凝血酶对U937细胞uPAR mRNA表达的影响

目的 研究凝血酶通过凝血酶受体（ＴＲ）对细胞ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ表达的影响。方法 在凝血酶、灭活凝血酶、和抗ＴＲ小肽多抗等作用下,以ＲＴ－ＰＣＲ法测定培养Ｕ９３７细胞ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ的表达量。结果 凝血酶增强ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ表达呈现凝血酶剂艇时间的依赖性。其作用机制与凝血酶和细胞膜上ＴＲ间的结合、以及凝血酶的蛋白水解活性有关。高浓度凝血酶或中等浓度凝血酶在延长作用时间长,对Ｕ９３７细胞ｕＰＡＲｍ     

siRNA沉默细胞周期蛋白A2基因对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

目的研究siRNA对骨肉瘤MG-63细胞株及正常成纤维细胞细胞周期蛋白cyclin A2基因表达的抑制及对细胞增殖的影响。方法设计并化学合成靶向cycllnA2基因的siRNA,用oligofectamine将其转染到骨肉瘤细胞系MG-63及正常人成纤维细胞（HSF）中,用无义siRNA转染作为阴性对照,以单加缓冲液磷酸盐缓冲液（PBS）作为空白对照,实时-聚合酶链反应（PCR）、Western印迹方法检测cyclinA2基因沉默效果,采用MTT、RT-PCR、流式细胞、平板克隆培养等方法评价cycllnA2基因表达后被抑制后细胞的生长状态,同时检测细胞PCNA及cyclinB1基因表达的改变。结果1、10、50、100nmol／L浓度的cyclinA2-siRNA分别使MG-63细胞cyclinA2基因表达降低了9．4％,56．4％,79．2％和84．3％,同时cyclinA2蛋白表达也相应降低。转染10nmol／L及50nmol／LsiRNA后48h,MG-63细胞增殖抑制分别达到39．1％及54．9％,细胞周期阻滞于G0／G1期,平板克隆形成率降低,细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）及cyclinB1的mRNA表达水平明显下降。对正常成纤维细胞HSF,50nmol／LcyclinA2-siRNA可抑制58．1％的cyclinA2基因及蛋白表达,其导致细胞周期出现轻度改变,但细胞的增殖及平板克隆形成能力未受影响。结论cyclinA2是肿瘤细胞增殖所依赖的关键基因,针对cyclinA2基因的siRNA能有效降低细胞中cyclinA2mRNA及蛋白的表达,其能抑制骨肉瘤细胞的生长而对正常细胞的增殖影响很小,靶向cyclinA2的siRNA有望成为治疗骨肉瘤的新途径。     

小干扰RNA抑制胃癌细胞肝素酶表达及侵袭的实验研究

目的 利用RNA干扰（RNAi）技术封闭胃癌细胞系SGC7901肝素酶表达,观察其对肿瘤细胞侵袭能力的影响。方法 体外转录合成小干扰RNA（siRNA）,经脂质体转染胃癌细胞系;结合逆转录（RT）-PCR,Western印迹检测类肝素酶mRNA及蛋白质表达;通过体外侵袭实验评价肝素酶RNAi后胃癌细胞系的侵袭能力变化。结果 肝素酶siRNA分子可以特异性地抑制SGC7901细胞肝素酶mRNA,抑制率达（70±6）％;肝素酶RNAi后SGC7901细胞的侵袭抑制率达（61±36）％。结论 靶向肝素酶基因的siRNA分子能特异性抑制其蛋白表达水平,降低肿瘤细胞的侵袭能力。肝素酶是促进胃癌细胞侵袭转移的关键分子,并可为抑制胃癌侵袭转移提供新策略。     

改良的大鼠睾丸支持细胞分离培养方法

目的 简化睾丸支持细胞的分离方法，提高细胞产量。方法 采用0.25%膜酶、0.05%胶原酶序贯两步消化法消化，细胞悬液在37℃、5%CO2培养箱内孵育培养48h，观察产量和细胞功能。结果 改良的分离方法所获得的睾丸支持细胞占细胞总数的90%以上，大大提高了支持细胞的获取量，细胞Fas配体（Fas-L)表达功能正常。结论 改良的分离培养方法简化了传统的分离培养方法，同时提高了细胞产量。     

