套式PCR扩增特定SSU rRNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrRNA）基因为靶基因,选用1对疟原虫属特异性引物和4对种特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp、102bp和115bp预期大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％。并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.f.和P.m.的混合感染病例。结论本系统特异、灵敏、稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

套式PCR扩增特定SSUrDNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的：用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法：以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrDNA）基因为靶基因,选用1对疟原属特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果：从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp,102bp和115bp预测大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％,并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.F.和P.m.的混合感染病例,结论本系统特异、灵敏,稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断,大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的　采用套式 PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。　方法　采用已建立的套式 PCR系统扩增 SSU r DNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的 6份血样 ,并设阳性与阴性对照。　结果　间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出 10 4 bp、10 2 bp和 115 bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫 DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。 6份血样中检出 4份 P.v.、P.f.和 P.m.的混合感染 ,1份 P.v.和 P.f .及 1份 P.f .和 P.m.的混合感染。　结论　该系统特异、灵敏、稳定 ,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染 ,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。     

复式PCR检测间日疟原虫和恶性疟原虫的现场应用

目的探讨复式PCR方法在疟疾诊断中的现场应用价值。方法根据疟原虫18 S rRNA基因序列,合成疟原虫属特异性上游引物和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物,优化PCR反应体系,建立在同一PCR反应体系中同时检测间日疟原虫、恶性疟原虫基因组特异性DNA片段的疟疾诊断方法,并评价其现场应用价值。结果间日疟原虫和恶性疟原虫基因组DNA经过复式PCR后,分别扩增出1 451 bp和833 bp的特异性条带,而伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫及健康人血样均无扩增带出现,用该反应体系可检出原虫血症为1.1×10-6和5.6×10-7的间日疟原虫和恶性疟原虫感染。与镜检法相比,复式PCR检测119份现场样本,112份与镜检结果相同,阳性率为54%,漏诊率为0.8%,误诊率为0,而镜检法依次分别为53%、1.7%和3.4%。结论复式PCR方法检测疟原虫具有简便、快速、特异、敏感等优点,在疑似病例的鉴别诊断和分子流行病学调查中具有良好的应用价值。     

聚合酶链反应技术与镜检法诊断间日疟的对比研究

目的　评价聚合酶链反应技术在间日疟诊断中的应用价值。　方法　根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 1对引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,扩增检测“四热”病人血样中间日疟原虫 DNA;同时作厚血膜镜检疟原虫。　结果　从间日疟患者血样中扩增出 341bp的 DNA片段 ,与预期的扩增片段大小相符 ,而正常人血样及空白对照无特异性条带 ;对于 2 34份“四热”病人血样 ,PCR法检出 16份阳性 ,阳性率为 6 .8% ;厚血膜镜检 13份阳性 ,阳性率为 5 .6 % ;两种方法相比差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;对于 3份 PCR阳性而镜检法阴性的血样 ,重新作 PCR,结果仍然为阳性。以镜检法为标准 ,PCR法的灵敏度为 10 0 % ,特异度为 98.6 %。　结论　PCR技术灵敏特异 ,可替代镜检法用于间日疟感染的临床及现场检测。     

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的：采用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法：采用已建立的套式PCR系统扩增SSUrDNA特定片段检测云南金县恶性疟镜检阳性患者的6份血样，并设阳性与阴性对照。结果：间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp、102bp和115bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。6份血样中检出4份p.v.、p.f.和p.m.的混合感染1份p.v.和p.f.及1份p.f.和p.m.的混合感染。结论：该系统特异、灵敏、稳定，在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染，对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。     

