多形性胶质母细胞瘤中NTRK1融合基因

多形性胶质母细胞瘤(GBM)是脑肿瘤中最具有侵袭性肿瘤,目前仍然无任何靶向治疗后生存获益报道。最近研究表明实体肿瘤中融合基因通常扮演驱动基因的角色和药物干预的潜在靶点。在调查GBM潜在的融合基因时,该团队通过癌症基因图谱(TCGA)对162例GBM患者进行RNA测序分析发现神经营养酪氨酸激酶受体1型(NTRK1,编码TrkA)的3’外显子和神经组织中高表达的NFASC、BCAN的5’     

FAK基因沉默增强白血病细胞对化疗药物敏感性

目的: 本实验研究黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)基因沉默对白血病细胞化疗药物敏感性的影响。方法: 构建FAK shRNA慢病毒载体,转染至BCR/ABL-BaF3白血病细胞株,通过蛋白质印迹方法检测FAK蛋白表达情况。 体外应用不同浓度的化疗药物伊马替尼处理BCR/ABL-BaF3细胞,予Annexin V标记检测细胞凋亡情况。建立白血病动物模型,联合应用FAK shRNA及伊马替尼进行处理,观察小鼠生存情况,分析白血病细胞在小鼠骨髓及脾脏的分布情况。结果: 成功建立FAK shRNA慢病毒载体,该载体能有效沉默FAK基因表达。体外实验发现5 μmol/L 伊马替尼处理时,空白对照组与FAK基因沉默组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(9.76±1.97%和(21.90±3.20%,差异显著(P<0.05);予50 μmol/L 伊马替尼处理时,2组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(56.10±6.00)%和(82.10±5.70)％,差异显著(P<0.05)。白血病动物实验中,与空白对照组相比,生存分析结果显示FAK基因沉默组小鼠的生存时间明显延长。白血病细胞输注后第60 d,与空白对照组相比,白血病细胞在FAK基因沉默组小鼠骨髓和脾脏的分布明显减少。结论: FAK基因沉默能明显增强白血病细胞对化疗药物敏感性,提示FAK基因沉默有望成为白血病治疗的新策略。     

ALK和ROS1：肺癌治疗的联合靶点

间变性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphomakinase，ALK）基因重排可见于包括非小细胞肺癌non-smallcelllungcancer，NSCLC）在内的多种恶性肿瘤中。ALK融合基因使激酶具有异常活性，而野生型ALK激酶域突变也可使它被激活。ALK基因重排使得NSCLC中出现了新的分子亚型，该亚型对ALK抑制剂高度耐药。克唑替尼（crizotinib）是一个口服小分子ATP模拟化合物，它最初作为MET抑制剂被开发，随后被发现具有抗ALK活性的脱靶效应（off-target），并被美国FDA批准用于治疗ALK阳性的NSCLC患者。近来在NSCLC患者中还发现了ROSl受体酪氨酸激酶染色体重排，而克唑替尼正处于治疗该分子亚型NSCLC患者的临床试验中。任何计算机辅助药物设计都是依赖其分子结构和配体的药物设计方法，每种方法的详细信息中均应重点强调利用这二者，以开发多靶点小分子激酶抑制剂。此类多靶点小分子激酶抑制剂均可对ROS1和ALK重排的NSCLC有抑制增殖作用。因此，本综述重点强调了关于靶向这些激酶的重要性，以及在优化出效能更佳、选择性更强的ROS1和ALK激酶抑制剂中所取得的进步。     

正常人T细胞和胸腺细胞中多种新的TCRδRec基因重排

利用巢式或半巢式PCR扩增10例正常人外周血单个核细胞(PBMC)、4例分选CD3~+细胞和7例正常胸腺细胞DNA中TCR δRec区与Jδ1、Dδ3和Ja重排的基因片段,分析正常人外周血T细胞和胸腺细胞中TCR δRec基因重排情况。克隆性PCR产物进一步进行核苷酸序列分析确定其重排位置。结果发现了4种新的TCR δRec重排,包括TCR δRec_(149321)-Jδ1、TCRδRec_(149820)-Jδ1、TCR δRec_(151657)(Nx)-Ja和TCR δRec_(153199)-Jδ1等,其中以TCR δNx的重排最多见,通过利用不同模板DNA的PCR分析发现δRec重排在外周血和胸腺细胞中有所不同。结果显示TCR δNx-Jδ1重排在成熟和不成熟T细胞发生频率均较高,而TCR δNx-Dδ3重排在不成熟T细胞中发生率较高。但所有重排均不表达于mRNA中。本研究结果为TCR δ基因重排的研究补充了一些新的数据。     

