绿色荧光蛋白表达对检测胶质细胞瘤体内侵袭的意义

利用体外转染绿色荧光蛋白基因的胶质瘤细胞大鼠移植瘤模型,研究胶质瘤体内侵袭行为。方法：携有增强型绿色荧光蛋白（ＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ,ＥＧＦＰ）基因的ｐＥＧＦＰ－Ｎ３质粒体转染Ｃ６胶瘤细胞,筛选稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆,并作流式细胞仪和电镜检测,以立体定向法植入ＳＤ大鼠脑实质内建立大鼠移植模型。４周后处死大鼠并作鼠脑连续石蜡切片,相邻切片分别作苏木素－     

人CD34分化抗原转录调控序列的克隆与调控表达

目的：克隆有特异调控活性的人ＣＤ３４基因５’端转录调控序列。方法：根据已知的ＣＤ３４抗原基因５’－端启动子调控序列,自行设计２对引物,用巢式－ＰＣＲ方法从染色体ＤＮＡ中成功的克隆６６１ｂｐ长度的ＣＤ３４抗原转录调控序列（ＣＤ３４ＴＲＳ,ＣＤ３４ＴＲＳ片段插入启动子报告质粒ｐＥＧＦＰ－１,观察重组质粒ｐＣＤ３４ＥＧＦＰ在造血系细胞和非造血系细胞中的调控表达作用。结果：经限制性内切酶酶切鉴定及ＤＮＡ序列分析证实,克隆的ＣＤ３４启动子序列与文献报道的顺序基本一致,能特异调探ＥＧＦＰ基因在造血细胞系细胞Ｋ５６２中表达。结论：所克隆的人ＣＤ３４分化抗原转录调控序列有特异调控真核基因表达作用,本研究为构建造血干细胞特异性表达载体奠定了基础。     

HSP90β蛋白低调肿瘤细胞系的建立 *

目的：通过转染ＨＳＰ９０β反义核酸重组子ｐｃＤＮＡ－ＨＳＰ９０于４株人消化系肿瘤细胞系,以建立ＨＳＰ９０β蛋白低调肿瘤细胞系,并研究ＨＳＰ９０β蛋白低调后细胞的生长情况。方法：用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导将ｐｅＤＮＡ－ＨＳＰ９０转染人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１、人胃癌多药耐药细胞系ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ、人肝癌细胞系ＨＣＣ７４０２及人食道癌细胞系Ｅｃ１０９,用Ｇ４１８进行筛选,用ＲＮＡ酶保护分析法鉴定ＨＳＰ９０β反义核酸的表达,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测ＨＳＰ９０β蛋白的表达。用细胞生长曲线研究基因转染细胞的生长情况。结果：ｐｃＤＮＡ－ＨＳＰ９０转染细胞ＡＨ－ＳＧＣ７９０１,ＡＨ－ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,ＡＨ－ＨＣＣ７４０２及ＡＨ－Ｅｃ１０９有ＨＳＰ９０β反义ＲＮＡ表达,这些细胞ＨＳＰ９０β蛋白表达低调。研究还发现这些细胞的生长受到不同程度的抑制,其中ＡＨ－ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ及ＡＨ－Ｅｃ１０９细胞受抑程度更明显。结论：ｐｃＤＮＡ－ＨＳＰ９０转染细胞ＡＨ－ＳＧＣ７９０１,ＡＨ－ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,ＡＨ－ＨＣＣ７４０２及ＡＨ－Ｅｃ１０９　ＨＳＰ９０β蛋白表达降低,细胞的生长受到不同程度的抑制。     

增殖细胞核抗原基因反义RNA表达质粒的构建及对人胃癌细胞的抑瘤效应

目的观察增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因反义ＲＮＡ表达质粒对人胃癌细胞生长特性的影响，探讨其抗肿瘤作用。方法用ＤＮＡ重组方法将人ＰＣＮＡ基因反向克隆到真核表达质粒ｐＤＯＲｎｅｏ中，构建成人ＰＣＮＡ基因真核表达质粒ｐＤＲＰＣＮＡ，用脂质体介导转染人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１。结果经Ｇ４１８筛选获得转染细胞ＳＧＣ／ＰＣＮＡ，与亲本细胞相比，其生长速度减慢，ＲＮＡ、蛋白质的生物合成受到抑制，Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期ＤＮＡ含量降低。结论ＰＣＮＡ基因反义ＲＮＡ对胃癌细胞的生长具有明显的抑制作用。     