罕见输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的PCR鉴定和测序分析

目的应用PCR技术对与间日疟原虫形态相识的卵形疟原虫亚种wallikeri进行鉴定。方法采集1例镜检可疑间日疟输入性疟疾患者滤纸血,采用PCR扩增18核糖体小亚单位RNA（18Small Subunit ribosomal RNA,18S SurRNA）片段,并进行测序分析。结果采用5对引物（rFAL1、rFAL2,rVIV1、rVIV2,rMAL1、rMAL2,rOVA1、rOVA2,rOVA1v、rOVA2v）进行PCR扩增,其中rOVA1v、rOVA2v引物扩增阳性,PCR产物大小为760bp;测序分析该基因片段（GenBank accession number KJ786425）与GenBank数据库中Plasomdium ovale wallikeri克隆RSH10 18S rRNA基因部分序列（KF219561.1）及卵形疟ssrRNA基因（AJ001527.1）的序列一致性都为100%。结论卵形疟与间日疟原虫形态相似,可采用PCR技术确认。本例患者感染的疟原虫经PCR鉴定和测序分析确定为卵形疟原虫变形P.ovale wallikeri变形亚种。     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的　评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。　方法　采集海南省疟疾混合感染流行区 3 0 4份滤纸干血滴样本 ,根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列 ,设计合成 3条引物 ,采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段 ,检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA ;同时与镜检法进行比较。　结果　在 3 0 4份样本中 ,PCR法阳性 15份 ,其中间日疟 7份 ,恶性疟 8份 ;镜检法阳性11份 ,其中间日疟 6份 ,恶性疟 5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性 ;镜检阴性而PCR阳性的 4份样本 ,其扩增产物经限制性酶切鉴定 ,证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。　结论　此PCR检测体系灵敏、特异 ,对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

用聚合酶链反应技术检测间日疟原虫感染的研究

用 ５ 种不同的 Ｐ．ｖ．引物分别对间日疟原虫 Ｄ Ｎ Ａ 进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,在比较和分析各引物 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增结果的敏感性和特异性的基础上,筛选出一对根据间日疟原虫线粒体细胞色素 Ｃ氧化酶基因序列设计的引物为最佳引物,其检测敏感度可达到每μｌ血中 ０．２４ 个疟原虫。同时还对血样本处理方法进行了改进,从而建立了一种更为简捷、快速、经济且适用于现场应用的间日疟原虫 Ｐ Ｃ Ｒ检测方法。并利用该方法对２３８ 例门诊发热病人滤纸干血滴样本进行检测,与传统镜检法进行了比较。结果显示, Ｐ Ｃ Ｒ 方法对间日疟的误诊率（０）和漏诊率（１．７％ ）明显比镜检的误诊率（４．２％ ）和漏诊率（４．２％ ）低,具有比常规镜检法更敏感、特异的优点。     

巢式PCR扩增布氏田鼠细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因

目的 确定布氏田鼠细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (CO Ⅰ)基因巢式PCR扩增的方法.方法 采集内蒙古锡林郭勒盟阿巴嘎旗青格勒宝拉格地区的布氏田鼠12只,取肝脏组织,提取DNA,采用巢式PCR方法扩增CO Ⅰ基因,并对扩增产物进行测序.结果 巣氏PCR内外引物分别扩增出657、1 132bp的产物,与目的片段大小一致.内引物PCR扩增共获得12条布氏田鼠CO Ⅰ基因序列片段,测序均为CO Ⅰ基因片段,在GenBank中序列号为KF182196-KF182207;12条CO Ⅰ基因序列进行比对,相似性为100％,无碱基的变异.结论 巢氏PCR方法可有效扩增出布氏田鼠COⅠ基因,避免产生假基因现象.     

合成酶联DNA探针对恶性疟病人的检测

应用一种合成的P.f特异的21个硷基的酶联DNA探针(PFRl—AP),对培养的海南株P.f DNA及恶性疟病人血样进行检测。DNA杂交结果表明,该探针检测纯化的P.f DNA最低限度达8pg;62例经血片镜检确诊的P.f病人血样,39例杂交反应阳性,阳性率为75％。如将阴性病例的检测血样增加至100μl,则累计阳性率可达88.46％。3例P.f P.v混合感染者杂交反应阳性。5例P.v患者血样为阴性反应,32例正常人亦未出现杂交反应。本研究结果提示,应用该探针检测有较高的敏感性,可与~(32)P标记的P.f基因群DNA或重组DNA的现场检测结果相近似,而且对P.v及正常人DNA无交叉反应,特异性也好。     

复式PCR用于闽南疟疾监测的效果评价

目的：评价复式PCR在闽南疟疾监测中的应用效果。方法：采集流行区发热病人及疫点居民血样用复式PCR一次扩增同时检测恶性疟原虫（P.f）和间日疟原虫（P.u）。结果：249例发热病人PCR测阳性率为8.02％，敏感性方100％，特异性99.56％符合率99.59％，镜检阳性率为7.63％，抽查疫点居民701人检测疟原虫，未发现阳性样本，复式PCR检测大批样平均费用不高于传统镜检方法。结论：该复式PCR检测系统用于闽南现场疟疾监测具有敏感、特异、快速等特点，可用于分子流行病学调查、防治效果考核及虫种鉴别等。     

