分化诱导剂对脊索瘤细胞体外粘附、移动和侵袭的作用

目的:探讨分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺(hexaethylenebisacetamide, HMBA)对人脊索瘤CM-319细胞体外粘附、移动和侵袭的作用. 方法:用2 mmol/L HMBA体外诱导培养CM-319细胞;用MTT(thiazalylblue,噻唑蓝)比色法测定细胞在重构基底膜Matrigel上的粘附;用Millicell PCF培养系统测定细胞的移动性和侵袭性. 结果:分化诱导剂HMBA诱导的CM-319细胞在30 min和90 min粘附实验中的粘附率,分别下降了27%和31%. 分化诱导剂HMBA对CM-319细胞体外移动和侵袭的抑制率分别为65.50%和69.85%. 结论:分化诱导剂HMBA对人脊索瘤CM-319细胞具有抗侵袭作用.     

抗血小板膜糖蛋白Ibα胞内段多肽多克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备兔抗人血小板膜糖蛋白(GP)Ibα C端557～561氨基酸序列多肽的多克隆抗体,并初步用于人血小板GPIbα C端559位丝氨酸磷酸化状态的检测.方法 应用化学方法合成C-R-G-S-L-P(559位丝氨酸非磷酸化,Ser559)和C-R-G-s(p)-L-P(559位丝氨酸磷酸化,pSer559)多肽.将2种多肽分别与钥孔蜮血蓝蛋白交联后,以皮下注射法分别免疫新西兰大白兔,分离获得2种抗血清(抗Ser559多抗和抗pSer559多抗).应用斑点印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法 对抗血清进行鉴定并检测效价.从人血小板裂解液中分离纯化血小板GPIbα,利用抗Ser559多抗和抗pSer559多抗、采用ELISA方法检测人血小板GPIbαC端559位丝氨酸磷酸化状况.结果 所制备的2种多抗分别特异性识别各自抗原,效价分别为1:32 000和1:64 000.2种多抗均可与纯化的人血小板GPIbα特异结合,表明人血小板GPIbα 559位点丝氨酸存在磷酸化与非磷酸化两种状态.结论 应用人工合成多肽成功制备出2种可特异性识别丝氨酸磷酸化状态的兔抗人血小板GPIbα胞内段多肽多抗,并证明人血小板GPIbαC端559位丝氨酸存在磷酸化状态.     

中医血淤症患者血液高凝状态的观察

用9103-B体外血栓形成血小板粘附率两用仪测定60例中医血淤症病人的体外血栓长度、重量和血小板粘附率.结果表明,冠心病、糖尿病、高血压和脑血栓与对照组比较有极显著差异(P<0.01,P<0.05).提示体外血栓长度、重量和血小板粘附率可作为临床血淤症早期诊断的重要参考指标.     

皮下注射登革热病毒-2型建立Balb/c小鼠感染模型

目的：经皮下注射登革热病毒-2型(DEN-2)，建立Balb／c小鼠感染模型，观察DEN-2不同毒株感染情况。方法：用DEN-2NGC株和临床分离株(B株)以不同剂量经皮下多点注射方式感染Balb／c小鼠，通过测量初次、再次感染后小鼠的体温、血小板数量、分离血浆中病毒、间接ELISA检测特异性抗体，观察动物感染模型建立情况。结果：(1)初、再次感染后实验动物可出现弓背、耸毛、震颤、低热、血小板数量降低等登革热(DF)临床表现，从血浆中检测到抗DEN-2 IgM，IgG类抗体，并分离到病毒；(2)两株病毒感染后实验动物的血小板数量及病毒血症期及特异性抗体的变化存在一定的差异。结论：经腹部皮下多点注射DEN，模拟自然感染方式可建立BALB／C小鼠感染模型，其感染情况与感染剂量、感染毒株有关。     

血管内皮下层纤维连接素在血小板粘附中的作用

本文利用扫描电镜和荧光分光光度计技术,研究了血管内皮下层Fn在血小板与血管壁粘附中的作用.当内皮细胞剥脱后血管壁上可见大量血小板粘附:当裸露的内皮下层失与抗Fn抗体反应后,血小板的相对粘附率降低了70.1％(P<0.01),而正常血清对照组无明显变化,说明Fn在血小板粘附中起重要作用.     

