基础.     

慢性粒细胞白血病患者骨髓中不同细胞诱生树突状细胞的体外研究

目的:体外诱导慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞(BMMNCs)、CD34+细胞、单核细胞为树突状细胞(DCs),并对其形态、表型及其刺激T细胞增殖作用进行比较。方法:利用GM-CSF、IL-4、TNF-α体外定向诱导生成树突状细胞,利用流式细胞仪对所诱生的细胞进行细胞形态及表型检测,用D-FISH方法检测所诱生DCs的白血病源性。并应用MTT法检测所诱生的DCs刺激T细胞增殖的能力。结果:CML患者BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞体外均可诱导生成bcr/abl融合基因阳性的DCs,前者DCs产量明显高于后二者,但均具有刺激自体及异体T细胞增殖的能力,且三者无显著性差异。结论:来源于CML患者骨髓的BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞均可诱生成CMLDCs,对T细胞均具有刺激增殖能力,但BMMNCs所诱生的DC主要来源于未成熟的中性粒细胞。     

人外周血单核细胞和脐血CD34+细胞来源的树突细胞比较

目的比较从人外周血单核细胞及脐血CD34+细胞诱导树突细胞(DC)的方法及其特性.方法用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,贴壁法获得单核细胞;经GM-CSF及IL-4诱导获得DC.磁性活化细胞分选系统(MACS)分选脐血CD34+细胞,以GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等细胞因子诱导获得DC.用电镜、普通显微镜观察DC形态;流式细胞仪分析DC表型;同种混合淋巴细胞反应(allo-MLR)观察DC刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果外周血单核细胞在因子GM-CSF、IL-4、TNF-α,脐血CD34+细胞在GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等因子作用下,可生成DC,并表达相应的DC分化抗原CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR.脐血CD34+细胞具有较强的扩增能力,经2周诱导,体系细胞数可增加173.8士26.7倍,两种来源的DC均能刺激同种异体淋巴细胞的增殖反应.结论外周血单核细胞与脐血CD34+细胞,在体外均可诱导成DC,并具有相应的DC分化抗原和功能.     

人脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的 采用脐血CD34+细胞在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下体外分化扩增为成熟树突状细胞.方法 应用CD34+干细胞分选试剂盒以及免疫磁珠法从脐血中分离CD34+细胞,用rhGM-CSF、rhTNF-α联合诱导分化发育14 d,成为成熟DC,观察细胞形态及检测CD83分子表达.结果 50 ml脐带血可分离出CD34+细胞约1.1×106,在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下CD34+干细胞培养2周,约扩增10～20倍.CD34+干细胞培养第3 d开始出现集落,第8～9天集落最大,CD34+干细胞分化发育为有树突状突起的成熟DC,表面分子CD83阳性率为81.7%.结论 体外联合运用rhGM-CSF、rhTNF-α,能够成功诱导脐血CD34+细胞分化为大量成熟的DCs.     

人PBMC和脐血CD34+细胞诱导DC2的实验方法研究

目的:探讨从人外周血单个核细胞(PBMC)和脐血CD34+造血干细胞(HSC)诱导DC2方法。方法:分别用rhIL-3(10ng/ml)+rhG-CSF(100ng/ml)和rhFlt-3L(100ng/ml)+rhIL-3(10ng/ml)+rhG-CSF(100ng/ml)诱导人PBMC和脐血CD34+HSC向DC2分化,并采用流式细胞仪分析细胞的表型,同时观察rhTNF-α和人CD40单抗诱导DC2分化成熟的作用。结果:rhG-CSFh+rhIL-3未能较好地从PBMC中诱导出DC2,但是从富集的脐血CD34+HSC用rhFlt-3L+rhIL-3+rhG-CSF诱导,可以获得相对较多的DC2,并有较高的扩增效率,但离临床研究和应用还有一定距离,因此DC2的诱导方法仍需进一步优化。人CD40单抗和rhTNF-α一样,能有效地诱导DC2分化成熟。结论:体外联合多种细胞因子从CD34+HSC成功地诱导出DC2,抗人CD40单抗有利于DC2的活化成熟。     

人外周血树突状细胞的诱导与鉴定

目的：体外诱导、培养人外周血单核细胞获得不同成熟阶段的树突状细胞（DCs）。方法：用贴壁法从健康人外周血浓缩白细胞获取单核细胞,第一阶段在GM-CSF+IL-4存在的条件下培养7 d,获得未成熟DCs;第二阶段在GM-CSF+TNF-α联合诱导下培养至14 d,获得成熟的DCs。对DCs的形态进行显微镜下观察,用流式细胞仪检测其表型,用MTT的方法对DCs的功能进行检测。结果：获得的未成熟DCs中度表达CD1a、共刺激分子,高表达HLA-DR分子,在DCs的成熟期共刺激分子、HLA-DR及CD83、CD25分子均高度表达,刺激同种异型T淋巴细胞增殖的能力强。结论：成功地建立了诱导人外周血单核细胞获得不同发育阶段DCs的方法,并获得了大量纯度较高的DCs。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

肝干细胞－卵圆细胞的研究进展

卵圆细胞是肝脏干细胞的代表细胞,主要存在于幼肝及成人受损的肝脏中,是一种双潜能的肝脏干细胞,多种因素调节其分化,在此过程中动态表达一系列表面标志物。卵圆细胞的分化异常与肝癌的发生关系密切。在体外大量扩增卵圆细胞并使之分化为成熟的 有功能的肝细胞,为终末期肝病、肝脏的组织工程研究及基因治疗开辟了新的途径。 