siR N A 干扰 A T1 R 基因调控链脲佐菌素诱导NIT －1细胞凋亡的实验研究

目的：用siRNA干扰技术沉默小鼠胰岛素瘤NIT－1细胞血管紧张素Ⅱ1型受体（ AT1R）基因,探讨其对链脲佐菌素（STZ）诱导的胰岛素瘤细胞凋亡的影响。方法针对小鼠AT1R基因,设计并合成3对siRNA序列,脂质体法转染至NIT－1细胞,荧光显微镜观察荧光强度检测转染效率,Real－time PCR检测AT1R mRNA表达量判断不同干扰序列及干扰时间的基因沉默效果;分4组：空白组不予任何干预,STZ组予5 mmoL／L STZ干预30 min,si－AT1R组予40 nmol／L si－AT1R转染24 h,si－AT1R＋STZ组予40 nmoL／L si－AT1R转染24 h后5 mmoL／L STZ干预30 min;Real－time PCR检测Caspase－3 mRNA表达量,Hoechst33342染色荧光显微镜和Annex-in V－FITC／PI流式细胞术检测细胞凋亡率。结果40 nmol／L siRNA转染的荧光强度最强,转染后AT1R mRNA表达量明显下降,si－AT1R－2转染24 h的沉默效果最佳（92.20％）;Caspase－3 mRNA表达量：STZ组与空白组比增加了2.37倍（P＜0.05）,si－AT1R＋STZ组与STZ组比减少了11.28％,但差异无统计学意义;细胞凋亡率：STZ组与空白组比增加了3.27倍（P＜0.05）,si－AT1R＋STZ组与STZ组比减少了26.82％（P＜0.05）。结论本研究建立了稳定的胰岛细胞AT1R基因沉默模型;RNA干扰沉默胰岛细胞AT1R基因可通过下调Caspase－3 mRNA表达量降低STZ诱导的细胞凋亡率,提示AT1R介导了STZ诱导的胰岛细胞凋亡过程。     

生存素表达与肺癌多药耐药株H460/cDDP化疗敏感性的关系

目的探讨生存素（survivin）与人肺癌多药耐药株H460／cDDP获得性耐药的关系。方法采用RT-PCR、Western印迹法检测耐药株H460／cDDP与敏感株H460的生存素表达;用针对生存素的小干扰RNA（siRNA）经脂质体介导转染入耐药株H460／cDDP,抑制生存素表达;用四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测顺铂（DDP）、紫杉醇（Taxol）对耐药株H460／cDDP的细胞毒作用。结果耐药株H460／cDDP的生存素mRNA和蛋白质表达均高于敏感株H460。生存素siRNA转染耐药株H460／cDDP后72h,生存素蛋白质的抑制率为92、3％。耐药株H460／cDDP和敏感株H460对DDP的Ic50分别为（6.3±0．6）mg／L、（0.8±0．1）mg／L,对Taxol的Ic50分别为（12．7±1．2）mg／L、（1．5±0．3）mg／L;生存素siRNA作用后,H460／cDDP对DDP、Taxol的IC50分别为（4．0±0.9）mg／L（P=0．002）、（8．1±1．7）mg／L（P=0．003）。结论生存素高表达与耐药株H460／cDDP的获得性耐药有关,生存素有可能成为逆转肺癌耐药性的有效靶点。     

小干扰RNA对肝星状细胞基质金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的抑制作用

目的观察化学合成的小干扰RNA(siRNA)转染大鼠肝星状细胞(HSC)-T6后不同时间点,对基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的抑制作用,同时筛选高效的siRNA片断。方法对大鼠TIMP-1 mRNA nt161~181、nt 190~208、nt 208~226、nt 226~244及nt 445~463化学合成的5对siRNA和1对荧光标记的非特异siRNA(与TIMP-1 mRNA无同源性的FITC标记的21nt siRNA),在阳离子脂质体的介导下将不同浓度的非特异siRNA转染至大鼠HSC-T6后,用流式细胞仪确定最佳转染浓度。提取转染50 nmol/L siRNAs后24 h,48 h和72 h细胞蛋白,用W estern b lot检测TIMP-1蛋白质表达,筛选出抑制效率最高的siRNA,同时确定siRNA转染细胞后的最佳作用时间。结果50 nmol/L siRNAs对HSC-T6有较高的转染效率;5对siRNA中的3对在转染后48 h有较强的抑制HSC-T6细胞TIMP-1基因表达的作用,其中抑制作用最强的1对siRNA对TIMP-1表达的抑制作用与对照组相比可增强80%以上,而在转染后72 h,其抑制作用基本消失。结论化学合成的siRNA在短时期内可有效地抑制TIMP-1基因的表达,筛选到的高效阻抑TIMP-1表达的siRNA可构建于病毒载体,以实现长期抑制TIMP-1表达的功效。     

