小鼠胚胎呼吸内胚层形态发生与咽前间充质发育及流出道分隔的关系

目的 探讨呼吸内胚层与咽前间充质细胞发育的关系及对小鼠胚胎心流出道分隔的影响。方法 45只胚龄8~13d小鼠胚胎心连续石蜡切片,用抗胰岛因子1（ISL-1）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗音猬因子（音速波状蛋白, Shh）、抗patched（Ptc1）、抗patched 2（Ptc2）、抗smoothened（Smo）及抗心肌肌球蛋白重链（MHC）抗体进行免疫组织化学及免疫荧光染色。 结果 胚龄8～9d,ISL-1阳性细胞分布在心包腔背侧壁及前肠两侧间充质,并延伸至原始心管动脉端,心管心肌显较强的Ptc1和Ptc2阳性表达。胚龄10~13d,呼吸内胚层向腹侧延伸,Ptc1和Ptc2呈较强表达,ISL-1阳性咽前间充质细胞围绕呼吸内胚层形成对称的特征性锥体形结构,经动脉囊背侧壁伸入动脉囊腔,形成主肺动脉隔。胚龄12d,主肺动脉隔ISL-1阳性表达基本消失,大部分细胞转变为α-SMA阳性细胞。 结论 呼吸内胚层的分化发育与咽前ISL-1阳性间充质细胞的发育聚集密切耦联。发育中的呼吸内胚层可能作为组织中心,通过Shh信号通路对ISL-1阳性细胞的聚集提供位置信息。呼吸内胚层的正常腹侧延伸不但可诱导ISL 1阳性细胞的正常迁移和流出道的正常分隔,对流出道的正常形态发生及有效的肺循环建立起重要作用。     

小鼠胚胎呼吸内胚层相关第二生心区的发育

目的探讨小鼠胚胎心流出道分隔过程中,前肠呼吸内胚层与咽前第二生心区细胞发育的形态学关系及机制。方法胚龄9~13d小鼠胚胎标本各6例,连续石蜡切片,用抗转录因子叉头框蛋白A2(Foxa2)、抗胰岛因子1(ISL-1)、抗patched1(Ptc1)、抗patched 2(Ptc2)、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及抗心肌肌球蛋白重链(MHC)抗体进行免疫组织化学及免疫荧光染色。结果胚龄9~9.5d,前肠腹侧壁ISL-1阳性内胚层局部增厚,呼吸内胚层开始发育,ISL-1阳性间充质细胞紧随其后开始出现在呼吸内胚层周围的基质中。胚龄10~11.5d,呼吸内胚层向动脉囊方向生长延伸向喉-气管沟演变,ISL-1阳性咽前间充质细胞围绕呼吸内胚层呈对称的特征性锥体形结构分布,锥体顶端突入动脉囊腔向主-肺动脉隔发育。在喉-气管沟发育过程中,总能观察到1条实心内胚层细胞索位于其腹侧顶端,Ptc1和Ptc2主要局限于发育中的喉-气管沟及实心细胞索表达,喉-气管沟及实心细胞索的内胚层则位于锥体结构的中心。胚龄12~13d,在流出道水平前肠分隔形成气管,内胚层细胞索逐渐消失,气管上皮逐渐失去Ptc1和Ptc2表达,气管腹侧的ISL-1阳性间充质细胞密度明显减低,并逐渐停止向流出道添加,动脉囊分隔完成。结论呼吸内胚层的分化发育与咽前ISL-1阳性第二生心区细胞的发育聚集密切耦联。音猬因子(SHH)信号系统在呼吸内胚层发育过程中活跃程度较高,发育中的呼吸内胚层可能作为组织中心,通过SHH信号通路诱导ISL-1阳性细胞的聚集,并通过内胚层生长延伸造成的机械牵拉力驱动ISL-1阳性细胞迁移,参与流出道正常形态发生。     