H—ras癌基因与肝癌转移行为的关系探讨

我们应用基因转移技术,研究了Ｈｒａｓ癌基因对肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１细胞转移的影响,以探讨Ｈｒａｓ基因与肝癌转移行为的关系。１　材料与方法１．１　材料载体质粒ＰＳＶ２ｎｅｏ及载有活化的Ｈｒａｓ基因的重组质粒ＰＳＶ２ｎｅｏｒａｓ由上海复旦大学生物物理系惠赠,人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１由本所细胞室提供。磷酸钙转染试剂盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。ＤＡＣＤｐ２１ｒａｓ抗体购自Ｓｉｇｍａ公司,它可特异性识别ｐ２１ＨｒａｓＣ末端１２６～１４０氨基酸区域ｃⅣａｓｅ抗体,ＥＧＦＲ抗体购自Ｏｎｃ…     

癌胚抗原真核表达质粒构建与鉴定

目的：癌胚抗原（ＣＥＡ）是一种重要的肿瘤相关抗原，同时也是针对某些肿瘤治疗的有效靶抗原，为探讨运用表达ＣＥＡ的重组质粒进行抗肿瘤治疗的可行性，本研究构这两套表达ＣＥＡ的真核重组质粒。方法：运用基因工程技术将编码人ＣＥＡ的全长２．４ｋｂｃＤＮＡ分别插和到直核表达载体ｐｃＤＮＡ３及ＶＲ１０１２中，并用多种限制性内切酶对重组质粒进行酶切鉴定。结果：构建的重组质粒均含有２．４ｋｂＣＥＡ片段，且插入ｐｃＤＮ     

染色体3p14.2-14.3区域一个与鼻咽癌相关新基因的克隆

目的：在染色体３ｐ１４．２－１４．３区域寻找与鼻咽癌发生发展密切相关的新基因。方法：运用ＲＡＣＥ方法获取基因全长ｃＤＮＡ序列,ｐＥＧＦＰ质粒和脂质体共转染ＣＯＳ７细胞进行新基因的蛋白质定位。结果：在３ｐ１４．２－１４．３区域克隆了一个在鼻咽癌中表达不调新基因的全长ｃＤＮＡ序列,被命名为ＣＰＣＤＲ１,编码１０９个氨基酸,其蛋白质聚集在细胞核内,其基因组由２个外显子和１个内含子组成。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印     

几种脂质体及其转铁蛋白复合物对肺癌细胞系转基因效率的比较研究

目前 ,体细胞基因转移载体包括两大类 :一是病毒载体介导的基因转移 ;另一是非病毒载体介导的基因转移。本次实验研究主要通过对比观察ＳＡ脂质体、Ｅｓｃｏｒｔ脂质体及其转铁蛋白复合物对肺癌细胞系Ａ5 49的转基因效率。实验分组 :①对比观察Ｅｓｃｏｒｔ脂质体、ＳＡ脂质体及Ｅｓ ｃｏｒｔ 饱和转铁蛋白复合物介导的转基因效率 :空白对照组(实验过程中不加ＤＮＡ、脂质体或其复合物 ) ;单质粒组 (只加入ｐＣＭＶβ Ｇａｌ) ;质粒 ＳＡ脂质体组 (ｐＣＭＶβ Ｇａｌ∶ＳＡ =1∶10 ,ｗ/ｗ) ;质粒 Ｅｓｃｏｒｔ脂质体组 (ｐＣＭＶβ Ｇａｌ…     

携带XylE基因的穿梭质粒诱变分析系统在诱变剂检测中的应用

以邻苯二酚氧化酶基因－ｘｙｌＥ为靶基因，以新霉素抗性基因ｎｅｏ为选择基因构建的ｐＥＳｎｘ穿梭质粒转染人羊膜细胞ＦＬ，得到一株携带有完整的自主复制型ｐＥＳｎｘ质粒的Ｇ４１８抗性细胞株ＦＥＳｌ．７。经测定该细胞株平均每细胞含有质粒２６个拷贝，且在８个月的传代培养中保持稳定，ｐＥＳｎｘ质粒在ＦＥＳ１．７细胞内ｘｙｌＥ基因的自发突变率仅４．３×１０－５。因此由ＦＥＳ１．７细胞构成的系统可在人体细胞中进行诱变检测。该系统灵敏度高，可对低效诱变剂在人体中引起的基因突变进行检测，而且特别适合于研究人体细胞中基因突变的分子机制。利用此ＥＢＶ－ｘｙｌＥ穿梭质粒诱变分析系统我们已对ＥＭＳ进行了诱变分析，对于ＦＥｓ１．７细胞，１８９ｕＭＥＭＳ诱发的ｘｙｌＥ基因突变超过自发突变频率达２２倍。ＥＭＳ处理细胞２４小时能引起细胞内的质粒在ｘｙｌＥ基因座位上发生缺失突变。     

