AKT-糖原合成激酶-3β信号通路对SOD1G93A突变N2a细胞的保护作用

目的探讨AKT-糖原合成激酶-3β(GSK-3β)信号通路对SOD1G93A突变N2a细胞的作用及机制。方法选取小鼠成神经瘤细胞系N2a,分别转染p EGFP-WT-SOD1和p EGFP-G93A-SOD1质粒,应用Western blotting和免疫荧光染色方法检测AKT、GSK-3β和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在细胞模型中的表达变化。应用RT-PCR和Western blotting技术检测siRNA沉默AKT后GSK-3β和cyclin D1在SOD1突变N2a细胞中的表达变化,通过MTS方法,检测细胞增殖和存活的改变。结果与p EGFP-WT-SOD1转染的N2a细胞比较,p EGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中AKT及GSK-3β总蛋白在转染后24 h和48 h表达均无明显变化,p-AKT(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1表达均升高。免疫荧光染色结果显示,转染后24 h和48 h,p-AKT(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1在p EGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中表达均升高。应用siRNA沉默AKT后与对照组相比,在转染后48 h和72h,AKT、p-AKT(Ser473)、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1蛋白均降低。MTS实验结果显示,在AKT沉默后72h、96 h、120 h,N2a细胞增殖和活力降低。结论 SOD1G93A突变影响N2a细胞中AKT、GSK-3β翻译后磷酸化修饰及cyclin D1的表达,AKT可能通过调控GSK-3β和cyclin D1影响SOD1G93A突变N2a细胞的增殖和存活。     

人表皮生长因子受体显性负性突变体诱导胃癌细胞发生G0/G1期阻滞

 目的：探讨人表皮生长因子受体显性负性突变体（dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR）对胃癌细胞细胞周期的影响及其分子机制。方法：选用2株人胃癌细胞,分为如下6组：SGC-7901细胞未转染组（US组）、SGC-7901细胞pEGFP-N1质粒转染组(ES组)、SGC-7901细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DS组)、NCI-N87细胞未转染组（UN组)、NCI-N87细胞pEGFP-N1质粒转染组(EN组)和NCI-N87细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DN组)。采用流式细胞术检测细胞周期,Western blotting检测细胞周期素依赖性蛋白激酶2（CDK2）、cyclin D1、Ser9位点磷酸化糖原合成酶激酶3β［p-GSK-3β(Ser9)］、p21和p27蛋白水平。结果：转染pEGFPN1-DNEGFR质粒的人胃癌细胞株出现G0/G1期阻滞,CDK2、cyclin D1和p-GSK-3β（Ser9）蛋白水平降低,p21和p27蛋白水平则升高。结论：DNEGFR通过激活GSK-3β使cyclin D1蛋白水平降低,并降低CDK2蛋白水平,上调p21和p27蛋白水平,最终导致胃癌细胞发生G0/G1期阻滞。这一结果将为胃癌生物治疗研究提供新思路。     

Akt/GSK-3β介导高糖上调肾小管上皮细胞Snail1的表达

 目的：观察高糖对原代肾小管上皮细胞Snail1和蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β（Akt/GSK-3β）信号通路的影响,探讨糖尿病肾病时Snail1表达的调节机制。方法：原代培养大鼠肾小管上皮细胞（RTECs）,随机分为正常糖对照组、高渗组和高糖组。Western blotting检测不同处理组 RTECs不同培养时点（30 min、2 h、12 h、24 h、48 h和72 h）Snail1、Akt1、GSK-3β、磷酸化Akt（p-Akt,Ser473）和磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β,Ser9）蛋白的水平。RT-PCR检测Snail1、Akt1和GSK3β mRNA的表达。RTECs以磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂LY294002（25 μmol/L）预处理50 min,再与高糖共同培养24 h,Western blotting检测上述指标蛋白的表达。结果：与正常糖对照组比较,高糖组RTECs Snail1和Akt1蛋白和mRNA的表达上调,p-Akt及p-GSK-3β蛋白表达增加,但总GSK-3β蛋白和mRNA表达无变化。以LY294002处理后,高糖组RTECs Snail1、p-Akt及p-GSK-3β蛋白表达水平较未处理高糖组明显下降,但LY294002不影响总Akt1和GSK-3β蛋白表达。结论：Akt/GSK-3β可能介导了高糖诱导的RTECs锌指转录因子Snail1的表达上调。     