敲减NOB1基因表达对人结肠癌SW480细胞药物敏感性及侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨通过小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)技术敲减NOB1基因表达对人结肠癌SW480细胞活力、药物敏感性、凋亡、细胞周期及侵袭和迁移能力的影响。方法:利用脂质体Lipofectamine 3000将NOB1 siRNA转染至SW480细胞,采用real-time PCR和Western blot检测转染后SW480细胞中NOB1 mRNA和蛋白表达的变化;采用MTT法检测敲减NOB1基因表达后SW480细胞活力及其对不同化疗药物(顺铂、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和卡培他滨)敏感性的变化;流式细胞术检测敲减NOB1基因表达对SW480细胞凋亡和周期的影响;Transwell方法检测敲减NOB1基因表达对结肠癌SW480细胞侵袭和迁移能力的影响。结果:转染NOB1 siRNA后,SW480细胞中NOB1的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05);与对照组和阴性对照siRNA组相比,NOB1 siRNA转染组的SW480细胞在24～72 h的细胞活力显著降低,顺铂、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和卡培他滨对该细胞的半数抑制浓度均显著降低,细胞凋亡率显著增加,细胞周期受到阻滞,细胞侵袭和迁移能力显著降低(P0.05)。结论:NOB1 siRNA转染能够抑制结肠癌SW480细胞活力及侵袭和转移能力,并增强细胞对药物的敏感性,促进细胞凋亡。NOB1能够成为结肠癌诊断和治疗的新靶点。     

调控FOXM1基因对乳腺癌BT474细胞赫赛汀药物敏感性的影响

目的探究调控叉头框转录因子M1(FOXM1)基因对乳腺癌BT474细胞赫赛汀药物敏感性的影响。方法将FOXM1过表达及特异性靶向FOXM1基因的小干扰RNA(FOXM1-siRNA)转染至乳腺癌BT474细胞,将细胞分为上调FOXM1基因组、下调FOXM1基因组和对照组。Western blot检测FOXM1蛋白以及PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。MTT法检测不同浓度赫赛汀药物对BT474细胞增殖能力的影响。Transwell实验检测不同浓度赫赛汀药物对BT474细胞迁移、侵袭能力的影响。结果下调FOXM1基因后,FOXM1蛋白的相对表达量明显减少(P<0.05)。上调FOXM1基因组BT474细胞的增殖率、迁移数量、侵袭数量显著高于对照组,且随着赫赛汀浓度的增加其增殖率、迁移数量、侵袭数量逐渐增加,上调FOXM1基因可增强BT474细胞对赫赛汀的耐药性,促进增殖、迁移及侵袭。下调FOXM1基因组BT474细胞的增殖率、迁移数量、侵袭数量显著低于对照组,低浓度的赫赛汀对BT474细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制程度较弱,高浓度的赫赛汀对BT474细胞的增殖、迁移及侵袭能力的抑制过度,而中浓度的赫赛汀抑制能力介于低、高浓度之间,能够有效抑制BT474细胞增殖、迁移及侵袭,但无抑制过度的表现。不同赫赛汀浓度下下调FOXM1基因组细胞的增殖率、迁移数量、侵袭数量显著低于上调FOXM1基因组。下调FOXM1基因组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量均低于对照组和上调FOXM1基因组(P<0.05)。结论上调FOXM1基因可增强乳腺癌BT474细胞对赫赛汀的耐药性,下调FOXM1基因在中浓度赫赛汀的干预下,可通过作用于PI3K/AKT信号通路,抑制乳腺癌BT474细胞的增殖、迁移及侵袭,从而抑制乳腺癌的发展。     

正常人外周血和胸腺T细胞中TCR δRec151051—Jδ1和δRec151298—Jδ1基因重排的分布特点

目的 分析正常人外周血和胸腺细胞中TCR δRec151051-Jδ1和δRec151298-Jδ1基因重排分布特点。方法 利用半巢式和巢式PCR扩增10例正常人外周血单个核细胞（PBMCs）、4例分选的外周血CD3^ T细胞和7例正常人胸腺细胞DNA的TCR δRec基因与Jδ1、Dδ3和ψJa重排的基因片段,从不同含量DNA的PCR分析,了解其重排分布频率。结果 TCRδRec151051分别与Jδ1、Dδ3和ψJa的重排和TCR δRec151298-Dδ3重排见于大多数外周血T细胞和胸腺细胞中,而TCR δRec151298与Jδ1和ψJa的重排则多见于胸腺细胞中,对不同含量的DNA的PCR分析显示δRec重排的分布频率在外周血和胸腺细胞有所不同。结论 TCR δRec151051、TCR δRec151298与Jδ1、Dδ3和ψJa的重排均存在于多数正常人T细胞中,TCR δRec151051-Dδ3最常见于成熟和未成熟T细胞中,而TCR δRec151298-Jδ1和TCR δRec151298-ψJa则主要见于未成熟T细胞中。     

