胃癌单克隆抗体MGcl相应抗原的初步研究

本文报告一株鼠抗人胃癌单克隆抗体MGcl相应抗原的纯化及分析。MGcl经50％饱和硫酸铵盐析,DEAE—52纤维素柱层析后,获得纯化的IgG56,31mg与2g溴化氰活化的sepharose 4B偶联,制备免疫吸附剂。用MGcl免疫亲和层析的方法从胃癌组织中纯化出MGcl相应抗原,经蛋白酶处理,高碘酸氧化,电泳脂蛋白袭色,SDS—PAGE及Immunoblotting等实验分析证实MGcl相应抗原是一种低分子量的糖蛋白,分子量为72Kd和52kd。     

胃癌单克隆抗体MGcl相应抗原的初步研究

本文报告一株鼠抗人胃癌单克隆抗体MGcl相应抗原的纯化及分析。MGcl经50％饱和硫酸铵盐析,DEAE—52纤维素柱层析后,获得纯化的IgG56,31mg与2g溴化氰活化的sepharose 4B偶联,制备免疫吸附剂。用MGcl免疫亲和层析的方法从胃癌组织中纯化出MGcl相应抗原,经蛋白酶处理,高碘酸氧化,电泳脂蛋白袭色,SDS—PAGE及Immunoblotting等实验分析证实MGcl相应抗原是一种低分子量的糖蛋白,分子量为72Kd和52kd。     

基因工程技术获取重组人血小板因子4

目的：用基因工程方法获取重组人血小板因子4（rhPF4）,为下一步基础理论研究和临床应用奠定基础。方法：PCR方法获得人PF4编码序列,克隆入质粒pRSET,构建融合表达载体pRSET—PF4,转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达融合的人PF4蛋白,经镍柱亲和层析纯化,SDS—PAGE分析所表达的目的蛋白及纯化后蛋白。结果：成功构建了表达载体pRSET—PF4,DNA序列测定结果与预期结果一致。IPTG诱导表达的rh—PF4融合蛋白部分以可溶形式存在,占菌体总蛋白量的11％。亲和层析纯化后目的蛋白纯度为84％。结论：获得原核基因工程表达的rhPF4蛋白。     

人肺癌组织热休克蛋白70-肿瘤肽纯化方法比较

目的 从人体肺癌组织分离纯化热休克蛋白70-肿瘤肽（HSP70-肿瘤肽）,比较两种层析系统分离纯化的结果。方法 采用快速蛋白液相层析（FPLC）自动系统及简单离子交换层析系统,运用亲和层析、离子交换层析、SDS—PAGE、Western-blot方法从肺癌病人手术切除肿瘤组织分离纯化HSP70-肿瘤肽。结果收集两种方法所纯化蛋白洗脱液,经电泳显示于70KD处有一纯蛋白带,定性鉴定该蛋白确系HSP70肽蛋白。结论两种层析系统均能够纯化出纯度较高的热休克蛋白70-肿瘤肽,两种方法均切实可行,实验室可根据自身条件选择应用。     

结肠癌相关抗原MC5—Ag的纯化及分析

本文用一株鼠抗人结肠癌单克隆抗体MC_s,经盐析。DEAE—S_2离子交换层析纯化后与澳化氢活化的Sepharose 4B偶联制备免疫吸附剂。用免疫亲和层析的方法从结肠癌组织中纯化出单抗MC_5相应抗康,经电泳乙酰苏丹黑10B染色,考马斯亮蓝染色,加热实验,高碘酸氧化,SDS—PAGE和免疫印迹等分析证实MC_5相应抗原是一种新的结肠癌相关糖蛋白,分子量分别为67KD和55KD。     