自噬相关基因4B在肌萎缩侧索硬化症转基因鼠动物模型及细胞模型中的表达

目的:检测自噬相关基因(Atg)4B在肌萎缩侧索硬化症(ALS)转基因鼠动物模型、神经母细胞瘤与脊髓杂交细胞系34(NSC-34)运动神经元细胞模型中的表达变化,探讨Atg4B调节的自噬与ALS发病的关系。方法:通过RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学检测Atg4B在ALS转基因鼠发病不同时间点脊髓中的表达变化;应用pEGFP-G93A-SOD1和pEGFPwt-SOD1转染NSC-34细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光显色检测转染后24、48 h和72 h Atg4B在细胞模型中的表达变化。结果:与野生型鼠相比较,ALS鼠脊髓中Atg4B mRNA及蛋白在发病早期变化不明显,发病中期和晚期均下调;与转染pEGFP-wt-SOD1的NSC-34细胞相比,转染pEGFP-G93A-SOD1的NSC-34细胞在转染后24 h Atg4B mRNA及蛋白无明显变化,转染后48 h和72 h均下调。结论:自噬基因Atg4B表达下调与ALS发病密切相关。     

蛋白质酪氨酸激酶2通过PI3K/AKT/Gsk3b信号调控Tau磷酸化

目的 探究蛋白质酪氨酸激酶2(protein tyrosine kinase, Pyk2)在学习记忆障碍小鼠模型中的表达及对神经元细胞Tau蛋白磷酸化的影响和分子机制。方法 免疫组化检测APPswe/PS1ΔE9(APP/PS1)双转基因AD和WT小鼠脑组织Pyk2蛋白表达;免疫印迹检测Pyk2、Tau5、Tau46、CP13、AT180、PHF-1、12E8和AT270蛋白表达;免疫印迹检测SHSY-5Y细胞共转染pcDNA6.2-Pyk2-GFP和pcDNA6.2-hTau(2N4R)-V5质粒24h后Tau5、Tau46、CP13、AT180、PHF-1、12E8和AT270蛋白表达;包装PLOK1-Pyk2 shRNA慢病毒,转染SHSY-5Y细胞构建Pyk2敲低细胞系,转染hTau(2N4R)质粒24h后,Western blot检测Tau5、Tau46、CP13、AT180、PHF-1、12E8、AT270、P110α、P110β、P85α、p-P85α、AKT、p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、Gsk3β和p-Gsk3β(Ser9)蛋白表达。结果 与...     

RNA干扰敲低GSK-3β对瘢痕疙瘩形成影响的体外研究

目的:利用RNA干扰技术探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFB)的抑制效果。方法:将针对人GSK-3β基因设计合成的3对特异性小干扰RNA(siRNA)分别转染体外培养的人KFB,通过RT-PCR和Western blot筛选出干扰人KFB GSK-3β基因表达的最佳siRNA,进而转染人KFB,并用RT-PCR和Western blot检测GSK-3β及相关蛋白的m RNA和蛋白表达。结果:1434序列具有最佳的GSK-3βm RNA和蛋白抑制效率。转染GSK-3βsiRNA后,KFB的β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p-GSK-3β和Wnt2的蛋白水平下降,KFB活力下降,且随着培养时间的延长,细胞生长受抑制程度增大,细胞倍增时间明显延迟。结论:转染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低该基因在KFB内的表达,从而抑制了瘢痕疙瘩生长,具有潜在的治疗前景。     

ILK siRNA对高糖刺激的人肾小管上皮细胞GSK-3β及β-catenin表达的影响*

 目的：探讨高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中整合素连接激酶小干扰RNA（ILK siRNA）对糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）磷酸化和β-连环蛋白（β-catenin）核内表达的影响及意义 。方法：体外培养人近端肾小管上皮细胞系HKC,分为正常对照组（NG）、高糖组（HG）、高糖＋阴性转染对照组 (HG+HK)和高糖＋ILK siRNA组(HG+ILK siRNA)。倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。RT-PCR及Western blotting检测ILK  mRNA及蛋白表达水平;免疫细胞化学检测磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）和β-catenin表达。Western blotting检测总GSK-3β、p-GSK-3β、核β-catenin、总β-catenin、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。结果：（1）倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,证实构建的siRNA重组质粒成功转染HKC细胞;（2）与HG和 HG+HK组相比,HG+ILK siRNA组ILK mRNA及蛋白水平下降,但较NG组表达仍高;（3）HG+ILK siRNA组ILK基因沉默后,p-GSK-3β与核β-catenin蛋白表达较HG及HG+HK组均下降,但较NG组表达仍高。而总GSK-3β与总β-catenin 在各组表达无明显差异。结论:ILK、GSK-3β和β-catenin可能参与了高糖介导的肾小管上皮细胞转分化过程。ILK可能通过调节Wnt/β-catenin途径下游效应蛋白GSK-3β和β-catenin的表达而促使肾小管上皮细胞转分化。     

