6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏致四氢生物蝶呤缺乏症的诊断及1种新突变的发现

目的探讨6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶（PTPS）缺乏所致四氢生物蝶呤缺乏症（BH4D）的诊断及其基因突变特点,为开展BH4D的基因诊断提供依据。方法（1）归纳、总结临床症状、体征,复检血苯丙氨酸（Phe）浓度;（2）进行Phe（100mg／kg）＋四氢生物蝶呤（BH4）（20mg／kg）负荷试验、尿蝶呤谱分析、红细胞二氢蝶呤还原酶（DHPR）活性测定;（3）采用PCR．限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）及常规基因测序法进行PTPS基因突变检测,分析基因型与临床表型的关系。结果（1）患儿男,出生72h后经新生儿疾病筛查检出其Phe浓度为176．1μmoL／L,生后20d复查仅出现肌张力稍低下、皮肤稍白,复检其Phe浓度升高至222．6μmoL／L;（2）负荷试验前血Phe浓度271．2μmol／L,Phe负荷3h上升至756．0μmol／L,BH4负荷6h血Phe浓度迅速降至283．2μmol／L;（3）尿新蝶呤为2．95mmol／molCr,生物蝶呤为0．08mmol／molCr,生物蝶呤百分比为2．64％;（4）DHPR活性1．71nmol／（min·5mm disc）,为正常对照的45％,排除DHPR缺乏症;（5）患儿PTPS基因突变类型为c．259C〉T（P87S）及IVS1-129A〉G,IVS1-129A〉G突变是首次报道的新突变,筛查50例正常儿童未检测到该突变。结论（1）BH4负荷6h后血Phe浓度下降迅速,尿生物蝶呤明显降低,B％持续〈10％,DHPR活性正常是6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏症（PTPSD）的确诊依据;（2）P87S为中国人PTPS的热点突变,采用PCR—RFLP方法对热点突变进行快速筛查可提高基因诊断效率;（3）IVS1—129A〉G可能是PTPS基因新的致病突变。     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因启动子甲基化修饰及mRNA表达的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人血管平滑肌细胞(HVSMCs)5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因启动子甲基化修饰及其mRNA表达的影响。方法正常人脐动脉血管平滑肌细胞体外培养,在培养基中加入临床高Hcy血症相关浓度及极高浓度的Hcy(0、30、100、200、500和1000μmol/L),并孵育72h,以MS-PCR分析MTHFR启动子区域甲基化状态,采用RT-PCR测定MTHFR mRNA的表达水平。结果不同浓度Hcy处理人血管平滑肌细胞后,其MTHFR基因启动子区域出现去甲基化,甲基化水平明显降低。RT-PCR结果显示MTHFR mRNA表达增加。结论Hcy可促进人血管平滑肌细胞MTHFR启动子区域去甲基化,并使MTHFR mRNA表达增加。     

Ibrolipim对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞三磷酸腺苷结合盒转运体Al表达及肿瘤坏死因子-α释放的影响

目的为探讨巨噬细胞源性泡沫细胞肿瘤坏死因子-α的释放与新药Ibrolipim（NO-1886）抗动脉粥样硬化作用的关系。方法采用体外培养的THP-1细胞构建泡沫细胞模型,分别经Ibrolipim处理6、12、24 h后,高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量的变化,双抗体夹心法检测细胞培养液肿瘤坏死因子-α的水平,免疫印迹法检测细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A l蛋白的表达。结果与对照组比较,泡沫细胞经Ibrolipim处理6、12、24 h后,细胞内总胆固醇含量和游离胆固醇含量不断减少,细胞培养液中的肿瘤坏死因子-α水平逐渐降低,细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A l蛋白的表达升高。结论Ibrolipim抗动脉粥样硬化的作用与其减少泡沫细胞肿瘤坏死因子-α的释放有关。     

2,2’,4,4’-四溴联苯醚对小鼠甲状腺激素系统稳态的影响及作用机制研究

目的研究不同剂量2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)对C57BL/6小鼠甲状腺激素T3、T4和促甲状腺激素TSH的影响,并探讨可能的毒作用机制。方法将C57BL/6小鼠分成对照组和低、中、高剂量组,对照组按0.1ml/10g给予玉米油,染毒组分别按0.5、5和50mg/kg剂量给予BDE-47化合物,连续4天腹腔注射后,收集动物血液、肝脏和甲状腺组织。电化学发光免疫法测定各组小鼠血清总T4(TT4)、总T3(TT3)和TSH,愈创木酚法测定甲状腺组织中过氧化物酶(TPO)活性,CHOPRA法检测肝脏中I型脱碘酶(DI)活性。结果与对照组相比,所有染毒剂量组TT4水平均降低(P<0.01),中、高剂量染毒组小鼠TT3水平降低(P<0.01);中、高剂量染毒组小鼠肝脏DI活性与对照组相比有显著增加(P<0.05);血清TSH水平和甲状腺TPO活性各组之间无显著差异(P>0.05)。结论BDE-47可以破坏小鼠甲状腺激素系统稳态,产生甲状腺激素干扰毒性,其作用机制之一可能是影响肝脏DI活性。     