正常人外周血和胸腺T细胞中TCR DδX基因重排的特点

目的：分析正常人外周血和胸腺细胞中 ＴＣＲ ＤδＸ基因重排分布特点。方法：利用半巢式 ＰＣＲ扩增 １０例正常人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣｓ）、４例分选的外周血 ＣＤ３＋Ｔ细胞和 ７例正常人胸腺细胞 ＤＮＡ的 ＴＣＲ ＤδＸ基因与ＪδＸ、Ｄδ３和　Ｊａ重排的情况，从不同含量 ＤＮＡ的 ＰＣＲ分析，了解其重排分布频率。结果：ＴＣＲ ＤδＸ分别与 ＪδＸ、Ｄδ３和　Ｊａ的重排均可见于多数外周血Ｔ细胞和胸腺细胞中，对不同含量的ＤＮＡ的ＰＣＲ分析显示ＴＣＲ ＤδＸ重排的分布频率在外周血和胸腺细胞有所不同。结论：ＴＣＲ ＤδＸ－　Ｊａ的重排最常见于成熟和未成熟Ｔ细胞中，而ＴＣＲ　ＤδＸ－Ｄδ３则在未成熟Ｔ细胞中多见。     

正常人外周血和胸腺T细胞中TCR δRec151051-Jδ1和δ Rec151298-J δ 1基因重排的分布特点

目的分析正常人外周血和胸腺细胞中TCRδRec151051-Jδ1和δRec151298-Jδ1基因重排分布特点.方法利用半巢式和巢式PCR扩增10例正常人外周血单个核细胞(PBMCs)、4例分选的外周血CD3+T细胞和7例正常人胸腺细胞DNA的TCRδRec基因与Jδ1、Dδ3和ψJα重排的基因片段,从不同含量DNA的PCR分析,了解其重排分布频率.结果TCRδRec151051分别与Jδ1、Dδ3和ψJα的重排和TCRδRec151298-Dδ3重排见于大多数外周血T细胞和胸腺细胞中,而TCRδRec151298与Jδ1和ψJα的重排则多见于胸腺细胞中.对不同含量的DNA的PCR分析显示δRec重排的分布频率在外周血和胸腺细胞有所不同.结论TCRδRec151051、TCRδRec151298与Jδ1、Dδ3和ψJα的重排均存在于多数正常人T细胞中,TCRδRec151051-Dδ3最常见于成熟和未成熟T细胞中,而TCRδRec151298-Jδ1和TCRδRec151298-ψJα则主要见于未成熟T细胞中.     

T—ALL中两种新的TCRδ基因重排δRec151051—Jδ1和δRec151298—Jδ1

目的 分析T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞中TCRδ基因新的重排形式及其在正常人外周血和胸腺细胞中的分布情况。方法 利用半巢式PCR扩增2例T-ALL、10例正常人外周血和7例正常人胸腺细胞DNA的TCRδ基因组片段,了解其重排情况,克隆性PCR产物进一步进行苷酸序列分析确定重排位置,并进一步经PT-PCR检测其重排基因的表达情况。结果 在2例T-ALL病人白血病细胞发现两种新的TCR δRec-Jδ1基因重排方式,称为δRec151051-Jδ1和δRec151298^-Jδ1,该新的TCR δRec基因重排同时见于大多数正常人外周血和胸腺。RT-PCR显示该两种TCR δRec-Jδ1基因重排的产物可见于2例T-ALL中,而正常人为阴性。结论 本研究发现两种新的TCR δRec151051-Jδ1和δRec151298-Jδ1 基因重排。该重排基因表达于T-ALL中,而正常人不表达该重排基因,提示该重排形式可能与T细胞白血病的形成有一定的关系。     