丙戊酸孤独症大鼠脑中经典Wnt信号通路的变化

 目的：探讨经典Wnt信号通路在孤独症发病中的作用。方法：利用丙戊酸孤独症大鼠模型,检测经典Wnt信号通路信号分子在孤独症大鼠前额叶皮质及海马脑区的表达。Western blotting法检测糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β）、磷酸化GSK-3β、β-catenin和磷酸化β-catenin表达,半定量RT-PCR法检测GSK-3β、β-catenin、c-Myc和cyclin D1 mRNA表达。结果：与对照组相比,在丙戊酸孤独症大鼠前额叶皮质及海马脑区,失活的GSK-3β磷酸化表达显著增加,抑制性的β-catenin磷酸化表达显著减少;GSK-3β mRNA表达减少,β-catenin mRNA表达增加,下游c-Myc和cyclin D1 mRNA表达增加。结论：前额叶皮质及海马中经典Wnt信号通路活性增加可能促进了机体对孤独症的易感性。     

GSK-3β抑制剂对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响

目的: 探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)抑制剂(2'Z,3'E)-6-溴靛'-3'-肟(BIO)对结肠癌SW480细胞β-catenin 、Bcl-2蛋白表达及细胞周期、凋亡的影响。方法: 应用不同浓度BIO作用于结肠癌SW480细胞,采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡,Western blotting检测β-catenin 和Bcl-2蛋白表达,免疫细胞化学检测β-catenin 及cyclin D1的表达,HE染色观察细胞形态。结果: 与BIO处理前SW480细胞相比,BIO处理组SW480细胞β-catenin蛋白表达明显上调并出现部分细胞核移位,cyclin D1蛋白表达及S期和G₂/M期细胞不同程度增多,Bcl-2蛋白表达有所下调,细胞凋亡率明显下降,并出现细胞形态改变。结论: GSK-3β抑制剂BIO作用于结肠癌SW480细胞呈现促增殖及抑凋亡作用,其机制主要与β-catenin信号转导通路激活以及与Bcl-2调控通路的平衡有关,其中β-catenin上调可能是影响结肠癌SW480细胞转归的主要因素。     

乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白促进HepG2细胞迁移并调节β-catenin表达

目的: 检测乙型肝炎病毒X蛋白相互作用蛋白(hepatitis B virus X-interacting protein,HBXIP)对HepG2肝癌细胞迁移及β-catenin表达的影响,为深入研究HBXIP与肝细胞癌发生发展的相关性奠定基础。方法: 以建立的稳定高表达HBXIP的HepG2细胞系为实验材料,Transwell 实验观察HBXIP 高表达对细胞迁移能力的影响;明胶酶谱分析法检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)的活性;免疫印迹实验检测MMP-9、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、p-GSK-3β、β-catenin及p-β-catenin的表达。结果: Transwell 实验结果表明,HBXIP 能够促进HepG2细胞的迁移能力;高表达 HBXIP 的肝癌细胞中,MMP-9的活性及蛋白表达水平均升高;免疫印迹结果表明HBXIP促进了β-catenin的表达,并抑制β-catenin的磷酸化;同时促进GSK-3β(Ser9)的磷酸化。结论: HBXIP与肿瘤细胞的迁移密切相关,HBXIP高表达促进肝癌细胞的迁移可能是其调控GSK-3β/β-catenin表达的结果。     