GPIV在血小板粘附过程中的功能

目的 探讨GPIV在血小板与胶原粘附过程中的功能.方法 采用流式细胞术,在有或无抗GPIV抗体阻断条件下,采用anti-CD42b-PE标识血小板,检测血小板与FITC荧光标记胶原粘附过程中FITC荧光强度的变化.结果 抗GPIV抗体在粘附早期能延迟粘附进程(P＜0.05),但最终不能抑制血小板与胶原的粘附过程(P＞0.05).结论 GPIV在血小板与胶原粘附过程的早期有辅助加速作用,但它不适宜被作为血小板的主要胶原受体.     

复方全蝎口服液对家兔体外活血化瘀作用的实验观察

从体外血栓形成、血小板粘附率、凝血功能方面探讨了复方全蝎口服液对正常健康家兔的活血化瘀作用.实验结果表明:复方全蝎口服液具有抗血栓形成、降低血小板粘附率、延缓血凝等药理作用.从而得出复方全蝎口服液具有活血化瘀作用.     

大蒜制剂对血小板粘附活性的影响

本实验测定了大蒜制剂对人和兔血小板粘附活性的影响,并观察人血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)的变化。结果表明,无论在体内还是体外,给予大蒜制剂均能显著抑制血小板的粘附活性,这种作用与血小板GPIb无关。     

血小板粘附试验—玻璃粉管柱法

血小板粘附性测定对于判断血小板功能障碍及高凝状态的疾病具有一定的诊断价值。目前体外测定血小板粘附性的方法有玻瓶法,玻璃珠柱法,树脂球柱法,玻璃纤维法等。在上述方法中,有的材料不易购取,有的粘附装置不易制作。根据血小板粘附性特点,笔者用玻璃粉制做的粘附管测定血小板粘附率,结果比较满意,现报告如下:     

血小板与抗血小板药

<正> 近年来,有关血小板生理功能及病理作用的研究取得了很大进展。抗血小板药已经作为一组有效药物开始在临床应用。一、血小板的功能1.粘附:即血小板粘贴于异物或血管内膜下组织表面。正常情况下,血小板在血管内沿着管壁缓缓流动,并不能粘附于管壁。内膜损伤时,血小板在该处增多,经过形态变化即粘附于暴露出来的胶原纤维和基底膜上。粘附的血小板随即被激活。这是止血或血栓形成的第一步。血小板粘附所伴发的改变是:(1)失     

抗CLCN5单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗氯离子通道蛋白5（CLCN5）单克隆抗体（mAb）并对其进行鉴定。方法：用人CLCN5为抗原免疫BLAB／c小鼠，用常规方法进行细胞融合，经筛选及克隆化建立可稳定分泌抗CLCN5 mAb的杂交瘤细胞株；用ELISA及Western blot进行抗体的鉴定。结果：筛选到4株可稳定分泌抗CLCN5 mAb的细胞株；Western blot显示，在4株抗体中有1株在相对分子量为83kDa处出现1条特异性条带．说明该单克隆抗体可与HSG胞浆蛋白中的CLCN5蛋白特异性地结合。结论：本实验成功获得1株可特异性识别CLCN5的单克隆抗体细胞株，可用于肾结石、X-连锁综合征的进一步研究、临床诊断及相关试剂盒等的开发研制。     

抗人FXYD6特异性多肽单克隆功能性抗体制备及生物学作用鉴定

目的 研制抗人转运调节因子(FXYD)6功能区单克隆抗体库,筛选分泌胞内、胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株并对鉴定胞外区单克隆抗体生物学作用.方法 原核表达并纯化去除跨膜区域FXYD6功能区重组蛋白,FXYD6重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,多次筛选及克隆化,建立稳定分泌抗人FXYD6胞外区或胞内区的单克隆抗体杂交瘤.分别应用间接酶联免疫吸附法(ELISA)、Western blot和免疫组织化学法鉴定抗体特异性及亚型,细胞流式技术筛选可识别天然构象的胞外区单克隆抗体,用腹水诱导法对胞外区单抗进行制备、纯化并检测亲和常数,高表达FXYD6的HepG2细胞系检测胞外区单抗的功能.结果 成功获得分泌抗人FXYD6胞外区或胞内区单克隆抗体的杂交瘤细胞库,制备出具有功能阻断性的胞外区单抗.结论 制备的抗人FXYD6胞外区单抗可抑制HepG2细胞的增殖.     