宫颈癌组织和细胞中PAGE4的表达及其对癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响北大核心

目的:探究前列腺相关基因4(prostate-related gene 4,PAGE4)在宫颈癌组织和细胞中的表达及其对癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法:根据前期组学结果,已筛选出宫颈癌中显著差异表达的基因PAGE4。IHC和RT-qPCR检测PAGE4在宫颈癌组织和细胞中的水平。构建并验证PAGE4过表达载体,随后转染宫颈癌SiHa和HeLa细胞系,运用CCK-8实验、克隆形成实验、流式细胞术、划痕愈合实验、Transwell迁移实验和Western blotting探究PAGE4对宫颈癌细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移和上皮间质转化的影响。应用STRING数据库预测PAGE4的潜在互作分子c-Jun,RT-qPCR检测其在过表达PAGE4的宫颈癌细胞系中的水平。通过沉默c-Jun和回复实验初步探究c-Jun在PAGE4介导的宫颈癌细胞转移中的作用。结果:测序结果表明PAGE4在宫颈癌组织中表达明显下调,倍数约为457倍。PAGE4在宫颈癌组织及细胞系中均呈低表达。与对照组相比,过表达PAGE4组细胞增殖、细胞周期以及凋亡无明显差异,但细胞迁移明显减弱,E-cadherin蛋白表达上调且Vimentin蛋白表达下调。c-Jun逆转过表达PAGE4对宫颈癌细胞迁移和上皮间质转化的影响。结论:过表达PAGE4能抑制宫颈癌细胞的迁移和上皮间质转化,其机制可能与c-Jun相关。总之,PAGE4可能在宫颈癌的转移中起一定作用,PAGE4有望成为抑制肿瘤转移的新靶点。     

免疫亲和层析法纯化新的骨肉瘤相关抗原

目的 用自行制备的抗人骨肉瘤单克隆抗体mAb5D3纯化其相应的抗原5D3Ag。方法 联合应用饱和硫酸铵沉淀法和蛋白A柱层析法，从小鼠腹水中纯化骨肉瘤单克隆抗体mAb5D3，将此单体共价交联到溴化氰活化的Sepharose—4B上，制备成免疫亲和层析柱；再将骨肉瘤细胞OS—9607的裂解液过此免疫亲和层析柱，纯化mAb5D3相应的抗原5D3Ag。结果 从骨肉瘤细胞OS—9607的裂解液中纯化出一分子量为43KD的骨肉瘤相关分子5D3Ag，经SDS—PAGE分析5D3Ag达到了电泳纯。结论 能够用免疫亲和层析的方法从骨肉瘤细胞裂解液中纯化出mAb5D3对应的抗原5D3Ag，其分子量与以往献所报道的骨肉瘤相关抗原的分子量都不相同，是一种新的骨肉瘤相关抗原。     

骨肉瘤细胞(MG-63)条件培养基中骨形态蛋白(BMP)的实验研究--BMP的分离、纯化、鉴定

目的 探索从骨肉瘤细胞条件培养基中提取骨形态蛋白(BMP)的方法，并测定其生物学活性。方法 收集骨肉瘤细胞(MG-63)条件培养基，通过浓缩、透析，SephcrylS—100凝胶层析纯化，BMP单克隆抗体鉴定所需洗脱峰，SDS—PAGE测定分子量，小鼠肌袋实验检测其骨诱导活性。结果 BMP单抗鉴定所提蛋白为BMP，SDS—PAGE显示分子量在21kD，能够在小鼠肌肉内产生异位骨化。结论 骨肉瘤细胞条件培养基中含有BMP，分离后具有良好的生物学活性，而骨肉瘤细胞可以在体外长期培养生长，为BMP的大量提取、临床应用提供一个有益的方法。     

人B细胞成熟抗原的克隆、表达及纯化

目的构建人B细胞成熟抗原（BCMA）原核表达质粒,表达BCMA融合蛋白。方法通过RT—PCR方法从人B淋巴瘤Raji总RNA中扩增BCMA的全长cDNA,并插入原核表达载体PGEX4T-1的BamHI和NotⅠ酶切位点,构建原核表达载体PGEX4T-1-BCMA,利用酶切和序列分析方法验证所构建质粒的正确性。在大肠杆菌中表达BCMA融合蛋白,并经谷胱甘肽-S-转移酶（GST）亲和柱纯化。纯化后的产物经过SDS—PAGE、Westernblot检测目的蛋白的表达情况。结果Bam HI／Notl双酶切证明重组质粒中含有目的大小的BCMA基因片段,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将所构建的PGEX4T-1-BCMA质粒转染感受态DH5ct,IPTG诱导表达后超声裂解菌体,上清经GST亲和纯化,经SDS—PAGE、抗GST和BCMA抗体Westernblot分析,证实融合表达蛋白为GST—BCMA融合蛋白。结论成功构建了BCMA原核表达载体,重组质粒能够在原核表达系统中可溶性表达GST—BCMA融合蛋白,为进一步研究BCMA的生物学功能奠定了基础。     