胰岛素增强子结合蛋白1在小鼠胚胎心的时空分布

目的 观察转录因子胰岛素增强子结合蛋白1（ISL1）在小鼠胚胎心的表达与心、第二生心区及前肠内胚层的发育。 方法 胚龄8～13d小鼠胚胎心共18个,连续石蜡切片,用抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗ISL1、抗增殖细胞核抗原（PCNA）和抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行免疫组织化学染色、免疫荧光染色和Western blotting检测。 结果 胚龄9d,ISL1阳性心前体细胞进入流出道远端。胚龄10d,ISL1阳性细胞延伸入流出道近端及静脉窦心肌。胚龄11～12d,心内ISL1表达量逐渐增多并达高峰,动脉端ISL1阳性细胞分布于流出道远端壁、心包内主肺动脉壁及主肺动脉隔,静脉端ISL1阳性细胞主要限于窦房结和静脉瓣。动脉端前肠内胚层细胞索增至最长,周围前生心区ISL1阳性细胞密度也达高峰,并且明显多于后生心区。胚龄13d,心内及第二生心区ISL1阳性细胞显著减少,内胚层细胞索趋于消失。 结论 ISL1阳性细胞在小鼠胚胎心的表达主要集中在胚龄9～13d,其表达模式与第二生心区及前肠内胚层的发育密切相关。     

小鼠胚胎心脏房室管心内膜垫发育的形态学特征

目的 探讨小鼠胚胎心脏房室管心内膜垫的形成与融合过程中的形态学特征。方法 选用抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗磷酸化组蛋白H3（PHH3）抗体,对30只胚龄9～13d小鼠胚胎连续切片进行HE和免疫组织化学染色。另选15只胚龄12d、12.5d、13d小鼠胚胎心脏制作半薄切片和超薄切片进行观察。 结果 胚龄9d,心房与心室之间可见缩窄的房室管,房室管的心胶质较厚,但未见间充质细胞出现。胚龄10d,房室管心内膜垫开始形成,但连续切片观察显示背侧心内膜垫体积大于腹侧心内膜垫,且背侧心内膜垫对应的α-SMA、MHC阳性房室管心肌向心内膜垫内有明显延伸。心内膜垫内间充质细胞不表达α-SMA或PHH3。胚龄11～12d,背、腹侧心内膜垫变得对称,垫内间充质细胞增多,偶见α-SMA或PHH3阳性细胞。胚龄12～13d,两侧房室管心内膜垫彼此接近开始融合。透射电子显微镜下观察仅部分间充质细胞相邻细胞膜彼此相贴,局部形成细胞连接。胞质内可见粗面内质网、线粒体等细胞器,微丝较少。 结论 小鼠胚胎心脏房室管心内膜垫形成时首先表现为内皮细胞由扁平变为立方形;两侧房室管心内膜垫形成不同步;房室管心内膜垫融合时间充质细胞局部形成细胞连接,胞质内微丝少,与流出道嵴融合时的超微结构特点不同。     

转录因子Tbx3在小鼠胚胎第二生心区的表达规律

目的探讨转录因子Tbx3在小鼠胚胎第二生心区(SHF)的时空表达模式,为其对SHF的调节作用提供形态学依据。方法 40只胚龄9~15 d小鼠胚胎心脏连续石蜡切片,用抗胰岛素基因增强子结合蛋白1(ISL-1)抗体、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)抗体、抗心肌肌球蛋白轻链Ⅱa(MLC2a)抗体、小鼠抗增殖细胞核抗体(PCNA)、抗Tbx3抗体进行免疫组织化学和免疫荧光双标染色。结果胚龄9 d,咽腹侧内胚层增厚,且表达Tbx3与SHF标记物ISL-1。胚龄10~12 d,咽腹侧间充质出现ISL-1阳性细胞并逐渐增多,部分细胞共表达Tbx3。动脉囊壁、心包腔背侧壁以及流出道远端壁也可见ISL-1表达,Tbx3在这些部位均呈阴性。心背侧间充质突(DMP)内可见ISL-1、Tbx3散在表达。胚龄13~15 d,DMP逐渐心肌化,同时可见Tbx3阳性细胞分布。结论 Tbx3在SHF的表达集中在咽腹侧间充质,可能参与调节SHF前体细胞的存在与增殖;但在后第二生心区(p SHF)的作用与在动脉端的SHF可能不同。     