PCR-RFLP和微卫星DNA标记法在棘球绦虫感染诊断中的应用

目的 探讨PCR-RFLP和微卫星DNA标记法诊断棘球绦虫感染的临床价值.方法 对40例包虫病患者的40个包囊标本提取DNA后,分别采用PCR-RFLP和微卫星DNA标记法进行检测.结果 以棘球绦虫DNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,可得到大小约为561 bp的扩增条带,产物的长度与引物设计的预期产物长度一致.以棘球绦虫DNA为模板,用Sea引物进行PCR扩增,可得到约90 bp的扩增条带,产物的长度与引物设计的预期产物长度一致.40个标本均鉴定为细粒棘球绦虫,39个为细粒棘球绦虫G1基因型,1个为细粒棘球绦虫G6基因型.结论 PCR-RFLP和微卫星DNA标记法是简单、快速、有效的棘球绦虫基因型检测诊断方法.     

巢式PCR扩增SSU rRNA基因确诊1例三日疟原虫感染

目的 通过巢式PCR扩增18SSU rRNA基因片段确诊三日疟原虫的感染,减少三日疟的漏诊和误诊.方法 采用18SSU rRNA基因片段,通过巢式PCR方法,用镜检确诊的间日疟和恶性疟滤纸血样本进行对照,检测1例可疑疟疾患者滤纸血样本.结果 通过种间特异性引物的巢式PCR扩增后,间日疟及恶性疟确诊样本均扩增出相应的12...     

基于线粒体细胞色素氧化酶亚单位3基因鉴定贵州省首例输入性卵形疟病例

提取贵州省首例镜检诊断为输入性卵形疟病例的血样DNA,以疟原虫的核糖体RNA小亚基(SSU r RNA)和线粒体细胞色素氧化酶亚单位3基因(cox3)为靶标,分别设计属、种特异性引物及种特异性引物, PCR扩增、测序,比较2种引物对疟原虫种类PCR鉴定的特异性。以卵形疟原虫wallikeri亚种参考序列(GenBank登录号:HQ712053.1)和curtisi亚种参考序列(GenBank登录号:HQ712052.1)为模板,应用DNAMAN V6软件对扩增序列进行Blast比对。利用Mega 7.0.26软件,采用邻接法,基于疟原虫线粒体cox3基因DNA序列构建系统进化树。PCR结果显示,基于疟原虫SSU r RNA属、种特异性引物扩增,仅获得1 200 bp的属特异性条带,未出现种特异性条带。基于疟原虫cox3种特异性引物扩增,可获得880 bp的目的条带。Blast比对结果显示,PCR扩增获得的cox3基因序列与卵形疟原虫wallikeri亚种和curtisi亚种的序列一致度为99.4%和97.4%。     

1例国内罕见的输入性卵形疟的实验室检测

目的对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法制备疑似疟疾患者血样的血涂片,吉姆萨染色后进行疟原虫的镜检观察。利用实验室自行研制的疟原虫属特异性（通用型）和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和实时荧光PCR检测方法,对该血样进行疟疾检测及分型。将PCR扩增片段进行序列测定,并与已知的卵形疟序列进行blast比对分析。结合血样的分子生物学检测结果,重新对镜检结果进行复核。结果血样初次镜检为疟疾阴性。使用疟原虫巢式PCR通用引物对血样的DNA进行PCR检测,扩增出了预期大小约240bp的条带;巢式PCR分型检测表明,血样仅扩增出预期大小约450bp的卵形疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和三日疟扩增条带产生。疟原虫通用型和卵形疟特异性的荧光PCR检测结果均为典型的S形阳性曲线,卵形疟扩增片段的熔解温度为72.5℃。序列分析表明,扩增片段长度为434bp,blast比对发现去除引物后的393个碱基与GenBank DQ845247等卵形疟的SSU rRNA对应部分的基因序列同源性为100%。重新对血涂片进行镜检复核,结果在薄血膜中发现了卵形疟的环状滋养体,被寄生的红细胞为椭圆形,边缘呈伞矢状。结论使用巢式PCR、实时荧光PCR、序列分析和镜检等方法,证实该例输入性的疑似疟疾患者为卵形疟原虫感染。     