手术联合热休克蛋白70对荷瘤小鼠的治疗作用

目的 :研究手术联合应用肿瘤来源热休克蛋白 70 (HSP70 )对荷肝癌HCaF的 6 15系小鼠的治疗作用。方法 :用液相色谱法纯化小鼠肿瘤细胞株中的HSP70 ,用SDS PAGE及Western blot对纯化产物进行定性分析 ,毛细管电泳鉴定其纯度。通过动物实验观察HSP70及手术对荷瘤小鼠的治疗作用。结果 :HSP70 10 μg组平均生存期 [>(5 9 2± 2 9 6 )d]与对照组 [平均生存期 (17 8± 3 8)d]比较差异有显著意义 ,P <0 0 2 5。手术与HSP70 10 μg联合应用组平均生存期 [>(82 0± 17 9)d]与对照组及单纯手术相比差异有显著意义 ,P <0 0 2 5、P <0 0 5。结论 :HSP70能提高生存率 ,手术与适当剂量的HSP70联合应用使生存率更加提高 ,证明手术与HSP70免疫治疗联合应用优于单一治疗     

抗体导向辐射治疗恶性病变:新方法治疗3例肿瘤患者

用~(131)Ⅰ标记肿瘤相关单克隆抗体(HM FG 2)治疗3例恶性肿瘤患者:例1为未分化腺癌,右侧胸腔积液;例2为未分化鳞状细胞瘤,心包积液及左侧胸腔积液,肿瘤侵及右心缘。例3,囊性腺癌,侵及卵巢、左侧附件及网膜。方法:用~(131)Ⅰ标记小鼠单克隆抗体HMFG 2(IgG 1)。标记物用‘Sephadex-G50’纯化,分离游离~(131)Ⅰ。标记抗体的比放射性为4～8mCi/mg。酶联免疫吸附试验及简接放射免疫分析证实标记抗体不丧失生物学活性。标记抗体再通过Sephad-exG150作凝胶过滤试验抗体的凝聚,未发现有凝聚形成。以简接免疫过氧化物酶同包括HMFG2及阴性和阳性对照的抗体进行反应,检查组织标本。单克隆抗体做无菌和热原试验.     

普鲁卡因对正常组织和肿瘤组织热敏感性的影响

本实验初步研究了普鲁卡因对正常组织和肿瘤组织热敏感性的影响。在实验中用最大平均反应和 RD_(50)评价普鲁卡因对正常组织热敏感性的影响,用肿瘤治愈率和 TCD_(50)评价对肿瘤组织热敏感性的影响。应用普鲁卡因后,除30′高温疗法外,其余时间的高温疗法的最大平均反应都有显著增强,RD_(50)减少1—2倍。肿瘤治愈率明显增高,TCD_(50)显著减少。测得的 TGF 为1.77。这些结果表明,虽然普鲁卡因能增强正常组织和肿瘤组织的热敏感性,但对肿瘤组织的影响仍具有一定的选择性。     

对CIN患者宫颈分泌物中抗人乳头瘤病毒抗体的检测

虽然现已普遍认为人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈癌的病因有关,但对宫颈癌特异性的HPV 检测,尚无适合的血清学方法。作者以纯化的牛乳头瘤病毒(BPV)为抗原,用 ELISA方法检测了42例患生殖道尖锐湿疣和宫颈上皮内肿瘤(CIN)患者的宫颈—阴道分泌物。首次在宫颈分泌物中检测到抗乳头瘤(PV)的     