Cx43、β-catenin、Smo在第二生心区的表达规律及意义

背景：第二生心区对于胚胎心脏发育具有重要意义，其发育异常会导致多种心脏畸形，Cx43基因敲除后第二生心区细胞的形成和增殖减少，但具体原因尚未明确。目的：(1)明确β-catenin、Smo以及Cx43在内胚层与第二生心区的表达模式，观察其有无共表达；(2)探究Cx43与Wnt/β-catenin通路或Shh通路之间是否存在相互作用，共同参与第二生心区的发育。方法：选取胚龄10-12 d的ICR小鼠胚胎石蜡包埋连续切片，进行免疫组织化学染色、苏木精-伊红染色、免疫荧光染色；剥离胚龄11 d小鼠胚胎的原始消化管用于蛋白印迹实验和免疫共沉淀。结果与结论：(1)胚龄10-12 d,Cx43与Isl1在前肠腹侧和心包腔背侧壁的部分间充质细胞呈共表达，Isl1阳性细胞增多的同时Cx43阳性细胞也增多；(2)胚龄10-12 d,Cx43与β-catenin在内胚层腹侧共表达；(3)胚龄10-12 d,Cx43与Smo在内胚层上共表达；(4)免疫共沉淀结果表明Cx43与β-catenin之间存在相互作用，共同参与第二生心区的发育。     

转录因子Nkx2.5、ISL-1表达与小鼠胚胎心的早期发育

目的:探讨转录因子Nkx2.5和ISL-1的表达与小鼠胚胎早期心发育的关系.方法:胚龄7.5～13d小鼠胚胎连续石蜡切片,用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗转录因子ISL-1、抗Nkx2.5抗体,进行免疫组织化学显色.结果:转录因子Nkx2.5在胚龄7.5d生心板表达早于心肌特异性蛋白MHC及SMA.随心外形建立,Nkx2.5在心各部表达逐渐增强.胚龄9d, Nkx2.5阳性表达从原始心管动脉端延伸至心包腔背侧脏壁中胚层及咽周围轴旁中胚层.Isl-1开始表达于胚龄8d原始心管心背系膜及前肠腹侧脏壁中胚层间充质,阳性细胞数量在11～12d达顶峰,形成前肠腹侧连接流出道远端和心房背侧壁的ISL-1阳性细胞带.11～12d,流出道远端出现Nkx2.5和MHC阴性,ISL-1、SMA阳性表达区.胚龄13d后,Nkx2.5和ISL-1在心和前肠腹侧间充质的表达强度下降.结论:Nkx2.5是原始生心区心肌前体细胞早期分化的标记蛋白,在第2生心区表达限于胚龄9d、咽周脏壁和轴旁中胚层心肌前体细胞亚群.第2生心区标记蛋白ISL-1主要表达在胚龄8～12d前肠腹侧脏壁中胚层心肌前体细胞,并向心管添加心肌细胞,参与流出道发育及心管成襻.11d后,第2生心区间充质细胞开始分化为升主动脉和肺动脉干平滑肌.     

小鼠胚胎心流出道的形态发生与呼吸内胚层发育耦联

目的 探讨小鼠胚胎心发育过程中前肠呼吸内胚层与第一生心区和第二生心区及胚胎心流出道的形态发生关系。方法 胚龄7.5～13d小鼠胚胎心各3个,连续石蜡切片,用抗胰岛素增强子结合蛋白1（ISL-1）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗Nkx2.5和抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体进行免疫组织化学或免疫荧光染色。结果 胚胎发育7.5d,ISL-1在生心板心肌前体细胞表达并与发育中的第二生心区ISL-1阳性细胞连续。胚胎发育第10～13天, 可见ISL-1强阳性的前肠腹侧呼吸内胚层细胞增生,排列不规则,     

