重组小鼠Fas配体在大肠杆菌中的表达和纯化

获得纯化的由大肠杆菌表达的小鼠Ｆａｓ配体。方法：以质粒ｐＥＴ－１５ｂ为载体,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）表达小鼠的ＦａｓＬ,用多心螯合亲和层析法纯化。结果：转化菌中,重组质粒是稳定的,异丙基－β－Ｄ硫代半乳糖苷可诱导小鼠ＦａｓＬ的表达,金属螯合亲和层析法可以初步纯化此蛋白。     

Fas、Fas配体和IFN-γ在胃癌中的表达

目的：研究Fas、Fas配体(FasL)和干扰素-γ(IFN-γ)在胃癌中的表达规律及可能的意义。方法：在石蜡包埋的58例胃癌组织和其中相对应的53例癌旁正常组织中，采用免疫组化方法检测Fas、FasL蛋白的表达，采用原位杂交方法检测IFN-γ mRNA的表达。结果：胃癌组织中胃癌细胞和癌旁组织中胃上皮细胞Fas阳性率分别为19．0％和64．2％，胃癌组阳性率明显低于癌旁组(χ^2=23．46；P=0．00)。胃癌组织中胃癌细胞和癌旁组织中胃上皮细胞FasL阳性率分别为63．8％和45．3％，胃癌组阳性率明显高于癌旁组(χ^2=3．83；P=0．05)。癌旁组织中胃上皮细胞，IFN-γ阳性率为49．1％，而胃癌组织中未发现一例阳性。结论：胃癌细胞Fas—FasL系统平衡失调，本研究中胃癌细胞不表达IFN-γ，可能与胃上皮细胞癌变及免疫逃逸有关。     

Fas及Fas配体在盘状红斑狼疮皮损中的表达

目的　研究细胞凋亡与红斑狼疮发病的关系。方法　采用免疫组化法检测了 30例盘状红斑狼疮 (DL E)患者皮损及 5例正常对照皮肤 Fas及 Fas配体 (Fas L )的表达。结果　 DL E皮损中表皮角质形成细胞、真皮血管周围及部分皮肤附属器周围浸润的淋巴细胞可见较多的 Fas、Fas L阳性表达。少数毛囊、汗管可见 Fas阳性表达。正常对照的 Fas及 Fas L表达弱阳性或阴性。结论　 Fas、Fas L途径诱导的细胞凋亡可能与红斑狼疮发病有关。     

Fas及Fas配体在盘状红斑狼疮皮损中的表达

目的 研究细胞凋亡与红斑狼疮发病的关系。方法 采用免疫组化法检测了30例盘状红斑狼疮（DLE）患者皮损及5例正常对照皮肤Fas及Fas配体（FasL）的表达。结果 DLE皮损中表皮角质形成细胞、真皮血管周围及部分皮肤附属器周围浸润淋巴细胞可见较多的Fas、FasL阳性表达。少数毛囊、汗管可见Fas阳性表达。正常对照的Fas及FasL表达弱阳性或阴性。结论 Fas、FasL途径诱导的细胞凋亡可能与红斑狼疮发病有关。     

小鼠MIF在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：获得足够量的高纯度小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)重组蛋白。方法：酶切重组克隆质粒pMD18-MIF，将片段插入原核表达载体pQE31，构建相应的重组表达质粒pQE31-MIF，将此质粒转化大肠杆菌M15，得到转化子。经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Western blotting免疫印迹分析，并用Ni—NTA凝胶进行纯化。结果：MIF基因重组体构建成功，克隆的目的基因片段在M15中产生的融合表达产物在Western blotting检测中具有与抗MIF单克隆抗体发生特异性结合反应的特性。得到了纯化的目的蛋白。结论：MIF基因片段可在大肠杆菌中有效表达，表达产物可以与抗MIF单克隆抗体发生特异性结合反应，并得到纯化的MIF。     

表达人Fas配体的质粒治疗Graves病模型小鼠

目的:观察表达人Fas配体的质粒治疗Graves病模型小鼠的效果.方法:小鼠分为3组.对照组(10只)用空质粒pcDNA3.1(+)活化的脾细胞免疫后,以空质粒治疗;模型组和治疗组(各19只)均以人TSH受体(Human thyrotmpin receptor,hTSHR)活化的脾细胞进行免疫,前者不予治疗,后者甲状腺注射表达hFasL的质粒pcDNA3.1(+)/hFasL.结果:模型组47.4%的甲状腺细胞出现增生、肥大,以及甲状腺滤泡腔胶质减少,与对照组相比,TT4、TRAb升高、TSH降低(P<0.05).治疗组仅15.8%有类似甲状腺功能亢进改变,电镜下见细胞核异染色质边集,TT4、TSH、TRAb回复至对照组水平.结论:表达人Fas配体的质粒治疗Graves病模型小鼠取得一定效果.     