睾丸肿瘤抗原MAGE-C2基因cDNA的克隆、表达与纯化

目的　克隆人睾丸肿瘤抗原MAGE- C2基因的c DNA,并在大肠杆菌中进行表达与纯化,以便为研究其生物学功能及制备肿瘤疫苗奠定基础。方法　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中提取总RNA,用RT- PCR从中扩增出MAGE- C2的c DNA片段,将MAGE- C2的c DNA片段插入载体p GEM- T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体p GEX- 4 T- 2中,构建重组表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2 ,并转化大肠杆菌,用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化,并进行SDS- PAGE及Western- blot检测。结果　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中克隆到长4 0 0 bp的MAGE- C2的c DNA,测序正确;经Xho I和Bam H I酶切鉴定证实,MAGE- C2 c DNA成功克隆到表达载体p GEX- 4 T- 2中;构建的表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2在大肠杆菌中表达出Mr4 10 0 0的融合蛋白,经谷胱甘肽(GST)亲和层析后的融合蛋白纯度达到90 % ,该融合蛋白具有MAGE- C2抗原特性。结论　成功地克隆并表达了MAGE- C2 c DNA,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MAGE- C2抗原创造了条件。     

人组织中大肠癌负相关基因ST13的蛋白表达研究

目的原核表达大肠癌负相关基因ST13，制备ST13蛋白单克隆抗体，研究人大肠等组织中表达的ST13蛋白的生物学特性。方法将ST13 ORF克隆至GST融合蛋白表达质粒，原核表达并以Glutathione纯化GST—ST13蛋白，以凝血酶切得到ST13蛋白。以GST-ST13融合蛋白免疫小鼠，以ST13蛋白筛选杂交瘤细胞株，按杂交瘤技术制备ST13蛋白单克隆抗体，并以ST13蛋白亲和层析纯化单抗。以该单抗作Western—blot及免疫组化检测临床标本。结果蛋白表达和纯化以SDS-PAGE证实。融合蛋白表达量占大肠杆菌总蛋白20％，每升培养物回收融合蛋白2．5mg，纯度为91．3％。建立了3个ST13蛋白单抗的杂交瘤细胞株，腹水中单抗的ELISA效价达10^4-10^5，并具有对ST13蛋白的高度特异性。Western—blot证实组织细胞中天然ST13蛋白的SDS—PAGE表观分子量约50KD，比其计算分子量大约10KD，但无糖基化修饰。免疫组化表明该蛋白均匀分布于SW480细胞及大肠上皮细胞浆，计算机分析系亲水性分子。免疫组化还表明该蛋白可表达于大肠、胃及肝等多种组织上皮，但在各种正常组织和肿瘤组织之间，正常组织之间，以及肿瘤组织之间的的着色强度不一。结论原核表达了ST13蛋白，制备了相应的单抗，建立了检测组织标本中ST13蛋白的方法。研究表明人组织ST13蛋白系表观分子量50KD的细胞浆可溶性分子，可表达于大肠等多种上皮组织。ST13蛋白在大肠癌组织呈低表达，在多种正常和肿瘤组织中的表达程度不一。cDNA同源性及蛋白质特性比较表明ST13与Hip(hsp70-interacting protein)为同一蛋白质，提示ST13／Hip经Hsp70等分子伴侣途径而在大肠癌发生发展中起作用。     

mGM-CSF重组质粒的构建、表达及活性鉴定

目的 构建pc—mGM—CSF重组质粒载体，为mGM—CSF基因治疗肿瘤的研究奠定基础。方法 采用RT—PCR方法从小鼠脾脏中获得目的基因mGM—CSF，克隆于pcDNA3.1／Myc-His(-)(A)质粒上，成为pc-mGM-CSF，用PCR、酶切进行鉴定，然后用脂质体转染小鼠骨髓瘤细胞SP2／0，用G418筛选后通过RT—PCR和SDS—PAGE鉴定，将转染SP2／0上清加入NFS-60细胞，检测蛋白活性。结果 重组质粒中含有mGM—CSF基因，在SP2／0中有表达，且表达产物能分泌到肿瘤细胞外，分泌到细胞外的产物用mGM—CSF依赖株NFS-60细胞检测证明具有生物学活性。结论 成功构建含mGM—CSF真核表达重组质粒，有助于进一步研究其抗肿瘤作用。     