核纤层蛋白A、转录因子TBX3、缝隙连接蛋白43表达与小鼠胚胎心发育

目的 探讨小鼠胚胎心脏工作心肌和传导系心肌在形态发生和分化过程中核纤层蛋白A（lamin A）、转录因子TBX3、缝隙连接蛋白43（Cx43）的表达特点。
方法 用抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗α-横纹肌肌动蛋白（α-SCA）、抗胰岛因子1（ISL-1）、抗Cx43、抗lamin A和抗转录因子TBX3,对46只胚龄8～15d小鼠胚胎心脏连续石蜡切片进行免疫组织化学及免疫荧光染色。 结果 胚龄9d,TBX3在原始心管的表达集中在房室管壁。10d始,TBX3阳性的表达逐渐从房室管壁沿着静脉瓣延续至窦房结、右心房背侧壁和房间隔。胚龄12～13d,TBX3阳性表达结构构成了中枢传导系雏形,包括窦房结、左右静脉瓣、房间隔、房室管、房室结和房室束。Cx43首先在胚龄9d的左心室腹侧壁和部分小梁心肌出现弱阳性表达,随着发育,Cx43逐渐在TBX3阴性的心房、心室工作心肌表达。Lamin A首先出现在10d房室管心内膜垫间充质细胞和左心室部分小梁心肌,随后在右心室小梁心肌出现,至胚龄15d,心室和心房小梁心肌及房室瓣均可见lamin A阳性表达,但致密心肌和中枢传导系心肌持续呈阴性表达。 结论 中枢传导系统雏形在小鼠胚龄13d形成,呈TBX3阳性,Cx43阴性的互补性表达。致密心肌和中枢传导系心肌在15d仍为lamin A表达阴性,说明此部分心肌分化成熟较晚。     

小鼠胚胎细胞视黄酸结合蛋白1阳性神经嵴细胞的时空分布与功能

目的 探讨小鼠胚胎心神经嵴细胞的形成、分布模式及其在心血管系统发育过程中的作用。方法 选用抗细胞视黄酸结合蛋白1（CRABP1）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗胰岛因子1（Isl-1）抗体,对45只胚龄8～12d小鼠胚胎连续切片进行免疫
组织化学染色。结果 胚龄8d,CRABP1在神经褶的外胚层未见阳性表达。胚龄8.5～9d,在心管与鳃弓水平,神经褶开始出现CRABP1阳性细胞,且有部分细胞从神经褶背侧分离进入邻近间充质。胚龄10d,神经管两侧间充质内的CRABP1阳性细胞迁移至鳃弓、弓动脉壁内皮周围以及流出道
心胶质内。胚龄11～12d,弓动脉内皮周围、流出道心内膜垫内CRABP1表达明显下降,但弓动脉管壁α-SMA阳性平滑肌细胞数量增加。主肺动脉隔及其分隔形成的升主动脉和肺动脉干管壁内均可见Isl-1阳性细胞,但未见CRABP1表达。结论 小鼠胚胎CRABP1阳性神经嵴细胞形成的时间窗
限定在胚龄8.5～9d。胚龄10d后,CRABP1阳性神经嵴细胞经过迁移,参与弓动脉中膜平滑肌和流出道心内膜垫的形成。CRABP1不能用于标记迁移后的神经嵴细胞。     

小鼠胚胎气道平滑肌发育的形态学观察

目的 探讨肌特异性蛋白质在小鼠胚胎气道平滑肌的表达特点. 方法 用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、抗α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)和抗结蛋白(Desmin)单克隆抗体,对胎龄10～18d小鼠胚胎连续石蜡切片进行免疫组织化学显色. 结果 胎龄11 ～12d,前肠分隔为腹侧的气管和背侧的食管.胎龄12d,气管起始段后壁出现α-SMA阳性细胞,提示气管平滑肌开始发育,随着向气管下段延伸,α-SMA阳性逐渐减弱,肺静脉周围仅见极少量散在的α-SMA和α-SCA阳性细胞.胎龄13d,气管平滑肌α-SMA表达增强,并开始表达较弱的α-SCA和Desmin.胎龄14d,互为镜像的“C”形α-SMA阳性平滑肌表达出现在左、右支气管壁,α-SCA和Desmin的表达强度弱于α-SMA,此时肺静脉壁呈α-SMA强阳性表达.胎龄15d,α-SMA阳性平滑肌出现在细支气管壁.胎龄17～18d,平滑肌发育已延伸至终末细支气管,并显α-SMA阳性表达,而α-SCA和Desmin表达强度开始减弱. 结论 气道平滑肌发育始于胎龄12d气管上段,逐渐向下段延伸,胎龄18d,延伸至终末细支气管;Desmin的表达标志着平滑肌细胞骨架结构形成和气道平滑肌逐渐发育成熟,有助于气道平滑肌缓慢收缩功能的完善;气道平滑肌的发育早于肺静脉管壁平滑肌.     