小鼠Egr-1基因启动子的克隆及其辐射诱导基因表达

目的：研究克隆小鼠Ｅｇｒ－１基因启动子及其辐射诱导基因表达特征。方法：用合成的一对引物,以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠基因组为模板,扩增出４４９ｂｐ大小含６个ＣＣ（Ａ／Ｔ）６ＧＧ基序的序列,通过亚克隆技术分别将其插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡ测序载体和ｐＨＧＦＰ－Ｓ６５Ｔ报告载体中,利用测序载体对克隆的ＤＮＡ序列进行分析。报告质粒载体经Ｌｉ－ｐｏｆｅｃＴＡＭＩＮＥ脂质体介导转染ＣＯＳ－７细胞后给予γ射线照射或Ｈ     

真核表达载体ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ-ＫＡＩ１的构建及其在胆管癌细胞的表达

目的　构建真核表达载体ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ-ＫＡＩ１,并在胆管癌细胞系ＱＢＣ９３９中进行表达。方法　采用ＲＴ-ＰＣＲ法从人胆管组织中克隆ＫＡＩ１基因,连接Ｔ载体并测序正确后与真核表达载体ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ连接,经ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ双酶切鉴定后通过脂质体法转染ＱＢＣ９３９细胞中,用荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）的表达,用免疫组化染色的方法检测细胞中ＫＡＩ１的表达。结果　成功构建真核表达载体ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ-ＫＡＩ１,用脂质体法转染胆管癌细胞ＱＢＣ９３９后,经荧光显微镜和免疫组化染色法检测可见细胞内有ＥＧＦＰ及ＫＡＩ１的表达。结论　真核表达载体ｐＩＲＥＳ２-ＥＧＦＰ-ＫＡＩ１构建成功并在胆管癌细胞ＱＢＣ９３９中得到稳定表达,为研究ＫＡＩ１对肿瘤的生物学作用以及ＫＡＩ１在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础。     

转染外源p53基因在荷瘤裸鼠人肠癌细胞中表达的检测

采用直接注射外源ＤＮＡ－脂质体复合物的方法分别在荷瘤裸鼠人肠癌组织中转染外源正义ｐ５３ｃＤＮＡ和反义ｐ５３ｃＤＮＡ的重组表达质粒及非整合型哺乳动物表达载体ｐＲＥＰ９，并以注射等量生理盐水为对照，然后应用链菌素亲生物蛋白－过氧化酶免疫组化法检测肿瘤组织中突变型ｐ５３蛋白的表达。结果表明：体外培养ＳＷ１１１６细胞中约有５０％为突变型ｐ５３蛋白阳性；转染反义ｐ５３ｃＤＮＡ表达质粒组的裸鼠移植瘤细胞ｐ５３蛋白阳性率为２５％，而注射生理盐水、转染ｐＲＥＰ９及正义ｐ５３ｃＤＮＡ表达质粒组阳性率分别为６６．７％，７７．８％，６６．７％；前者与后三者之间有显著住差异（Ｐ＜０．０１，Ｘ［２］检验），但各组间肿瘤大小并无显著性差异。据此认为，肿瘤体内直接转染外源反义ｐ５３基因能封闭肠癌ＳＷ１１１６细胞中突变型ｐ５３基因的表达。     

多聚阳离子对非病毒载体转移效率的影响*

目的：制备Ｔ淋巴瘤ＴＣＲＶβ核酸疫苗。方法：利用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出人Ｔ淋巴瘤细胞Ｊｕｒｋａｔ的ＴＣＲ　Ｖβ基因片段,并将其重组入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３。用重组表达载体转染ＳＰ２／０细胞,在ｍＲＮＡ水平上检测其表达。再用ｐｃＤＮＡ３和重组载体分别免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,收集抗血清,用免疫组化技术检测抗体产生情况。结果：扩增出ＴＣＲ Ｖβ的基因片段,测序结果证实其序列与已发表的一致。并构建出重组表达载体ｐｃＤＮＡ３－ＴＣＲ Ｖβ。该质粒转染到 ＳＰ２／０细胞,可在ｍＲＮＡ水平上检测到其表达。在用ｐｃＤＮＡ３－ＴＣＲＶβ免疫的小鼠抗血清中检测到抗Ｊｕｒｋａｔ细胞 ＴＣＲ Ｖβ的抗体。免疫组化结果表明,该血清不与表达 ＴＣＲγδ的人Ｔ淋巴瘤细胞发生反应,而与转染该基因的ＳＰ２／０细胞产生强阳性反应。正常小鼠血清与ｐｃＤＮＡ３免疫的小鼠血清与Ｊｕｒｋａｔ细胞不产生显色反应。结论：所制备的Ｔ淋巴瘤ＴＣＶβ核酸疫苗能有效地诱导机体产生体液兔疫反应。     