靶向mTOR siRNA的合成及对MCF-7细胞mTOR基因表达的影响

目的:合成靶向哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)siRNA,观察其对人乳癌MCF-7细胞mTOR基因表达的影响。方法:以mTOR基因434～452序列为靶点,设计并体外合成mTORsiRNA,用100和150nmol/L的siRNA转染MCF-7细胞24、48、72h,同时设无关对照组(转染非特异性siRNA)和正常对照组(不转染),运用免疫组化SP法和原位杂交技术检测各组细胞mTOR蛋白及mRNA的表达水平。结果:转染24、48和72h后,与各对照组相比,siRNA转染组细胞mTOR蛋白及mRNA的表达均降低(P均<0.05),2个siRNA转染组之间差异无统计学意义(P均>0.05)。不同时间点mTOR蛋白及mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:设计合成的siRNA可有效抑制乳癌MCF-7细胞mTOR基因的表达。     

小鼠4-1BB特异性RNA干扰表达载体的构建及体外瞬时干扰效应的研究

目的 采用小片段RNA干扰(small interference RNA,siRNA)技术,通过构建系列小鼠4-1BB(m4-1BB)基因的特异性siRNA表达载体,体外观察对m4-1BB基因的瞬时沉默作用,筛选具有最佳干扰效果的siRNA表达载体.方法 设计并合成4条针对小鼠4-1BB全长特异性的siRNA寡核苷酸序列,插入真核表达载体(pENTRTM/U6 ),构建m4-1BB序列特异性siRNA 表达载体,根据靶位点分别命名为p336、394、498及763 siRNA,无关干扰质粒为pLacZ siRNA;通过体外m4-1BB真核表达质粒p4-1BB分别与各siRNA表达载体同时转染COS-7细胞,48h后通过RT-PCR和FACS(fluorescence-activated cell sorter,荧光活化细胞分选仪)观测COS-7细胞4-1BB mRNA及蛋白表达水平.结果经测序分析,各m4-1BB siRNA表达载体构建成功;其中p498 siRNA与p4-1BB双质粒转染COS-7 细胞,48h后可观察到细胞表面4-1BB分子明显下调,其胞内mRNA水平也显著降低,与无关干扰组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).其余siRNA载体,几乎无干扰效应,与无关干扰组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论我们所构建的p498 siRNA 真核表达载体,能明显干扰m4-1BB蛋白的瞬时表达,可望用于m4-1BB Lentivirus干扰表达系统的构建,进一步在小鼠原代T淋巴细胞内实现高效4-1BB表达沉默,以深入研究4-1BB对T淋巴细胞的生物学影响.     

siRNA抑制感染细胞模型中HCV复制的研究

目的:探讨siRNA能否有效抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞中HCV的复制.方法:用HCV JC1质粒体外制备HCV RNA转录体,转染Huh-7.5.1细胞,收集细胞上清,再次孵育Huh-7.5.1细胞以建立HCV感染细胞模型,并用间接免疫荧光检测细胞内HCV核心蛋白的表达.将针对HCV NS5B基因的siRNA转染HCV感染细胞(浓度为4、40和200 nmol/L,时间为24 h、48 h和72 h),将4、40和200 nmol/L siRNA转染正常Huh-7.5.1细胞,并设空白对照、脂质体对照、无关siRNA对照以及IFNα-2b(1 000 IU/ml)组,用荧光定量PCR检测细胞内HCV RNA和PKRmRNA水平.结果:HCV感染的Huh-7.5.1细胞中检测出HCV核心蛋白表达.40 nmol和200nmol/L siRNA 24 h组及4、40、200 nmol/L siRNA 48 h和72 h组,HCV RNA水平分别降至58％、54％、29％、17％、17％、33％、22％、19％,明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).1 000 IU/mlIFN的各时间组HCV RNA水平均明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01).各浓度siRNA组的PKR mRNA的表达与对照组无明显差异(P＞0.05).结论:针对HCV NS5B区的siRNA能够明显抑制HCV感染细胞中HCV的复制,而不引起双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)基因表达的激活.     