内脏利什曼病患者骨髓及血内病原体特异性kDNA片段PCR扩增用于诊断的研究

目的 :建立简易、准确的诊断内脏利什曼病和病原体鉴定技术。方法 :采用作者设计的杜氏利什曼原虫 ( L.d.)种特异引物 和 ,经 PCR扩增样品内病原体 k DNA2 97bp片段 ,检测 2 2例确诊内脏利什曼病 ( VL )患者骨髓、血、血清共 55份样品和 4例临床疑诊为黑热病患者的骨髓 (共 2 6例 ,59份样品 )。结果 :( 1) PCR法与骨髓涂片镜检符合率为 96.2 % ( 2 5/2 6) ;( 2 ) PCR法检测骨髓、血及血清的总阳性率为 95.4 % ( 2 1/2 2 ) ;( 3) PCR法检测 2 2例骨髓、 16例血样品及 17例血清样品 ,阳性率分别为 91% ( 2 0 /2 2 )、 68.8% ( 11/16)及 2 9.4 % ( 5/17)。 15例骨髓对照样品得自 9例白血病患者及 6例健康人。血及血清对照样品各得自 5例健康人。全部对照未见扩增产物 ,均为阴性。结论 :采用引物 和 进行 PCR扩增检测血内 k DNA特异片段诊断内脏利什曼病有较好前景。     

PCR检测蚊体内恶性疟原虫子孢子方法的建立

为建立能检测蚊体内恶性疟原虫的聚合酶链反应技术 ,根据恶性疟原虫 CSP基因序列 ,设计合成 1对引物 ,以 Chelex- 10 0煮沸法制备 DNA模板 ,采用 PCR方法 ,恶性疟原虫子孢子模板预期被扩增出 2 45 bp的 DNA条带 ,并将该法与蚊虫解剖镜检子孢子方法相比较。结果经人工感染恶性疟原虫的 31只大劣按蚊中 14只 PCR阳性 ,被扩增出预期大小的 DNA片段 ,其余 17只 PCR阴性 ;以该技术检测野外捕捉的 98只按蚊 ,结果均为阴性。 PCR法与解剖镜检法相比较 ,检测结果完全符合 ;相当于 1/ 10个阳性蚊子的模板即可满足 PCR检测。该检测体系灵敏、特异 ,对于蚊体内恶性疟原虫的检测具有一定的应用价值     

FTA-巢式PCR方法鉴定溶组织内阿米巴原虫的初步研究

目的建立一种简便,快速的FTA-巢式PCR方法用于鉴定粪便中溶组织内阿米巴原虫(Entamoeba histolytica, E.h).方法 收集门诊腹泻病人新鲜粪便,用光学显微镜进行初步检查.用FTA卡抽提镜检结果为阳性的粪便DNA,根据溶组织内阿米巴原虫的SSU -rRNA序列设计引物,进行巢式PCR扩增,对PCR产物进行琼脂糖凝胶分析,并对阳性产物进行测序和序列比对分析.结果 根据光学显微镜检测结果,挑选了44例镜检结果为阿米巴原虫阳性的腹泻病人粪便.经FTA-巢式PCR扩增,其中20例样本可扩增出427 bp左右的目的条带,目的条带的测序和序列分析结果表明为溶组织内阿米巴原虫.镜检方法与巢式PCR方法的阳性符合率为45.45%(20/44),将E.h与形态学相似的其他内阿米巴原虫进行了鉴定和区分.结论 本研究建立的FTA-巢式PCR方法具有简单,快速,准确等优点,为临床检验和流行病学调查中E.h的鉴别诊断提供了新的技术方法.     

山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的鉴定

目的 对山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种进行鉴定分析。方法 收集14例输入性疟疾病例,进行快速疟疾诊断试纸条检测(RDT)、血涂片镜检、NP-1993常规巢式PCR鉴定和卵形疟原虫wallikeri(P. ovale wallikeri)亚种的特异性PCR检测。PCR扩增产物测序后,进行Blast比对分析。结果 14例患者RDT检测结果:泛疟原虫(非恶性疟)阳性12例,阴性2例;镜检结果,13例卵形疟原虫,1例间日疟原虫;NP-1993常规巢式PCR结果,14例样本4种疟原虫引物扩增结果均为阴性。P. ovale wallikeri亚种的特异性PCR检测结果:14例样本均能扩增到P. ovale wallikeri亚种特异性条带780 bp。Blast分析测序结果,检索结果为P. ovale wallikeri亚种。结论 14 例镜检阳性、NP-1993常规巢式PCR检测阴性的输入性疟疾病例均确诊为P. ovale wallikeri亚种感染。