可溶性Fas及Fas配体在肾综合征出血热中的作用

目的：探讨可溶性Fas(sFas)及其配体（sFasL)在肾综合征出血热（HFRS）中的作用。方法：采用夹心ELISA法对60例HFRS患者（HFRS组）血浆中sFas及sFasL浓度进行了检测,并与正常对照组比较。结果：HFRS组sFas及sFasL浓度明显高于对照组,两组差异有极显著性（P＜0．01）;sFas在少尿期最高,与其他各期比较差异有极显著性（P＜0．01）;sFasL在发热期及低血压休克期最高,与其他各期比较差异有极显著性（P＜0．01）。结论：sFas及sFasL参与了ＨＦＲＳ的致病过程,sFas浓度可能与机体损伤程度有关,sFasL则可能与机体消除病毒的能力有关。     

肿瘤坏死因子和干扰素对大肠癌Fas配体表达的调控作用

目的 :探讨不同细胞因子对大肠癌细胞 Fas配体 (Fas L )表达水平的调控作用。方法 :采用 Western印迹法测定了两种细胞因子 (1× 10 6 U / L TNF-α或 IFN-γ)处理后大肠癌细胞 Fas L表达水平的变化。结果 :所检测的 6株大肠癌细胞全部表达 Fas L蛋白 ;TNF-α和 IFN-γ处理 DL D- 1细胞 10 h,显著上调其 Fas L蛋白的表达水平 ;TNF-α和 IFN-γ以及 PMA +离子霉素 (ionomycin)处理 SW6 2 0细胞 10 h,也显著上调 SW6 2 0细胞的 Fas L蛋白表达水平。 TNF-α和 PMA +离子霉素处理SW6 2 0细胞 48h进一步增加 SW6 2 0的 Fas L 蛋白表达 ,IFN- γ处理 SM6 2 0则表达增加不明显。结论 :TNF- α和 IFN- γ等细胞因子具有上调某些大肠癌细胞 Fas L 表达的作用     

红景天对小鼠脾Fas配体及穿孔素蛋白表达的影响

目的：实验拟研究红景天对小鼠脾Fas配体及穿孔素蛋白表达的影响,为进一步探讨红景天的免疫药理机制,为研制开发免疫新药提供理论依据。方法：本研究以红景天为试验药物,以小鼠为试验动物,通过灌胃法连续给药,采用RT-PCR技术,观察了红景天对小鼠脾组织免疫分子Fas配体及穿孔素等水平的影响。结果：实验结果显示试验组小鼠脾脏免疫分子Fas配体及穿孔素为阳性表达,实验组与对照组比较差异显著（P〈0.01）,提示红景天能使淋巴细胞活性增强。结论：红景天能够有效的促进小鼠的免疫功能,增强小鼠脾组织免疫分子Fas配体及穿孔素的表达水平,此研究结果为中药免疫机理的研究提供了新的材料。     

可溶性Fas及Fas配体在肾综合征出血热中的作用

探讨可溶性Fas(sFas)及其配体(sFasL)在肾综合征出血热(HFRS)中的作用。方法 采用夹心ELISA法对60例HFRS患者(HFRS组)血清中sFas及sFasL浓度进行了检测,并与正常对照组 比较。结果HFRS组sFas及sFasL浓度明显高于对照组,两组差异有极显著性(P<0.01);sFas在少尿期最高,与其他各期比较差异有极显著性(P<0.01);sFasL在发热期及低血压休克期最高,与其他各期比较差异有极显著性(P<0.01)。结论sFas及sFasL参与了HFRS的致病过程,sFas浓度可能与机体损伤程度有关,sFasL则可能与机体消除病毒的能力有关。     

重组人源胰岛素原C肽在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化(英文)

目的:构建一种新型表达载体(pEDCC),表达并纯化得到人源胰岛素原C肽。方法:将编码截短的门冬酰胺酶突变体(ansB-C),天然C肽,人IgG1铰链区(hinge),额外的酸敏感二肽(DP)以及富含碱性氨基酸的8肽(KRKRKKSR)的核苷酸序列依次分别插入pET28a载体中,构建表达载体pEDCC。在乳糖的诱导下,融合蛋白ansB-C-hinge-DPKRKRKKSRNGS-GR-C-peptide以包涵体形式高效表达。融合蛋白经洗涤和乙醇分级沉淀纯化后,通过酸水解将PKRKRKKSRNGSGR-C-peptide释放出来。C肽N端14肽用胰蛋白酶切割,通过DE52柱与C-peptide分离。结果:构建的表达载体pEDCC序列正确,融合蛋白经分离纯化得到了高纯度的重组人源胰岛素原C肽。结论:以截短的门冬酰胺酶作为融合伙伴,并以富含碱性氨基酸的8肽调节等电点是一种生产重组人源胰岛素原C肽的有效方法。     