T-ALL中两种新的TCRδ基因重排δRec_(151051)-Jδ1和δRec_(151298)-Jδ1

目的分析 T细胞急性淋巴细胞白血病 ( T- AL L )细胞中 TCRδ基因新的重排形式及其在正常人外周血和胸腺细胞中的分布情况。方法利用半巢式 PCR扩增 2例 T- AL L、10例正常人外周血和 7例正常人胸腺细胞 DNA的 TCRδ基因组片段 ,了解其重排情况 ,克隆性 PCR产物进一步进行核苷酸序列分析确定重排位置 ,并进一步经 RT- PCR检测其重排基因的表达情况。结果在 2例 T- AL L 病人白血病细胞发现两种新的 TCRδRec- Jδ1基因重排方式 ,称为 δRec1 51 0 51 - Jδ1和δRec1 51 2 98- Jδ1,该新的 TCRδRec基因重排同时见于大多数正常人外周血和胸腺。 RT- PCR显示该两种 TCRδRec- Jδ1基因重排的产物可见于 2例 T- AL L中 ,而正常人为阴性。结论本研究发现两种新的 TCRδRec1 51 0 51 - Jδ1和δRec1 51 2 98- Jδ1基因重排。该重排基因表达于 T- AL L中 ,而正常人不表达该重排基因 ,提示该重排形式可能与 T细胞白血病的形成有一定的关系     

GSK3抑制剂氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠的痛觉敏感性的影响

目的探讨氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠(KO鼠)的痛觉敏感性的影响及机制。方法 8周龄KO小鼠第1天测定热刺激缩足反射潜伏期(PWTL)值,作为基础痛阈,第2、3、4、5天连续腹腔注射氯化锂,给药30 min后测定PWTL值,第6天给药30 min后取腰骶膨大段脊髓组织,通过免疫印迹技术检测KO及WT鼠脊髓水平的GSK3β和P-GSK3β的变化。结果8周龄KO鼠的痛阈均比同周龄WT鼠的痛阈高。使用氯化锂后,KO鼠痛阈下降,且与WT鼠相比差异无统计学意义。8周龄KO鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的P-GSK3β的表达较WT鼠明显减少。使用氯化锂后,KO鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的P-GSK3β的表达增多,而WT鼠的变化不明显。8周龄KO鼠及WT鼠脊髓腰骶膨大段后角边缘层及胶状质的GSK3β的表达在用药前后均无明显改变。结论 KO鼠热痛觉阈值增高,热痛觉敏感性降低。KO鼠腰骶膨大段脊髓后角的P-GSK3β表达减少可能是KO鼠热痛觉敏感性降低的原因之一;氯化锂可能通过增加脊髓后角中的P-GSK3β的表达而改善KO的鼠热痛觉敏感性。     

BCL-3基因沉默对BCL-3高表达的人大肠癌RKO细胞增殖和药物敏感性的影响

 目的：构建针对人BCL-3基因的RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒载体,观察其对大肠癌细胞株中BCL-3基因的沉默效应,以及基因沉默对细胞生物学行为及药物敏感性的影响。方法：运用RT-PCR及Western blotting方法检测5株大肠癌细胞株中BCL-3的表达状况;构建人BCL-3基因的RNAi慢病毒载体,并转染BCL-3高表达的大肠癌细胞株,运用Western  blotting方法鉴定其对BCL-3基因的沉默效果;BCL-3基因沉默后运用细胞增殖实验及软琼脂克隆形成实验检测其对细胞增殖能力的影响,运用MTT方法检测大肠癌细胞株对化疗药物敏感性的变化。结果：BCL-3高表达于大肠癌细胞株RKO中;成功构建了BCL-3　RNAi慢病毒载体,Western blotting实验显示其可抑制RKO细胞中BCL-3蛋白的表达;抑制BCL-3的表达后,增殖实验表明RKO细胞增殖能力下降,软琼脂克隆形成实验表明RKO细胞的克隆形成率下降;MTT实验表明BCL-3表达抑制后奥沙利铂对RKO细胞的半数抑制浓度（median inhibitory concentration, IC50）显著降低。结论: BCL-3表达抑制后,BCL-3高表达的大肠癌细胞株RKO的增殖能力下降,并且其对奥沙利铂的敏感性增强。     