表皮生长因子受体和血管内皮生长因子在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的　观察非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）组织中表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）和血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的表达情况以及与临床病理参数的关系。方法　免疫组织化学法检测７６例ＮＳＣＬＣ组织和１４例非恶性肺组织ＥＧＦＲ和ＶＥＧＦ的表达。结果　ＥＧＦＲ和ＶＥＧＦ在７６例ＮＳＣＬＣ组织中的阳性表达率分别为４７.４％（３６／７６）和５１.３％（３９／７６）,在１４例非恶性肺组织表达率分别为７１４％（１／１４）和７.１４％（１／１４）,两组ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ表达差异显著（Ｐ＜０.０５）。Ⅲ期ＮＳＣＬＣ组织的ＥＧＦＲ表达率为５６.８％（２５／１９）,高于Ⅰ ～Ⅱ期患者的３１.３％（１０／３２）,两者差异显著（Ｐ＜０.０５）,ＥＧＦＲ表达与其他临床病理参数均无关;淋巴结阳性的ＮＳＣＬＣ组织ＶＥＧＦ表达率为７７.８％（２８／３４）,明显高于淋巴结阴性的２７.５％（１１／４２）,两者差异显著（Ｐ＝０.０００）,ＶＥＧＦ表达与肿瘤分期、性别、年龄、肿瘤细胞分化等临床病理参数亦无关。ＥＧＦＲ和ＶＥＧＦ在ＮＳＣＬＣ组织中表达无相关性（Ｐ＞０.０５）。结论　ＮＳＣＬＣ组织中ＥＧＦＲ和ＶＥＧＦ常常为高表达,ＥＧＦＲ表达与肿瘤的ＴＮＭ分期有关,ＶＥＧＦ与淋巴结转移有关;但是ＥＧＦＲ和ＶＥＧＦ的表达之间无相关性。     

AnnexinI基因转染对BEP2D细胞生长的影响

研究ＡｎｎｅｘｉｎⅠ基因ｃＤＮＡ转染对生化人支气管细胞系ＢＥＰ２Ｄ生长的影响。方法：ｐＴ７Ｔ３Ｄ质粒经ＮｏｔⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切获得 人ＡｎｎｅｘｉｎⅠ基因ｃＤＮＡ片段，亚克隆至真核表达载体ｐＣＩ－ｎｅｏ，构建人ＡｎｎｅｘｉｎⅠ基因真核表达载体ｐＣＩ－ＡＸＩ。通过采用脂质体介导转染技术，将ＡｎｎｅｘｉｎⅠ的真核表达重组质粒和空载体质粒分别导入永生化人支气管管细胞系ＢＥＰ２Ｄ；合成ＡｎｎｅｘｉⅠ反应寡     

CpG-ODN对树突状细胞的分化成熟的影响

目的：探讨ＣｐＧ－ＯＤＮ对小鼠骨髓来源的树突状细胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ,ＢＭＤＣ）分化成熟的影响。方法：利用合成的含非甲基化ＣｐＧ基序的寡核苷酸（ＧｐＧ ｍｏｔｉｆ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ,ＣｐＧ－ＯＤＮ）,通过酶切鉴定ＤＮＡ制品ＣｐＧ基序甲基化程序,ＦＡＣＳ分析ＤＣ表型和内吞作用的变化,ＥＬＩＳＡ检测ＤＣ培养上清     

环境致癌(突变)物和药物代谢相关的人细胞色素P450 cDNA的克隆和转基因细胞系的建立

目的：建立环境致癌（突变）物和药物代谢相关的人细胞色素Ｐ４５０１Ａ２,２Ａ６,２Ｅ１,３Ａ４ｃＤＮＡ的克隆和转基因细胞系。方法：从人肝组织中提取总ＲＮＡ,用逆转录酶生成ｃＤＮＡ。以各个ｃＤＮＡ编码序列两端设计引物,ＰＣＲ扩增各个人细胞色素Ｐ４５０基因的ｃＤＮＡ,并将其连接到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－Ｔ或ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,通过内切酶图谱分析及全序列测定,再将该ｃＤＮＡ片段重组于哺乳动物细胞表达质粒ｐＲＥＰ９。用改良磷酸钙共沉淀法转入ＣＨＬ细胞中,通过Ｇ４１８抗性筛选,扩大培养。提取细胞的Ｓ９组分,…     