IL-18在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

目的：研究人IL-18成熟蛋白（mhIL-18）在大肠杆菌中的高效的非包涵体表达以及纯化方案。方法：利用PCR方法扩增出mhIL-18基因，构建融合型表达载体pPTYB1-IL18，转化入大肠杆菌ER2566中，IPTG诱导表达，优化表达条件，超声裂解细胞，采用SDS-PMGE和Weslern blot分析重组蛋白的表达，亲和层析后用MTT法检测表达mhIL-18的活性。结果：成功构建载体并转化入ER2566后，经IPTG诱导，表达量可占菌体总蛋白的26％以上，其中80％以上的mhIL-18融合蛋白以可溶、有活性的形式存在。亲和层析后的mhIL-18纯度可达95％，具有显著的IL-18的生物学活性。结论：成功的在大肠杆菌中的高效以非包涵体表达mhIL-18，并具有显著的IL-18的生物学活性。     

重组人白细胞介素－3在大肠杆菌中表达及纯化研究

将化学合成的人白细胞介素－３（ｈＩＬ－３）基因与表达质粒ｐＫＫ２２３－３重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０５，重组菌在摇瓶中发酵并诱导表达，表达产量达菌体蛋白质总量的５３％以上。发酵菌经超声破碎后得到包含体，经洗涤处理使包含体纯度达９０％以上。用８ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍溶解包含体后直接透析复性，复性液经Ｓｅｐｈｏｒｏｓｅ－ＳＰ离子交换层析，得到纯化的重组ｈＩＬ－３，纯度达９８％。用ＴＦ－１细胞进行体外检测活性，比活达到１０８单位／ｍｇ蛋白质。本研究为重组人白细胞介素－３的大规模生产提供了条件。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ在大肠杆菌中的高效表达及纯化

目的:获得高纯度的人心肌肌钙重组蛋白,为临床上检测心肌损伤及预后提供新的诊断方法.方法:利用RT-PCR方法从人心肌细胞的cDNA文库中扩增编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA,并克隆到大肠杆菌表达载体中,表达含凝血酶识别序列的MS2-cTnI 融合蛋白,纯化后用Western-blot进行鉴定.结果:从人心肌cDNA文库中扩增出编码人cTnI的cDNA,克隆并在大肠杆菌中表达,表达量达30%以上.经离子交换柱纯化,最终产物纯度在95%以上.可与其特异性单克隆抗体反应.结论:cTnI能够在大肠杆菌中高效表达和纯化,为今后检测心血管疾病提供了一种高效快捷的方法.     

重组人骨形态发生蛋白-2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白-2(hBMP-2)。方法hBMP－2原核表达载体pYR(pBV220－hBMP-2)转化 E coli BL21,SDS－PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析 DEAE和分子筛 S－300纯化重组蛋白,自然缓降复性法对其复性。结果SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带,而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时,其表达效率较高;在此状态下,温度诱导衣达4h,目的蛋白表达量最高,以后随着时间的延长,表达量稍下降。重组蛋白经纯化后植人小鼠肌肉,组织学观察到肌肉内大量间允质细胞增生以及软骨与骨形成。结论重组hBMP－2具有良好异位成骨活性。     

重组人骨形态发生蛋白—2在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2)，方法：hBMP-2原核表达载体pYR(pBV220-hBMP-2)转化E.coli BL21,SDS-PAGE分析工程菌活化状态以及诱导时间与目的蛋白表达率的关系。离子交换层析DEAE和分子筛S－300纯化重组蛋白，自然缓降复性法对其复性。结果：SDS－PAGE显示在相对分子质量约为13000时出现明显外源蛋白表达带，而且当工程菌30℃活化至D600约为0．45时，其表达效率较高，在此状态下，温度诱导表达4h，目的蛋白表达量最高，以后随着时间的延长，表达量销下降，重组蛋白经纯化后植入小鼠肌肉，组织学观察到肌肉内大量间充质细胞增生以及软骨与骨形成，结论：重组hBMP-2具有良好异位成骨活性。     