Notch1在肌萎缩侧索硬化症转基因鼠动物模型和细胞模型中的表达变化

目的:观察Notch1在肌萎缩侧索硬化症(ALS)转基因鼠动物模型和细胞模型中的表达情况。方法:应用免疫荧光、免疫印迹、RT-PCR,检测Notch1在95、108、122 d ALS转基因鼠脊髓中的表达变化;检测转染pEGFP-wt-SOD1和pEGFPG93A-SOD1的NSC34细胞模型中Notch1的表达变化。结果:Notch1可与β-tubulinⅢ共表达,与GFAP无明显共表达。较同窝野生型鼠,Notch1于蛋白水平和mRNA水平上的表达在95 d ALS转基因鼠脊髓中无明显变化,在108 d和122 d ALS转基因鼠脊髓中明显升高;与转染pEGFP-wt-SOD的NSC34细胞相比,转染pEGFP-G93A-SOD1的NSC34细胞中Notch1蛋白和mRNA表达增多。结论:Notch1在ALS转基因鼠动物模型和细胞模型中表达增多,提示Notch1信号通路可能与ALS相关。     

G蛋白偶联受体37(GPR37)上调促进人胶质瘤U251细胞的增殖

目的探讨G蛋白偶联受体37(GPR37)表达上调对人胶质瘤U251细胞增殖的影响。方法构建携带GPR37基因的重组质粒,采用脂质体转染法在U251细胞上调表达GPR37,采用实时荧光定量PCR检测GPR37 mRNA水平,Western blot法检测GPR37、磷酸化的蛋白激酶B[p-AKT(Ser473)]蛋白水平,CCK-8法检测U251细胞增殖情况,流式细胞术检测U251细胞的细胞周期。结果与阴性对照组相比,过表达GPR37组细胞的GPR37 mRNA和蛋白水平显著提高。上调细胞的GPR37水平后,明显增加U251细胞的增殖、G1/G0期细胞比例降低,S期和G2期细胞比例升高,并增加p-AKT(Ser473)蛋白水平。结论上调U251细胞的GPR37水平可加速U251细胞周期进程、活化AKT途径并促进细胞增殖。     

乳腺癌化疗耐药与MTDH过表达的关系及机制分析

目的探讨MTDH基因过表达对乳腺癌化疗耐药的影响及其机制。方法采用免疫组化SP法检测89例乳腺癌及癌旁组织中MTDH的表达及P-gp在乳腺癌组织中的表达。通过慢病毒感染使MCF-7乳腺癌细胞系过表达MTDH,采用CCK-8法检测MTDH过表达对乳腺癌细胞化疗耐药的影响。采用Western blot法检测MTDH过表达对乳腺癌细胞P-gp、β-catenin表达及AKT和GSK-3β磷酸化的影响。结果 MTDH在癌旁组织和乳腺癌组织中的高表达率分别为25.8%(23/89)和97.8%(87/89),MTDH在乳腺癌中的表达明显高于癌旁组织(P0.01);P-gp在乳腺癌组织中的高表达率为68.5%(61/89),乳腺癌中MTDH与P-gp表达呈显著正相关(r_s=0.568,P0.01)。在MCF-7乳腺癌细胞系中过表达MTDH,明显提高了MCF-7细胞对紫杉醇和阿霉素的耐受性,增加了P-gp和β-catenin蛋白表达水平,并且升高了p-AKT(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)的磷酸化水平(P0.05)。结论 MTDH过表达与乳腺癌的化疗耐药密切相关,MTDH过表达引起的P-gp过表达和Wnt/β-catenin信号通路活化,可能与乳腺癌化疗耐药有关。     

Akt/GSK-3β/Snail通路在TGF-β_1诱导A549/DDP细胞上皮间质转化中的作用

目的:通过观察转化生长因子β_1(TGF-β_1)诱导前后Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关分子的表达情况,探讨A549/DDP细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的分子机制。方法:TGF-β_1(5μg/L)作用48 h,观察A549/DDP细胞的形态变化,并测定EMT标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和神经型钙黏蛋白(N-cadherin)的表达情况,评估TGF-β_1是否成功诱导A549/DDP细胞发生EMT。进一步将A549/DDP细胞分为TGF-β_1(+)组、TGF-β_1(-)组和LY294002组,应用Western blot法检测各组Akt/GSK-3β/Snail通路相关分子Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平。结果:形态学观察可见TGF-β_1(+)组的细胞变得更加狭长,呈纺锤形,细胞间较为疏散,形态与间充质细胞相似。与TGF-β_1(-)组比较,TGF-β_1(+)组E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin蛋白表达上调(P0.05);各组间Akt和GSK-3β的蛋白表达水平并无明显差别,TGF-β_1(+)组的p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail蛋白水平较TGF-β_1(-)组明显增强(P0.05);PI3K抑制剂LY294002与TGF-β_1同时刺激细胞后,p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平较TGF-β_1(+)组下调(P0.05)。结论:TGF-β_1干预Akt/GSK-3β/Snail信号通路,促进Akt和GSK-3β的磷酸化,提高Snail的表达水平,诱导A549/DDP细胞发生EMT。     