重组人IL-1β分子的克隆、表达及其单克隆抗体的制备

目的克隆人IL-1β基因,纯化其原核表达的产物,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法重组原核表达质粒pET-32a（＋）-IL-1β在宿主菌BL21（DE3）表达后,用割胶回收、电洗脱的方法纯化原核表达的蛋白,并用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。用ELISA法检测mAb的效价,并进行Ig亚类、特异度的检测。结果本研究利用HL-60细胞系cDNA为模板经PCR克隆了人IL-1β基因,纯化的重组人IL-1β蛋白纯度和含量分别为95%和0.75μg/μl。共筛选出能稳定分泌抗人IL-1β的杂交瘤细胞2株,分别为5G5和8H8。抗体亚型均为IgG2a,轻链均为κ链。结论克隆了人IL-1β基因,并成功纯化了其原核表达的蛋白,以纯化的蛋白为免疫原制备的鼠抗人IL-1β的单克隆抗体（mAb）,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

Cpn0585蛋白的免疫活性及血清学诊断初步评价

目的克隆肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0585基因,初步探讨其在血清学诊断中的应用价值。方法构建pGEX-6p-2／Cpn0585重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,免疫BALB／c小鼠,间接酶联免疫附试验（ELISA）检测小鼠血清抗体滴度,以重组蛋白作为ELBA包被抗原检测血清中CpnIgG抗体和检测36份Cpn-／Ct＋IsG阳性参考血清。结果高效表达和纯化出一相对分子质量约为95kDa的重组蛋白,蛋白质印迹法证明其能与人抗CpnIgG抗体发生反应;在被免疫的BALB／c小鼠体内,特异性IgG抗体的滴度为1：12800;检测104例临床血清标本中的IgG抗体,与以色列SavyonDiagnostics公司SeroCPTMIgGELISA诊断试剂盒的检测结果进行比较,符合率为98．3％。结论表达的Cpn0585重组蛋白具有良好的免疫活性,在Cpn的血清学诊断中具有较高的应用价值。     

人冠状病毒SARS-CoV、229E和OC43核衣壳(N)蛋白单克隆抗体的制备及3株人冠状病毒N蛋白的抗原相关性观察

目的 通过制备和鉴定人冠状病毒SARS．CoV、229E和OC43核衣壳（N）蛋白单克隆抗体〈mAb）,观察3株人冠状病毒的N蛋白抗原相关性。方法 分别用基因重组SARS．CoV、229E和OC43N蛋白免疫BALB／c小鼠,制备mAb,并采用ELISA间接法、免疫印迹和免疫荧光进行筛选和鉴定．同时用mAb分析3株人冠状病毒N蛋白之间的免疫交叉反应。结果 获得多株抗SARS．CoV、229E和OC43N蛋白mAb杂交瘤细胞株。ELISA间接法、免疫印迹和免疫荧光结果均显示,所有的mAb仅与各自病毒的N蛋白特异性反应。而在3株人冠状病毒N蛋白抗原之间不产生免疫交叉反应。结论 获得的特异性抗人冠状病毒N蛋白mAb为进一步研究3株人冠状病毒的抗原决定簇相关性奠定了基础。     

间接法ELISA检测流行性出血热抗体

用间接法ELISA检测流行性出血热IgG抗体。54份EHF病人血清全部阳性,32份正常人、19份发热病人和18份误诊为EHF病人的血清全部阴性,与IFA检测结果相同。检测EHF病人系列血清,发病3d就可检出抗EHF IgG,抗体滴度随病程升高,表明间接法ELISA可用于EHF临床诊断。将间接法ELISA与IFA、RPHI和HI平行检测30份EHF病人血清,抗体几何平均滴度(GMT)分别为1:43 211、1:413、1:253和1:143,有高度相关性,且ELISA比RPHI和HI更能检测出早期抗体。检测疫区人群血清4134份,间接法ELISA检出490份阳性,而IFA仅检出470份。结果表明间接法ELISA有较好的敏感度和特异度,尤其适用于血清流行病学研究。     