衔接蛋白2基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的：构建针对衔接蛋白2的μ2亚单位(AP2-μ2)的短链干涉RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对AP2-μ2基因的干涉作用。方法：设计AP2-μ2靶向的发夹状siRNA,据此设计合成3条互补的寡核苷酸链,退火后分别连接到pSilencer 3.1 neo H1载体,转化扩增后进行序列测定。待转染细胞分为对照组、Scramble plasmid、AP2 plasmid-1、AP2 plasmid-2和AP2 plasmid-3组。用脂质体转染法将3组siRNA重组质粒与阴性对照质粒(Scramble plasmid)转染大鼠心肌细胞株H9C2,通过RT-PCR法检测AP2-μ2基因表达水平的变化。结果：合成的6条寡核苷酸单链凝胶电泳显示多个电泳条带,分别退火后,产物经凝胶电泳显示形成单一条带。双链DNA模板与载体质粒连接后,用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切,凝胶电泳可见4　300和66 bp的酶切片段。DNA测序连接的核酸序列与设计序列一致,表明AP2-μ2基因的3条siRNA载体构建成功。RT-PCR检测,在AP2 plasmid-1组,转染的H9C2细胞中AP2-μ2的基因表达水平较阴性对照组降低约96%。结论：成功地构建了针对AP2-μ2基因的3条siRNA载体,其中AP2 plasmid-1转染细胞后可显著抑制AP2-μ2基因表达。     

RNA干扰假基因Cripto-3表达对大肠癌细胞增殖和侵袭的影响

目的：探讨RNA干扰下调假基因Cripto-3（Cr-3）对人大肠癌细胞SW480增殖和侵袭的影响。方法：将大肠癌细胞随机分为5组：空白对照组,空载对照组,siRNA转染组（5 nmol/L组、10 nmol/L和20 nmol/L组）。将Cr-3小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）转染人大肠癌SW480细胞后,采用实时荧光定量PCR检测Cr-3表达水平;分别采用平板克隆形成实验和Transwell法检测大肠癌细胞的增殖和侵袭能力。结果：与空白对照组和空载对照组比较,siRNA转染组Cr-3表达水平均明显下降,且呈浓度依赖性（P〈0.05）,癌细胞克隆形成和穿过滤膜的细胞均明显减少,且与浓度相关（P〈0.05）。结论：假基因Cr-3在大肠癌细胞增殖侵袭中起着重要的作用,可能是大肠癌诊疗中的一个重要靶点。     

吡咯喹啉醌对大鼠雪旺细胞形态及增殖细胞核抗原表达的影响

目的:观察吡咯喹啉醌(PQQ)对体外培养雪旺细胞的形态、细胞数量及雪旺细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法:从出生3-5dSD大鼠坐骨神经分离培养雪旺细胞,纯化并经S-100免疫荧光标记鉴定;设立对照组和实验组,分别加入100nmol/LPQQ和等量PBS培养48h后倒置显微镜下观察细胞形态并进行细胞计数;将不同浓度的PQQ(0,10,50,100,500nmol/L)加入雪旺细胞培养基中,培养48h后提取总mRNA及总蛋白进行PCNA的RT-PCR和Western blotting检测。结果:100nmol/LPQQ干预雪旺细胞48h可以使细胞的形态发生变化并使细胞数量增加,细胞数量较对照组增加13.6%;RT-PCR及Western blotting检测结果表明:PQQ浓度在10-500nmol/L浓度范围内可增加雪旺细胞内PCNA的表达,且当PQQ浓度为100nmol/L时该上调效应最明显,分别是对照组的2.0倍和3.4倍。结论:PQQ可增加体外培养雪旺细胞的数量;并可使体外培养雪旺细胞内PCNA表达上调。     