环杷明对马兜铃酸诱导的肾上皮细胞表型转化及Hedgehog通路的影响

目的:探讨环杷明干预Hedgehog(HH)信号对马兜铃酸(AA)致肾小管上皮细胞表型转化和基质累积的影响。方法:根据干预措施将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E分为溶剂对照组、AA损伤组(分别用终浓度为1、5和10 mg/L的AA处理细胞)和环杷明干预组(10 mg/L AA基础上加入1、5和10μmol/L环杷明)。细胞培养24 h后,用real-time PCR检测HH信号关键分子Ptch1和Smo、表型转化相关分子α-SMA和E-cadherin、ZO-1、BMP-7和基质成分I型和III型胶原mRNA的表达;ELISA法检测Shh和TGF-β1的含量;细胞免疫荧光染色检测Ptch1、Smo、E-cadherin、α-SMA和III型胶原蛋白表达。结果:AA不仅增加了TGF-β1、α-SMA和III型胶原的表达,降低了E-cadherin和ZO-1的表达,而且诱导了Shh和Smo mRNA表达的升高和Ptch1 mRNA表达的下降,提示AA促进小管上皮细胞表型转化和胶原累积,同时也激活了HH信号通路。环杷明干预AA作用后,Smo mRNA或蛋白表达下调,Ptch1 mRNA表达升高,这说明环杷明抑制了AA诱导的HH信号通路的活化。此外,环杷明也降低TGF-β1、α-SMA、I型和III型胶原的表达,提高BMP-7、ZO-1和E-cadherin的表达,这提示环杷明抑制了AA所致的上皮细胞的表型转化和基质累积。结论:环杷明可抑制AA所致的肾小管上皮细胞表型转化和基质累积,可能是通过靶向抑制HH信号的活化来实现的。     

The notch response inhibitor DAPT enhances neuronal differentiation in embryonic stem cell-derived embryoid bodies independently of sonic hedgehog signaling.

During development of the neural tube, inhibition of the Notch response as well as the activation of the Sonic Hedgehog (Shh) response results in the formation of neuronal cell types. To determine whether Shh and Notch act independently, we tested the effects of the Notch inhibitor DAPT (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) on neuralized, embryonic stem (ES) cell-derived embryoid bodies (EBs), while varying the levels of Shh pathway activation. Shh-resistant EBs were derived from Smo null ES cells, while EBs with constitutive high level of Shh pathway activation were derived from Ptc1 null ES cells. Intermediate levels of Shh pathway activation was achieved by the addition of ShhN to the EB culture medium. It was found that DAPT-mediated inhibition of the Notch response resulted in enhanced neuronal differentiation. In the absence of Shh, more interneurons were detected, while the main effect of DAPT on EBs with an activated Shh response was the precocious loss of ventral neuronal precursor-specific markers.     

Monoaminergic regulation of Sonic hedgehog signaling cascade expression in the adult rat hippocampus

Monoamines are implicated in the modulation of adult hippocampal neurogenesis in depression models and following chronic antidepressant treatment. Given the key role of Sonic hedgehog (Shh) in adult neurogenesis, we examined whether monoaminergic perturbations regulate the expression of Shh or its co-receptors Smoothened (Smo) and Patched (Ptc). Combined depletion of both serotonin and norepinephrine with para-chlorophenylalanine (PCPA) resulted in a significant decrease in Smo and Ptc mRNA within the dentate gyrus subfield of the hippocampus. However, selective depletion of serotonin, using the serotonergic neurotoxin 5,7-dihyrdroxytryptamine (5,7-DHT), or norepinephrine, using the noradrenergic neurotoxin DSP-4, did not alter expression of Shh and its co-receptors, Smo and Ptc. Acute treatment with the monoamine releasing agent, para-chloroamphetamine (PCA) significantly upregulated Smo mRNA within the dentate gyrus. However, acute or chronic treatment with pharmacological antidepressants that modulate monoaminergic neurotransmission did not regulate Shh cascade expression. These results indicate that robust changes in monoamine levels can regulate the expression of the Shh signaling cascade in the adult rodent brain.