人骨形态发生蛋白2和9对人胃癌MNK-45细胞增殖、凋亡和迁移的影响及其机制

 目的：研究人骨形态发生蛋白2和9（BMP2和BMP9）对人胃癌MNK-45细胞增殖、凋亡和迁移的影响,并初步探讨其作用机制。方法：用重组腺病毒AdBMP2和AdBMP9感染MNK-45细胞,采用MTT法、Hoechst 33258染色、流式细胞术(FCM)、 划痕愈合实验和Transwell小室检测BMP2和BMP9 对MNK-45细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响, Western blotting检测总GSK-3β、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）及β-catenin的表达水平。结果：(1）MTT显示AdBMP2和AdBMP9转染后,MNK-45细胞的增殖自第3 d开始被抑制并呈时间依赖性;(2）Hoechst 33258染色与FCM一致显示上调BMP2和BMP9表达可以促进MNK-45细胞的凋亡;(3） 划痕愈合与Transwell迁移实验结果一致提示上调BMP2和BMP9表达均可抑制MNK-45细胞的迁移;(4）Western blotting显示BMP2组和BMP9组的p-GSK-3β均较GFP组升高,但对β-catenin的表达量无明显影响（P>0.05）;上述结果与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：上调BMP2和BMP9表达对MNK-45细胞的增殖具有抑制作用,其机制与β-catenin无明显关系。     

cyclinD1过表达对子宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞增殖及上皮间质转化的影响北大核心CSCD

目的 探讨cyclin D1过表达对子宫颈鳞癌SiHa细胞增殖、分化的影响及其他信号分子的变化情况.方法 采用PCR法扩增cyclin D1基因全长,构建cyclin D1-pcDNA3.1质粒转染人乳头状瘤病毒16阳性的SiHa细胞,筛选cyclin D1稳定过表达细胞株.采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法和Western blot分别检测转染细胞cyclin D1 mRNA和蛋白表达.采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法绘制细胞生长曲线,采用RT-PCR法和Western blot检测转染细胞CK7、E-cadherin、波形蛋白、Snail基因的mRNA和蛋白表达;采用RT-PCR法检测增殖分化相关基因CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E、Rb、E2F、E6/E7、Ki-67基因的mRNA表达水平.对细胞同步化处理,用RT-PCR法检测细胞周期不同时间点cyclin D1及p21基因的mRNA表达情况.结果 成功构建cyclin D1稳定过表达的G-3细胞株.生长曲线及Ki-67 mRNA升高（P〈0.05）提示G-3细胞增殖速度加快,G-3细胞中波形蛋白、Snail基因和蛋白表达明显增加（均P〈0.05）,E-cadherin、CK7基因和蛋白表达明显降低,提示转染细胞发生了上皮间质转化.cyclin D1过表达后,CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E表达增加,Rb、E2F、E6/E7、p16表达无明显改变,p21与cyclin D1表达趋势基本一致,在细胞周期不同时间点表达存在波动性.结论 转染诱导cyclin D1过表达可促进SiHa细胞增殖和上皮间质转化,这一过程中伴随着CDK4、CDK2、p21、p27、cyclin E基因表达的上调.cyclin D1过表达时,p21表达量也增高,可能通过影响波形蛋白表达参与了对SiHa细胞上皮间质转化的调控.     