RNA干扰对EC9706细胞mTOR表达及细胞生长与凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰技术对人食管癌EC9706细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达及细胞生长与凋亡的影响.方法:设计合成mTOR siRNA,采用低、中、高浓度(50、100与150 nmoL/L)的mTOR siRNA分别转染EC9706细胞24、48与72 h.同时设无义对照组(转染无义对照siRNA)、空白对照组(转染空脂质体)及正常对照组(不转染).采用免疫细胞化学与原位杂交法分别检测各组EC9706细胞中mTOR蛋白与mRNA的表达;应用MTT法检测细胞增殖,计算细胞生长抑制率;应用TUNEL法检测转染24 h时细胞凋亡,计算凋亡指数(AI).结果:转染24、48与72 h,6组细胞mTOR蛋白和mRNA的表达差异均有统计学意义(mTOR蛋白:F=24.14,45.78,59.19,P均＜0.001;mTOR mRNA:F=41.42,69.74,43.71,P均＜0.001),细胞生长抑制率差异亦有统计学意义(F=143.85,172.98,155.01,P均＜0.001);低、中、高浓度组转染不同时间点间比较,mTOR蛋白(F=42.23,29.46,50.22,P均＜0.001)、mTOR mRNA(F=6.48,8.50,4.80,P均＜0.05)及细胞生长抑制率(F=78.77,76.14,52.28,P均＜0.001)差异均有统计学意义.mTOR siRNA转染组EC9706细胞mTOR蛋白与mRNA的表达均低于各对照组,且mTOR蛋白及mRNA的表达随mTOR siRNA浓度的增加及转染时间的延长而减弱(P＜0.05).不同浓度mTOR siRNA转染组EC9706细胞生长抑制率均高于各对照组,且细胞生长抑制率随mTOR siRNA浓度的增加和转染时间的延长而升高(P＜0.05).转染24 h,6组细胞AI相比,差异有统计学意义(F=442.96,P＜0.001),mTOR siRNA转染组AI均高于各对照组,且高浓度转染组AI高(P＜0.05).结论:mTOR siRNA可有效抑制EC9706细胞mTOR蛋白与mRNA的表达,且能抑制EC9706细胞的增殖并促进其凋亡.     

HDAC2 siRNA转染对人胰腺癌细胞增殖及凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨RNA干扰沉默组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)基因表达对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法: 培养人胰腺癌PaTu8988细胞株,并将其随机分为5组:空白对照组,20 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,40 nmol／L HDAC2 siRNA阴性组,20 nmol／L HDAC2 siRNA组,40 nmol／L HDAC2 siRNA组。合成针对HDAC2基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),利用阳离子脂质体将HDAC2 siRNA瞬时转染人胰腺癌PaTu8988细胞,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测HDAC2基因及蛋白的表达;MTT比色法检测细胞的增殖率;流式细胞术测定细胞凋亡率。结果: 与空白对照组和阴性siRNA 组对比,HDAC2 siRNA组的HDAC2基因和蛋白的表达水平均明显下降(P均<0.05),细胞增殖率减慢(P<0.01),凋亡率明显升高(P<0.01)。结论: 采用RNA干扰沉默人胰腺癌细胞HDAC2基因表达,可抑制癌细胞增殖和诱导其凋亡。     

Nestin特异性RNA干扰真核表达载体的构建及稳定株筛选

目的构建人nestin基因特异的RNA干扰质粒,为探讨抑制nestin基因表达对人黑色素瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法分别用30、50、80 nmol/L干扰或80 nmol/L对照siRNA转染人黑色素瘤细胞株UACC903,48 h后用免疫荧光、RT-PCR和Western-blot鉴定nestin基因表达并筛选有效的序列,用有效或对照组序列的正义链和反义链,通过酶切、连接、转化和筛选,获得长期下调人nestin基因表达的慢病毒载体,并包装慢病毒感染人UACC903细胞,免疫组化和Western-blot鉴定干扰有效,以此获取nestin表达下调的UACC903细胞株。结果重组质粒成功转化高感受态大肠杆菌,经XhoⅠ和HPAⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全正确。干扰组或对照组慢病毒感染UACC903细胞后与对照组比较,干扰组mRNA和蛋白表达明显降低。结论成功构建了针对人nestin基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制nestin基因的表达,为进一步研究其基因功能奠定了基础。     

决奈达隆对新生大鼠心室肌细胞HCN通道mRNA和蛋白表达的影响

目的 通过检测新生大鼠心室肌细胞在给予药物决奈达隆前后超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN通道)mRNA和蛋白水平的变化,探讨决奈达隆对HCN通道表达的影响.方法 分离新生SD大鼠心室肌,Ⅱ型胶原酶消化,通过差速贴壁分离法收集获得单一的心室肌细胞.并根据浓度(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0μmol/L的决奈达隆对细胞进行处理48h)和时间(浓度为10 μmol/L的决奈达隆对细胞进行1、6、12、24、48 h的处理)梯度分组.采用实时荧光定量PCR法和Western blot检测HCN2、HCN4通道mRNA水平和蛋白水平.结果 浓度梯度组和时间梯度组的HCN2 mRNA和HCN4 mRNA表达水平均低于对照组(P＜0.05);与对照组比较,10 μmol/L决奈达隆处理后12 h组的蛋白水平明显下调(P＜0.01).结论 决奈达隆可抑制HCN2、HCN4通道mRNA和蛋白的表达,且作用呈浓度依赖性,在给药后12 h达到最大作用.     