重组鼠源性肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达

目的：制备能在原核表达系统中表达并特异性识别(Asp)₄-Lys序列的鼠源性肠激酶,为 推广应用重组肠激酶提供技术平台。方法：采用RT-PCR从C57BL/6J小鼠的十二指肠肠系膜黏膜组织中钓取肠激酶轻链的cDNA,将其克隆入pET32a原核表达载体中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,然后以镍亲和层析法对表达产物进行纯化。结果：所钓取的肠激酶轻链编码序列与GenBank中的序列一致,比较发现其编码的氨基酸序列在小鼠与人、牛之间的同源性大于75%。利用pET32a/BL21(DE3)表达系统成功地在大肠杆菌中表达了重组鼠源性肠激酶轻链,表达量约占大肠杆菌BL21(DE3)总蛋白的30%,但多以包涵体的形式存在。经镍亲和层析法纯化的重组肠激酶多以聚体形式存在。结论：鼠源性肠激酶轻链在原核细胞中多以包涵体形式表达,天然构象重组肠激酶的获得还需对表达系统进行优化。     

NNMT基因重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达

目的利用p GEX—4T-2表达系统表达制备尼克酰胺N-甲基转移酶（NNMT）抗原。方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi：12652950人NNMT cDNA序列，设计合成编码NNMT的DNA引物，并分别在5’端和3’端设计BamHI和XhoI位点，利用RT-PCR从人肝组织中克隆NNMT基因，经T—A克隆、亚克隆至p GEx-4T-2表达载体，重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR（DE3），经异丙基-β—D-硫代乳糖苷诱导表达，Glutathione Sepharose 4B亲和层析制备融合蛋白（GST-NNMT）。通过DNA测序来证实质粒p GEX-4T-2／NNMT的正确性，SDS—PAGE电泳以及Western—blot判断GST-NNMT蛋白的准确性。结果限制性内切酶和DNA测序结果表明，编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到 p GEX-4T-2多克隆位点，成功构建表达质粒p GEX-4T-2，NNMT。菌液超声破碎后，融合蛋白主要存在于裂解上清液中，表达量约占菌体总蛋白表达量的20％，每升菌液可表达融合蛋白约4．5mg。Western-blot证实制备的蛋白为GST-NNMT。结论成功地利用基因重组技术制备了NNMT，为制备抗NNMT单克隆抗体和ELISA试剂盒打下基础。     

Expression and purification of recombinant human chemokine SDF—1βin E.coli

Objective: To obtain recombinant human SDF-1β expressed in E. coli and purify SDF-1β with biological activity from the bacterium. Methods: A thioredoxin-SDF-1β fusion protein (26 × 103) composed of230 amino acid residues was expressed in E. coli AD494 (DE3)pLysS under the induction of IPTG when pET32a(+)-SDF-1β was used as an expression vector. Purified SDF-1β was produced through following procedures: Bacteria lysis, metal-chelated affinity chromatography (MAC), enterokinase digestion to separate SDF-1β from fusion protein, cation exchange chromatography (CEC) and reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). Western blot with anti-SDF-1β monoclonal antibody (mAb), N-terminal amino acid sequencing, ligand-binding assay and cytosensor/microphysiometry were used to investigate the biochemical characters and biological activities of the purified SDF-1β. Results: From 10% to 15% of total bacterium protein was expressed as fusion protein. Approximately 400μg purified SDF-1β (7. 8 × 103) consisting of 71 amino acid residues were produced from 1 L of fermented bacteria. Western blot showed that anti-SDF-1β mAb bound with the purified SDF-1β specifically. N-terminal amino acid sequencing indicates that N-terminus of purified SDF-1β possessed as the same amino acid sequence as nature one. Purified SDF-1β not only had the binding activity with CXCR4 expressing cells [Kd = ( 12.20± 2. 99) nmol/L ], but also activated CXCR4 expressing cell signaling specifically in a dose-dependence manner. Conclusion: The purified recombinant human SDF-1β produced with this method possesses biochemical characters and biological activities as same as those nature human SDF-1β.     

重组NADPH-细胞色素P450还原酶在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 在大肠杆菌中表达重组NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)并纯化获得有活性的CPR蛋白。方法 将已构建的NADPH-细胞色素P450还原酶重组质粒pMWl72a-CPR采用温和转化法转入大肠杆菌BL-21中,依次使用超速离心、DE52纤维素阴离子交换层析和2’-5’ADP亲和层析的方法纯化CPR,并检测酶的活性。结果 获得了纯度达99％以上的可溶性CPR蛋白,纯化倍数5、20倍,检测酶的比活性为每分钟1045．49nmol／mg。结论获得了纯度高、有活性的CPR蛋白,可作为工具酶用于某些相关酶的研究,同时也为CPR的工业纯化提供了可行的参考路线。