人Chang肝细胞对亚砷酸钠蓄积和甲基化能力的研究

目的 探讨Chang肝细胞对砷的蓄积和甲基化能力.方法利用超低温捕集-氢化物发生-原子吸收分光光度法测定不同浓度(0.1、0.2、0.5 μmol/L)亚砷酸钠染毒条件下Chang肝细胞在培养24、48和72h时,细胞内和培养液中的不同形态砷化物含量.结果 同一染毒水平下,Chang肝细胞对砷的蓄积率随染毒时间的延长上升(P<0.05);24h各染毒剂量组对砷的蓄积率差异无统计学意义(P>05);48h0.1和0.2μmol/L染毒组对砷的蓄积率显著高于0.5μmol/L染毒组(P<0.05);72h0.1μmol/L染毒组对砷的蓄积率显著高于0.2和0.5μmol/L染毒组(P<0.05);72h0.1μmol/L染毒组细胞对砷的蓄积率最高,为13.78%.同等染毒剂量下,细胞对砷的甲基化率随染毒时间延长而升高(P<0.05);同一染毒时段,0.5μmol/L染毒组细胞甲基化率显著低于0.1和0.2μmol/L染毒组(P<0.05).结论 Chang肝细胞对砷的蓄积和甲基化能力较弱,且随染毒剂量升高,Chang肝细胞对砷的蓄积和甲基化能力呈下降趋势.     

亚砷酸钠对人皮肤角质形成细胞MGMT基因组蛋白乙酰化及转录与表达的影响

[目的]了解不同剂量亚砷酸钠（NaAsO2）对人皮肤角质形成细胞（HaCaT细胞）中O^6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）基因组蛋白乙酰化调控、mRNA转录及蛋白表达的影响。[方法]以25．00、12．50、6．25、3．13μmol／LNaAsO2重复间隔处理HaCaT细胞72h（NaAsO2处理24h,隔天再次用NaAsO2进行相同的处理,重复处理3次）。定量染色质免疫沉淀技术（Q-ChIP）检测MGMT基因转录调控区（CHIP1、CHIP2区域）及MGMT基因编码区（CHIP3区域,对照区域）组蛋白乙酰化修饰水平;实时荧光定量PCR（Q-PCR）和免疫印迹分析分别检测MGMT基因的mRNA转录和蛋白表达。设不染毒的HaCaT细胞为空白对照（0．00μmol／L）,人表皮鳞癌细胞株A431为阳性对照。[结果]0．00、3．13、6．25、12．50、25．00μmol／LNaAsO2处理细胞中,MGMT基因转录调控区CHIP1区域的组蛋白H3K9乙酰化水平分别为176．68±8．50、175．71±18．14、161．26±16．28、146．23±24．00和82．64±33．87,差异有统计学意义（F=28．809,P〈0．05）;组蛋白H4乙酰化水平分别为183．59±11．98、180．84±24．10、166．52±5．48、156．87±10．64和103．42±7．04,差异有统计学意义（F=36．493,P〈0．05）。CHIP2区域的组蛋白H3K9乙酰化水平分别为171．11±16．54、167．55±8．97、156．51±8．59、135．88±16．55和82．01±3．96,差异有统计学意义（F=49．626,P〈0．05）;组蛋白H4乙酰化水平分别为117．23±16．21、143．29±10．59、135．87±7．44、105．48±7．56和78．79±6．92,差异有统计学意义（F=25．438,P〈0．05）。编码区CHIP3区域的组蛋白H3K9乙酰化水平分别为37．53±6．23、35．57±5．85、40．81±4．45、42．18±1．23和41．87±5．71,差异无统计学意义（F=2．341,P〉0．05）;组蛋白H4乙酰化水平分别为40．78±2．42、38．56±4．66、39．47±2．88、33．13±3．48和31．48±4．99,差异无统计学意义（F=3．027,P〉0．05）。MGMT基因mRNA转录相对表达量分别为1．19829±0．15997、1．51831±0．18054、1．42522±0．18039、1．01454±0．09679和0．88772±0．02000,差异有统计学意义（F=37．359,P〈0．05）;MGMT蛋白相对表达量分别为1．06619±0．06124、1．17447±0．06475、0．84883±0．05701、0．47163±0．02334和0．24034±0．01443,差异有统计学意义（F=20．687,P〈0．05）。[结论]砷通过导致MGMT基因转录调控区组蛋白去乙酰化,抑制MGMT基因mRNA转录及蛋白表达,是砷致皮肤损害的重要机制之一。     