以叶酸受体为靶向的脂质体介导MYCN基因小干扰RNA体外抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞的增殖

目的以氨基脂为主要成分、叶酸受体为靶向的脂质体包裹MYCN基因小干扰性RNA,研究其体外对神经母细胞瘤LA-N-5细胞MYCN基因表达的抑制及细胞增殖的影响。方法制备氨基脂为主要成分、叶酸受体为靶向的脂质体包裹CY3标记的MYCNsiRNA转染LA-N-5细胞,以每微克蛋白中荧光强度半定量siRNA的转染效果;用定量RT-PCR检测转染前后MYCN基因mRNA变化;MTT法检测细胞增殖受抑情况：结果以100nmol／L终浓度转染LA—N-5细胞后每微克蛋白含siRNA（1808．5±140．2）pg,作用72hMYCN基因mRNA表达显著下降,抑制率79．2％,瘤细胞增殖受抑达66．2％。结论叶酸受体为靶向脂质体介导MYCNsiRNA在体外对LA—N-5细胞MYCNmRNA表达有显著抑制作用,明显抑制LA—N-5细胞增殖,为神经母细胞瘤靶向治疗、基因治疗开辟了新的思路。     

MDR1 siRNA对结肠癌细胞多药耐药性的影响

 [目的]探讨MDR1 siRNA对结肠癌细胞多药耐药性的影响。[方法]设计合成两种针对MDR1 mRNA的siRNA双链分子（#4123 MDR1 siRNA和#4029 MDR1 siRNA）,并转染入COLO 320DM和HT-29结肠癌细胞,观察其对结肠癌细胞MDR1 mRNA和P-gp表达的影响。并分别与5-FU、阿霉素和长春新碱等抗肿瘤药联用,观察结肠癌细胞活力的变化。用阿霉素处理后,观察转染MDR1 siRNA结肠癌细胞的细胞内阿霉素累积浓度的变化。RT-PCR检测细胞MDR1 mRNA的表达,免疫印迹法检测细胞P-gp的表达,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞内阿霉素累积浓度。[结果]#4123 MDR1 siRNA和#4029 MDR1 siRNA均可抑制COLO 320DM结肠癌细胞MDR1 mRNA和P-gp的表达,其最低有效浓度分别为5nmol/L和25nmol/L。同时MDR1 mRNA和P-gp表达的抑制伴随着抗肿瘤药（5-FU、阿霉素和长春新碱）对COLO 320DM结肠癌细胞毒性的增强和细胞内阿霉素累积浓度的增加。而在对照HT-29结肠癌细胞却观察不到此效应。[结论]MDR1 siRNAs能特异逆转结肠癌细胞的多药耐药性,为MDR1/P-gp依赖的多药耐药性结肠癌的治疗提供了一条新的途径。     

Enhanced Chemotherapy Sensitivity of Human Colon Cancer Cells to 5-Fluorouracil by siRNA Recombinant Expression Vector Targeting Survivin Gene

Objective To investigate the effects of small interfering RNA （siRNA） recombinant expression vector targeting survivin gene on chemotherapy sensitivity of human colon cancer cells to 5-fluorouracil. Methods siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was constructed and transfected into human colon cancer cell lines LOVO. After 48 hours of transfection, cells were harvested for analysis of survivin mRNA and protein expressions using RT-PCR and Western blot. In addition, after human colon cancer cell lines were treated with Survivin siRNA and/or 5-fluorouracil, MTT assay and flow cytometry were used to analyze cell proliferation and apoptosis. Results Restriction endonuclease analysis confirmed that siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was successfully constructed. Inhibitory ratios of survivin mRNA and protein expressions by Survivin siRNA were 36.33% and 44.65%, respectively. Survivin siRNA combined with 5-fluorouracil significantly increased the cell proliferation inhibitory ratio and apoptosis ratio compared with 5-fluorouracil treatin~ alone （P〈0.05）. Conclusion The siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene can inhibit the expression of survivin gene, and enhance chemotherapy sensitivity of human colon cancer cells to 5- fluorouracil.