腺病毒介导HSV-tk联合野生型p53 基因对直肠癌细胞的杀伤作用

应用自杀基因治疗肿瘤是一种有效的手段和方法 ,但ｐ53基因突变的肿瘤细胞可以对抗自杀基因转换前药对瘤细胞的杀伤作用。为克服突变ｐ53对自杀基因杀伤作用的影响 ,我们用腺病毒介导单纯疱疹病毒编码的胸苷激酶 (ＨＳＶ ｔｋ)基因和人野生型ｐ53基因共转染ＳＷ83 7直肠癌细胞 ,该细胞ｐ53基因第 2 4 8密码子发生了突变 ,观察ＨＳＶ ｔｋ/ＧＣＶ系统和ｐ53基因联合对肿瘤细胞的杀伤作用。将ＨＳＶ ｔｋ、人野生型ｐ53ｃＤＮＡ插入ｐＡｄＣＭＶ Ｌｉｎｋ1穿梭质粒多克隆位点 ,构建ｐＡｄＣＭＶ Ｌｉｎｋ1 (ｔｋ/ｐ53 ) ,ｐＡｄＣＭＶ Ｌｉｎ…     

干扰素诱导跨膜蛋白１对结肠癌ＳＷ４８０细胞株侵袭和转移能力的影响

目的　研究干扰素诱导跨膜蛋白１（ＩＦＩＴＭ１）对结肠癌ＳＷ４８０细胞株侵袭和转移的影响。方法　构建ＩＦＩＴＭ１／ｐＥＧＦＰ-Ｃ３重组质粒并且转染大肠癌细胞株ＳＷ４８０,免疫荧光显微镜和激光共聚焦显微镜（ＬＣＳＭ）、ＲＴ ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定ＩＦＩＴＭ１／ｐＥＧＦＰ-Ｃ３重组质粒。Ｇ４１８筛选稳定过表达ＩＦＩＴＭ１的ＳＷ４８０细胞株（ＩＦＩＴＭ１／ＳＷ４８０）,细胞侵袭性实验、明胶酶法测定ＭＭＰ-２和ＭＭＰ-９活性,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＭＭＰ-９蛋白表达及ＩＦＩＴＭ１／ＳＷ４８０侵袭和转移能力。结果　成功构建ＩＦＩＴＭ１／ｐＥＧＦＰ-Ｃ３重组表达质粒,获得ＩＦＩＴＭ１／ＳＷ４８０细胞株;细胞侵袭实验显示ＳＷ４８０细胞、ＩＦＩＴＭ１／ＳＷ４８０细胞的细胞穿透数分别为（４４８.６４±３８.０９）个和（５４０.４５±４４.６１）个,差异有统计学意义（Ｐ＜０.０１）;明胶酶法测定显示ＩＦＩＴＭ１／ＳＷ４８０细胞ＭＭＰ-２、ＭＭＰ-９活性较ＳＷ４８０和ｐＥＧＰＦ／ＳＷ４８０细胞明显增强。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎ显示ＩＦＩＴＭ１／ＳＷ４８０细胞ＭＭＰ-９表达水平明显高于ＳＷ４８０和ｐＥＧＦＰ／ＳＷ４８０细胞株。结论　ＩＦＩＴＭ１可增加大肠癌ＳＷ４８０细胞株侵袭和转移的能力。     

THE EFFECT OF ACTIVE COMPONENTS OF LYCIUM BARBARUM AND GARLIC（LB－GO）ON THE SYNTHESIS OF DNA AND ULTRASTRUCTURE OF U_（14） CERV

ＴＨＥＥＦＦＥＣＴＯＦＡＣＴＩＶＥＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳＯＦＬＹＣＩＵＭＢＡＲＢＡＲＵＭＡＮＤＧＡＲＬＩＣ（ＬＢ－ＧＯ）ＯＮＴＨＥＳＹＮＴＨＥＳＩＳＯＦＤＮＡＡＮＤＵＬＴＲＡＳＴＲＵＣＴＵＲＥＯＦＵ_（１４）ＣＥＲＶＩＸＣＡＮＣＥＲＣＥＬＬＳＩＮＭＩＣ?..