小鼠诺如病毒间接免疫荧光检测方法的建立

目的建立小鼠诺如病毒(MNV)的间接免疫荧光试验(IFA)的检测方法。方法将MNV-1接种RAW264.7细胞,培养36 h收集病毒培养物及未感染细胞培养物,点制抗原玻片;以107TCID50的MNV-1灌胃接种BALB/c小鼠,收集感染血清做阳性对照血清。收集人工感染后不同时间点的血清样品,以1:10的稀释度使用IFA法测定感染血清MNV抗体滴度。选取80份送检小鼠血清样品,以IFA和ELISA方法测定,差异样品使用Western blot方法进行验证。结果 MNV-1感染RAW264.7细胞(36~48)h,细胞感染率为60%,以36 h感染细胞状态为佳;IFA法测定感染小鼠血清,小鼠感染1周后抗体水平逐渐提高,在4周时抗体滴度达到最高值,之后维持稳定,采集感染4周的动物血清做IFA方法的阳性质控品;80份血清中,IFA法测定阳性27份,阴性53份,ELISA法测定阳性32份,阴性48份;Western blot方法对差异样品验证,其中阳性3份,阴性2份,IFA法和ELISA法检测符合率分别为96.0%和97.5%。结论 IFA方法检测小鼠诺如病毒基本可以反应小鼠的感染情况,偶有假阴性的出现,可以选择IFA方法和ELISA方法作为初筛,差异样品用Western blot方法验证。     

抗人凋亡相关蛋白TFAR19的单克隆抗体制备及鉴定

目的：研制鼠抗人凋亡相关蛋白ＴＦＡＲ１９的单克隆抗体,以进一步探讨ＴＦＡＲ１９蛋白的结构与功能。方法：以纯化的重组人ＴＦＡＲ１９蛋白为抗原,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,将ＴＦＡＲ１９蛋白免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０进行细胞融合,经克隆筛选获得鼠抗人ＴＦＡＲ１９蛋白单抗的杂交瘤细胞株,以间接ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析等方法进行单克隆抗体的鉴定。结果：获得了３株稳定分泌抗人ＴＦＡＲ１９单克隆抗体的杂交瘤细胞株（Ｃ１,Ｃ１０,２Ｃ１２）,其分泌的单抗效价高,特异性好,亲和力不一,免疫球蛋白亚类均为ＩｇＧ１。Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析证明ＴＦＡＲ１９蛋白在调亡细胞中高表达。结论：所获单抗能特异识别原核及真核细胞表达的ＴＦＡＲ１９蛋白,为进一步探讨ＴＦＡＲ１９蛋白的生物学效应提供了条件。     

重组人3型腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备抗人3型腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体并对单抗进行鉴定.方法 用纯化的重组六邻体蛋白免疫BALB/c小鼠.取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合.经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得4株分泌抗腺病毒六邻体蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗.使用ELISA、Western blot和中和实验等方法鉴定单抗的敏感性、特异性以及中和活性.结果 ELISA和免疫印迹结果表明这4株单抗与腺病毒六邻体蛋白可以特异性结合.而且,4C6株单抗具有中和活性.结论 获得了4个单抗为腺病毒六邻体蛋白的单克隆抗体,可用于3型腺病毒的早期诊断和药物治疗的研究.     

抗人抗苗勒管激素N端439～451表位单克隆抗体的制备及其性能研究

  目的  制备抗人抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone,AMH）N端特定表位肽的特异单克隆抗体并对其特性进行鉴定。  方法  利用生物信息分析软件预测AMH特定多肽片段,合成AMH成熟N端区域的4个抗原性好的表位肽段作为筛选靶抗原。用重组AMH蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP/20细胞进行细胞融合,通过杂交瘤技术制备抗AMH单克隆抗体,用N端4个表位肽（表位1:439～451 RGRDPRGPGRAQR,表位2:273-285 PPRPSAELEESPP,表位3:42～54 DLDWPPGSPQEPL,表位4:494～506 WPQSDRNPRYGNH）分别作抗原,间接ELISA和Western blot对筛选获得的特异抗表位单抗的抗原结合特性进行鉴定。  结果  筛选到两株能够稳定分泌抗人AMH表位1（anti-AMH-1）和表位2（anti-AMH-2）的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其分泌的单抗分别命名为anti-AMH-1和anti-AMH-2。该2株单抗细胞表达纯化后,检测其抗体效价分别为1∶12 000和1∶1 600。Western blot确认两种单抗除效价有差异外,识别抗原也有差异,anti-AMH-1不但能识别AMH的N端439-451表位肽,而且能识别重组AMH的氨基酸序列（rAMH）,也能识别卵巢组织。anti-AMH-2能识别rAMH和卵巢组织。  结论  成功构建了抗人AMH N端的特异表位的2种单克隆抗体。