不同价态砷对DNA和砷甲基转移酶的影响

目的观察不同价态、不同剂量砷染毒大鼠肝脏中DNA甲基转移酶和砷甲基转移酶mRNA的表达情况,寻找两者间的相关性及不同价态砷(iAs3+和iAs5+)体内甲基化间的差异。方法将35只健康清洁级Wistar雄性大鼠按体重随机分为7组,分别为正常对照(去离子水)组和低剂量(1/45 LD50,2.33 mg/kg)、中剂量(1/15 LD50,6.67 mg/kg)、高剂量(1/5LD50,20.00 mg/kg)砷酸氢钠(iAs5+)染毒组以及低剂量(2.33 mg/kg)、中剂量(6.67 mg/kg)、高剂量(20.00 mg/kg)亚砷酸钠(iAs3+)组,每组5只。采用自由饮水方式进行染毒,连续染毒90 d。采用实时荧光定量PCR法测定肝脏中DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)和砷甲基转移酶(As3MT)mRNA的表达情况。结果与对照组相比,各染毒组大鼠肝脏中As3MT mRNA的表达量较高,DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达量较低,高、低剂量亚砷酸钠染毒组和高剂量砷酸氢钠染毒组DNMT1 mRNA的表达量均较高,中剂量亚砷酸钠染毒组和低剂量砷酸氢钠染毒组DNMT1 mRNA的表达量均较低,差异有统计学意义(P<0.05)。随着亚砷酸钠染毒剂量的升高,大鼠肝脏中As3MT mRNA的表达量呈上升趋势,DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达量呈下降趋势;随着砷酸氢钠染毒剂量的升高,大鼠肝脏中As3MT mRNA的表达量呈下降趋势,DNMT3A、DNMT3B、DNMT1 mRNA的表达量呈上升趋势。As3MT的表达量与DNMT3A和DNMT3B表达量呈负相关(P<0.01);与DNMT1表达量无相关关系(P>0.01)。结论长期亚慢性暴露iAs3+和iAs5+均可促进As3MT的表达,抑制DNMT3A及DNMT3B的表达,但iAs3+和iAs5+间在剂量-效应关系上呈反向性;机体As3MT表达上调与DNMT3A和DNMT3B表达抑制间具有协同效应,并可导致基因低甲基化。     

叔丁基对苯二酚对亚砷酸钠致Chang liver细胞毒性的影响

目的 探讨叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)对亚砷酸钠(NaAsO_2)致Chang liver细胞毒性的影响.方法 Chang liver细胞培养48 h后分别以20、40、60和80 μmo/L的NaAsO_2染毒24和48 h,作为NaAsO_2单独作用组.以5和20μmol/L的tBHQ预处理Chang liver细胞24h,以40和60μmol/L的NaAsO_2染毒24和48h,作为tBHQ预处理组;对照组处理同NaAsO_2:单独作用组.每个浓度设3个复孔.用Alamar Blue法检测细胞活力.结果 NaAsO_2单独作用24和48 h组Alamar Blue还原率显著下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);且NaAsO_2单独作用48 h组的Alamar Blue还原率均显著低于24 h组,差异有统计学意义(P＜0.01).5 μmol/L的tBHQ预处理组与对应的60 μmol/L NaAsO_2单独作用24h组相比,显著提高了Alamar Blue还原率(P＜0.01);20 μmol/L的tBHQ预处理组的Alamar Blue还原率均显著高于相对应NaAsO_2单独作用24 h组(P＜0.05).5 μmol/L的tBHQ预处理组的Alaraar Blue还原率均显著高于相对应NaAsO_2单独作用48h组(P＜0.01);20μmol/L的tBHQ预处理组与对应的40μmol/L NaAsO_2单独作用48h组相比,显著提高了Alamar Blue还原率(P<0.01).结论 tBHQ能够降低NaAsO_2致Chang liver细胞的毒性,增强细胞对NaAsO_2毒性的抵抗能力.

Abstract：

Objective To study the antagonism of text-butylhydroquinone (tBHQ)to NaAsO_2 induced cytotoxicity in Chang liver cells in vitro.Methods Chang liver cells were exposed to NaAsO_2(0,20,40,60 and 80μmol/L)for 24 and 48 hours,or Chang liver cells were treated with tBHQ(5 and 20 μmol/L),then exposed to NaAsO_2(40 and 60 μmol/L)for 24 and 48 hours.The conditions of control group was the same as NaAsO_2 group.Alamar Blue was used to evaluate the viabifity of cells.Results Chang liver cells were exposed to NaAsO_2 for 24 and 48 hours,Alamar Blue reduction rates decreased significantly and Alamar Blue reduction rates of 48 hours group were lower than 24 hours group (P<0.01).Alamar Blue reduction rate of 5 μmol/L tBHQ pretreatment group was higher than 60 μmol/L NaAsO_2 group for 24 h(P<0.01);Alamar Blue reduction rate of 20μmol/L tBHQ pretreatment group were higher than respective NaAsO_2 group for 24 h(P＜0.05).Alamar Blue reduction rate of 5 μmol/L tBHQ pretreatment group were higher than respective NaAsO_2 group for 48 h(P＜0.01);Alamar Blue reduction rate of 20 μmol/L tBHQ pretreatment group was higher than 40 μmol/L NaAsO_2 group for 48 h(P<0.01).Conclusion tBHQ can decrease the cytotoxieity induced by NaAsO_2 in Chang liver cells,increase the resistance to the cytotoxieity induced by NaAsO_2 in Chang liver cells.     