RNAi介导的IGF1R基因沉默对肝癌细胞生长、迁移与侵袭的影响

 目的: 研究RNA干扰(RNAi)介导的胰岛素样生长因子1受体 (IGF1R) 基因沉默对肝癌细胞生长、迁移与侵袭的影响。方法: 设计并筛选抑制IGF1R mRNA表达效率最高的siRNA序列,构建该序列的慢病毒表达载体,转染293T细胞进行病毒包装。将包装好的慢病毒感染Huh7和Hep3B肝癌细胞,筛选沉默 IGF1R 基因表达的稳定细胞株。将上述稳定细胞株扩大培养,检测细胞IGF1R mRNA表达变化,细胞生长、迁移与侵袭能力变化,以及Ki-67、p-AKT、p-ERK1、Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21、BCL-XL的蛋白表达水平变化。结果: 与空白及阴性对照组比较,感染携带 IGF1R 干扰序列慢病毒的Huh7和Hep3B肝癌细胞IGF1R mRNA表达水平显著下调,细胞增殖活性明显降低,细胞凋亡显著增加,细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制,细胞中IGF1R、Ki-67、p-AKT、p-ERK1、Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21及BCL-XL蛋白表达水平均显著降低。结论: RNAi介导的 IGF1R 基因沉默可明显抑制Huh7和Hep3B肝癌细胞生长及恶性生物学特征,这可能与IGF1R表达水平显著下调而引起上述调控细胞增殖、抗凋亡基因以及相关信号通路基因的蛋白表达水平显著降低有关。     

泛素结合酶E2T对卵巢癌细胞增殖的影响

目的 观察泛素结合酶E2T(UBE2T)对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖的影响,并探讨其机制。方法 构建UBE2T-shRNA和携带UBE2T基因的慢病毒载体,将其转染至经过培养传代的人卵巢癌细胞株SKOV3,筛选稳定株,分别记为下调组、上调组;另转染NC-shRNA阴性对照慢病毒载体至人卵巢癌细胞株SKOV3,记为阴性对照组;并取未转染的人卵巢癌细胞株SKOV3,记为空白对照组。培养72 h。噻唑蓝（MTT）法、流式细胞仪、反转录-实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹法（WB）分别检测细胞增殖抑制率、细胞周期、UBE2T及其下游相关基因和蛋白表达。结果 下调组细胞增殖抑制率、G1期细胞占比均高于其余3组（P<0.05）,S期和G2期细胞占比、UBE2T、蛋白激酶B(AKT)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA及蛋白表达、p-AKT水平均低于其余3组（P<0.05）,上调组细胞增殖抑制率、G1期细胞占比均低于阴性对照组与空白组（P<0.05）,S期和G2期细胞占比、UBE2T、AKT、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达、p-AKT水...     

PI3K/Akt途径在Aβ诱导细胞凋亡过程中的作用

目的：探讨凝聚态β-淀粉样蛋白25-35片段（Aβ25-35）诱导细胞凋亡过程中PI3K/Akt转导通路的作用。方法: MTT法检测Aβ25-35作用不同时间后PC12细胞活力的变化;Annexin V-PI双染检测Aβ25-35作用不同时间后PC12细胞的凋亡情况;Western blotting检测Aβ25-35作用不同时间后p-AktSer473、p-GSK-3βSer9的水平变化。结果: 20μmol/L Aβ25-35作用不同时间（30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h）后,MTT结果显示细胞活力均明显下降（P<0.05）;Annexin V-PI结果显示,Aβ25-35作用后均可引起细胞凋亡（P<0.05）;Western blotting结果表明,Aβ25-35作用于细胞后,p-AktSer473和p-GSK-3βSer9的表达均出现迅速的下调（P<0.05）,在作用3 h时两者的表达出现迅速的上升,在作用6 h时又出现表达的下调,两者在该时间段的变化趋势相符。p-AktSer473在Aβ25-35作用于细胞12 h后出现逐渐回升趋势,但在48 h时仍没有达到正常水平;而p-GSK-3βSer9的表达在Aβ25-35作用于细胞12 h后出现迅速的升高（P<0.05）,而后逐渐恢复到正常水平。结论: PI3K/Akt信号通路可能参与了Aβ诱导的细胞损伤,本研究为AD的发病机制及选择合适的药物作用时点提供了新思路。     

Akt信号通路在左归丸抑制左旋单钠谷氨酸大鼠神经细胞凋亡中的作用

目的:观察Akt信号通路在左旋单钠谷氨酸(MSG)和左归丸(ZGW)对成年大鼠神经细胞凋亡中的作用。方法:采用流式细胞仪和Westernblot方法检测细胞凋亡率和Akt信号通路变化。结果:MSG可增加细胞凋亡率,显著降低Akt(Ser473)和Akt(Thr308)水平;明显增加FKHR(Ser256)、GSK-3β(Ser9)和PTEN表达。ZGW可抑制MSG的部分效应。结论:左归丸能抑制MSG大鼠神经细胞凋亡,这一作用可能与Akt信号通路有关。