厌氧棒菌苗诱导小鼠产生内源性肿瘤坏死因子的条件及其特性

本文采用正交设计,初步探讨了厌氧棒菌苗(CP)诱导内源性肿瘤坏死因子(TNF)活性的条件。结果表明:仅用CP一种调节剂,按照一定方式对小鼠进行三次刺激.便可使其血清具有显著的内源性TNF活性。有TNF活性的部分经SDS—PAGE和凝胶过滤测得分子量分别约为60,000dal和55,000dal;醋酸纤维膜电泳显示为α球蛋白;TNF活性经56℃处理30分钟仍稳定,70℃,10分钟即丧失;在pH6～9之间、活性稳定。     

用单克隆抗体筛选小细胞肺癌相关抗原基因

用分子生物学技术克隆肿瘤相关抗原基因对认识肿瘤抗原本质、深入研究肿瘤抗原的结构和功能、研究肿瘤多肽疫苗有重要意义。我们已获得一组抗人小细胞肺癌单克隆抗体,并在体外证实该抗体所识别的抗原在靶细胞有较好的特异性和较高分布密度,是多肽性抗原决定簇。在此基础上,以抗体为探针,筛选小细胞肺癌基因库,目的在于寻找编码抗体所识别抗原的肿瘤相关基因。 λgt_(11)噬菌体为载体构建的人小细胞肺癌细胞株NCI—H_(128)cDNA文库的效价约1.3×10~6,可在大肠杆菌系统和β-半乳糖苷酶构成融合蛋白的形式,表达插入的外源蛋白。我们用抗NCI-H_(128)单抗2F_7和E_6混合作为控针。碘_(125)用Iodogen方法标记在纯化的抗小鼠抗体上。10~7的菌斑转移到NC膜,经放射自显影,从中筛选到5个阳性菌斑,经4轮克隆化后,阳性斑达100％,对其中N0.4克隆进一步研究。该克隆的溶源菌经     

肿瘤-睾丸抗原LAGE-1基因的原核表达纯化和抗血清制备

目的:构建人肿瘤-睾丸抗原LAGE-1的原核表达质粒,表达、纯化LAGE-1融合蛋白并制备GST-LAGE-1多克隆抗体。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增人肝癌组织LAGE-1基因3′端片段,连入原核表达载体pGEX-4T-1( ),构建原核表达质粒pGEX-LAGE-1并测序。将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,经包涵体透析复性和谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统分离纯化目的蛋白。用纯化的融合蛋白GST-LAGE-1免疫新西兰大白兔,间接ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,并采用Western blot检测GST-LAGE-1多克隆抗体特异性。结果:RT-PCR扩增得到LAGE-1基因3′端264bp片段,测序结果与GenBank公布序列一致;成功构建pGEX-LAGE-1原核表达质粒,含有该质粒的大肠埃希菌经IPTG诱导后表达相对分子质量约为36×103的蛋白,经包涵体复性和GST融合蛋白纯化系统纯化,得到重组蛋白GST-LAGE-1,纯度达90%;制备兔抗GST-LAGE-1抗体,纯化的抗体经Western blot证实可与目的蛋白特异性结合。结论:获得了纯化的肿瘤-睾丸抗原LAGE-1重组蛋白及其特异性多克隆抗体,为进一步研究LAGE-1抗原在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础。     

中药白头翁提取物抗肿瘤活性的体外实验研究

背景与目的:探讨中药白头翁[pulsatilla chinensis(Bunge)regel]提取物的体外抗肿瘤作用.材料与方法:采用噻唑蓝(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazoliumbromide,MTT)比色法测定白头翁提取物对肿瘤细胞增殖反应的影响;用三步法初步分离,纯化白头翁提取物的抗肿瘤有效部位.结果:白头翁提取物对多种组织来源的肿瘤细胞增殖有较强的抑制作用,量-效关系明显,IC50值均低于30 μg/ml,并找到其有效部位.结论:白头翁作为抗肿瘤药物有待进一步开发.