无机砷对Chang肝细胞株血红素单加氧酶-1 mRNA和蛋白表达的诱导作用

[目的]观察亚砷酸钠（sodium arsenite,NaAsO2）对Chang肝细胞株血红素单加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）mRNA和蛋白表达的诱导作用。[方法]以5μmol／L和10μmol／L的NaAsO2作用Chang肝细胞株2、6、12h和24h,分别用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot法检测细胞内HO-1的mRNA和蛋白表达情况。[结果]5μmol／L和10μmol／LNaAs02暴露2h开始出现HO-1mRNA的诱导表达;6h的表达水平明显高于对照组和2h暴露组（P〈0．01）。其中,10μmol／LNaAsO2暴露12h和24h的mRNA表达均明显高于该浓度的6h暴露组（P〈0．01）;但24h的HO-1 mRNA表达水平与12h组相比没有明显升高。NaAsO2暴露诱导的HO-1蛋白表达则从6h开始出现,12h组明显高于6h组,24h组明显高于12h组（均P〈0．01）;5μmol／L和10μmol／L NaAsO2分别暴露6、12h和24h的HO-1蛋白表达量分别是对照组的2．80、9．34、18．15和3．97、12．92、23．29倍;此外,10μmol/LNaAsO2暴露12h和24h的HO-1 mRNA和蛋白表达均明显高于对应时间的5μmol／L组（P〈0．01）。[结论]NaAsO2暴露能够有效和持续性诱导Chang肝细胞株HO-1的mRNA和蛋白表达,是无机砷暴露的一种细胞保护性适应性反应。     

砷酸钠与亚砷酸钠致NIH3T3细胞转化的比较研究

目的探讨五价砷和三价砷的细胞转化活性的异同。方法应用细胞转化试验和软琼脂培养技术,以ＮＩＨ３Ｔ３为靶细胞。结果在所设剂量下,两种受试物均可诱发细胞转化,并有一定的剂量依存趋势。两种受试物比较,亚砷酸钠的致细胞转化作用较砷酸钠强。软琼脂试验显示,两种受试物的各个剂量,均诱发了阳性反应,与细胞转化试验结果相一致。结论因进入体内的五价砷可以还原成三价,对工业生产中接触的五价砷的致癌危险性不容忽视。     

亚砷酸钠对HaCaT细胞中DNMT1、HDAC1基因mRNA转录及蛋白表达的影响

目的 了解不同剂量的亚砷酸钠(NaAsO2)对人皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)中DNA甲基转移酶1(DNMT1)、组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因mRNA转录和蛋白表达的影响.方法 分别以0、3.13、6.25、12.5和25μmol/L NaAsO2溶液重复间隔处理HaCaT细胞72 h(NaAsO2处理24...     

无机砷对Chang肝细胞活性氧的诱导和核转录因子表达的影响

目的 研究亚砷酸钠(NaAsO2)对Chang肝细胞中活性氧(ROS)的诱导以及对核转录因子Nrf2的活化作用.方法 体外实验采用0～10μmol/L NaAsO2溶液对Chang肝细胞染毒2、6、12和24 h.分别用流式细胞仪和免疫印记实验(Westernblot)技术检测细胞内ROS含量和Nrf2蛋白的表达.结果 2.5lμmol/LNaAs02溶液染毒6h、5.0Ixmol/LNaAsO2 溶液染毒2、6、12、24 h的平均荧光强度的相对比值均高于对照组,差异有统计学意义(P(0.05或P＜0.01);且ROS的产生量随着NaAsO2溶液浓度的升高而增多.5.0 μmol/L NaAsO2溶液染毒12 h、5.0 μmol/L NaAsO2溶液染毒2、6、12 h的核转录因子Nrf2蛋白表达均强于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);且核转录因子Nrf2蛋白表达的活化具有时间相关性,即在NaAsO2溶液染毒12 h时核转录因子Nrf2蛋白表达的活化出现高峰,而后逐渐降低至正常水平.结论 无机砷能够诱导Chang肝细胞内ROS的生成和增强核转录因子NIf2蛋白的表达.