非小细胞肺癌患者组织原发灶和转移灶中ROS1融合基因的研究

目的：研究晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)原发灶和转移灶ROS1融合基因阳性率,探讨其相关性。方法：收集2013年1月至2015年5月中国人民解放军北京军区总医院、军事医学科学院附属医院、浙江省肿瘤医院、大连大学附属中山医院和山西医学科学院山西大医院原发灶384例,其中配对转移灶246例,统计得出ROS1融合基因阳性率并分析原发灶与转移灶ROS1融合基因的一致性、ROS1融合基因阳性与临床基线资料间的关系。结果：ROS1融合基因阳性率原发灶为2.60%(10/384)。ROS1融合基因阳性率配对原发灶为2.85%(7/246),配对转移灶为1.63%(4/246),配对的246对原发灶、转移灶组织中,转移灶融合基因阳性而对应的原发灶融合基因阴性1例,原发灶融合基因阳性而对应的转移灶融合基因阴性4例,转移灶较原发灶检出ROS1融合基因阳性率高,两者差别有统计学意义(χ2=52.341,P=0.000);转移灶和原发灶ROS1融合基因阳性的一致率好(κ=0.536,P=0.000),通过转移灶判断原发灶融合阳性的情况,敏感性为42.86%(3/7),特异性为99.58%(238/239)。结论：非小细胞肺癌中转移灶可以预测原发灶ROS1融合基因情况,在难以取得原发灶的情况下转移灶可以作为ROS1融合基因测的备选手段。     

hLKB1基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

目的构建hLKB1真核表达载体,证实融合蛋白在胃癌细胞内的表达及定位。方法提取胃正常黏膜上皮细胞GES-1的总mRNA并进行反转录。以反转录的cDNA为模板PCR扩增hLKB1全长编码基因,克隆至pCDNA3.1/flag的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌SGC-7901细胞中,分别利用Western blot和激光共聚焦扫描显微技术检测其表达和在胃癌细胞中的定位。结果 hLKB1全长基因序列克隆到真核表达载体中,酶切鉴定片段为1300bp。Western blot检测到真核转染的Flag-hLKB1在胃癌SGC-7901细胞表达,条带约为50kD,免疫荧光显示蛋白广泛定位于细胞质和细胞核内。结论成功构建了hLKB1基因真核表达载体,并验证其在胃癌细胞表达。     

APOE和SORL1基因联合检测对阿尔兹海默病患者早期诊断的意义

目的探讨载脂蛋白E(APOE)和分拣蛋白相关受体L1基因(SORL1)基因联合检测对阿尔兹海默病(AD)患者早期诊断的临床意义。方法选择2017年10月-2018年10月我院神经内科收治的AD患者118例作为研究组,另选90例同期健康体检者作为对照组,采用qRT-PCR检测两组外周血白细胞中APOE和SORL1基因相对表达量,比较APOE、SORL1基因对AD联合诊断与单独诊断的效果。结果对照组APOE基因平均相对表达量明显低于研究组,差异有统计学意义(P<0.05);对照组APOE基因平均相对表达量明显低于研究组,差异有统计学意义(P<0.05);APOE、SORL1基因联合诊断效果明显优于单独诊断效果,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 APOE和SORL1基因联合检测可互补二者单独应用时的不足,在阿尔兹海默病患者早期诊断中具有较好的应用价值,值得推广。     

非小细胞肺癌EGFR基因突变与ERCC1、RRM1、TUBB3 mRNA表达相关性研究

目的：探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变与切除修复交叉互补蛋白1(excision repair cross-complementation 1,ERCC1)、核苷酸还原酶亚单位M1(ribonucleotide reductase subunit M1,RRM1)及3型β-微管蛋白基因(classⅢβ-tubulin,TUBB3)表达的关系。方法：回顾性分析我院经病理诊断的69例NSCLC患者的手术切除的肿瘤标本,利用扩增受阻突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)进行EGFR基因突变检测,应用实时荧光定量PCR检测ERCC1、RRM1及TUBB3 mRNA的表达水平。结果：69例患者中,EGFR突变率为33.33%(23/69),在性别、吸烟史、病理类型组间突变率有显著性差异。ERCC1低、高表达率分别为59.42%(41/69)、40.58%(28/69),EGFR突变与ERCC1表达呈负相关性,EGFR无突变时ERCC1趋向于高表达(P=0.024);RRM1低、高表达率分别为31.88%(22/69)、68.12%(47/69),EGFR突变与RRM1表达无相关性(P>0.05);TUBB3低、高表达率分别为8.70%(6/69)、91.30%(63/69),EGFR突变与TUBB3表达无相关性(P>0.05)。ERCC1、RRM1、TUBB3三者间的基因表达均无相关性。结论：NSCLC患者肿瘤组织中EGFR突变患者ERCC1倾向低表达,这类患者可能更能从铂类化疗和靶向药物中受益。