EHEC O157∶ H7粘附Caco-2细胞缺陷突变株的构建

目的:构建对肠上皮细胞粘附缺陷的肠出血性大肠埃希菌O157∶ H7(EHEC O157)突变株,为体内、体外研究其粘附机制提供可用工具.方法:将pSC101和mini-Tn5Km2分别通过转化和结合导入O157Sakai菌株中,筛选粘附力缺陷的转化子感染Caco-2细胞株,观察Caco-2单层细胞中的微菌落数量和mini-Tn5Km2插入位点.结果:经诱变,共分离到3组粘附缺陷突变株,1组完全丧失了粘附力,2组粘附力减弱,3组的粘附力更弱.1组和3组拥有LEE岛上多基因的转座子插入,而2组mini-Tn5Km2的插入位点在LEE岛之外.结论:O157Sakai的肠道粘附能力可能与LEE岛的III型分泌系统有关.     

EHEC O157:H7肠粘附力增强突变株的构建

[目的]构建对肠上皮细胞粘附力增强的肠出血性大肠埃希菌O157H7(EHEC O157)突变株,为体内、体外研究其粘附及其粘附机制提供可行的手段.[方法]分别将pSC101和mini-Tn5Km2通过电穿孔转化和结合导入O157H7-Sakai菌株中,筛选粘附力增强的转化子感染Caco-2细胞株和实验小鼠,观察Caco-2单层细胞中的微菌落数量和小鼠粪便中突变株脱落的时程.[结果]经诱变,共分离筛选出8株突变株,其形成微菌落的数量大于野毒株至少3倍以上;8个突变株中有6株转座子的插入位置为E.coli K-12同源区的yhiE基因处,其突变株在小鼠粪便中的脱落时程明显高于野毒株,P<0.01.[结论]O157Sakai中的yhiE基因可能具有调节O157粘附肠道上皮细胞能力的作用,尽管其调节机制尚有待于进一步阐明,但本文结果显示其可能具有负调节的作用.另外,本文分离到的O157Sakai粘附增强突变株将为进一步在体内和体外研究EHEC对宿主肠上皮粘附的调节机制提供一个有效的工具.     

EHEC O_(157)∶H_7肠粘附力增强突变株的构建

〔目的〕构建对肠上皮细胞粘附力增强的肠出血性大肠埃希菌O157∶H7(EHECO157)突变株 ,为体内、体外研究其粘附及其粘附机制提供可行的手段。〔方法〕分别将pSC10 1和mini -Tn5Km2通过电穿孔转化和结合导入O157∶H7Sakai菌株中 ,筛选粘附力增强的转化子感染Caco -2细胞株和实验小鼠 ,观察Caco -2单层细胞中的微菌落数量和小鼠粪便中突变株脱落的时程。〔结果〕经诱变 ,共分离筛选出 8株突变株 ,其形成微菌落的数量大于野毒株至少 3倍以上 ;8个突变株中有 6株转座子的插入位置为E .coliK -12同源区的yhiE基因处 ,其突变株在小鼠粪便中的脱落时程明显高于野毒株 ,P <0 .0 1。〔结论〕O157Sakai中的yhiE基因可能具有调节O157粘附肠道上皮细胞能力的作用 ,尽管其调节机制尚有待于进一步阐明 ,但本文结果显示其可能具有负调节的作用。另外 ,本文分离到的O157Sakai粘附增强突变株将为进一步在体内和体外研究EHEC对宿主肠上皮粘附的调节机制提供一个有效的工具     

大肠埃希菌LEE毒力岛的临床流行病学调查

目的：了解携LEE毒力岛大肠埃希菌在杭州不同人群中的流行状况。方法：应用PCR技术检测不同临床来源的大肠埃希菌菌株的LEE毒力岛,并对检出的intinmin基因3’端部分以PCR法和限制性酶切分析法进一步分型,结果：在杭州市区2周岁以下的腹泻婴幼儿中,携LEE毒力岛的大肠埃希菌的检出率高达20．0％,而在2岁以上的腹泻人群中检出率仅为3．0％,检获的大肠埃希菌LEE毒力岛的intimin基因以β型为主（占45．0％）,并有20．0％不能按本PCR方法分型,限制酶切分析表明,β型可进一步分为2个亚型,本文分离菌株的γ型intimin基因与EHEC O157：H7 933株的γ型intimin基因酶切图谱差异较大,检获的携LEE毒力岛的大肠运往希菌菌株中,仅有1／5能用国内目前的致泻性大肠埃希菌诊断血清确定O抗原。结论：携LEE毒力岛大肠埃希菌为杭州市致婴幼儿腹泻的主要细菌性病原。LEE毒力岛的检测应成为EPEC的诊断和流行病学调查主要手段。     

出血性大肠杆菌O157：H7 DNA文库的构建

目的：为建立出血性大肠杆菌O157：H7 DNA文库,筛选致病岛LEE。方法：提取EHEC O157：H7 EDL933染色体,Xmal部分酶切并与pJB8X连接,包装,感染E.coli DH5a,鉴定库容,结果：库容约700克隆子,大于608个理论值,构建成功,结论：成功构建了出血性大肠杆菌O157：H7 DNA文库,为目的片段筛选打下了良好基础。     

大肠埃希菌O157∶H7携带stx2::IS1203v基因研究

目的了解中国部分地区大肠埃希菌O157：H7菌株携带志贺毒素基因变异状况。方法采用聚合酶链反应扩增志贺毒素基因，使用核苷酸序列测定判断是否存在志贺毒素的新变种，用HeLa细胞毒性实验研究其细胞毒性的变化。结果1992—2002年中国部分地区分离到的289株产志贺毒素的大肠埃希菌O157：H7中有3株菌携带的志贺毒素2（stx2）基因有1．3kb的插入序列（IS）插入，且这段IS和IS1203变种（IS1203 variant，IS1203v）有100％的核苷酸序列同源性。IS1203v插入到3株大肠埃希菌O157：H7 stx2基因的位置及开放性读码框（ORF）方向有所不同。除此之外，3株菌原有的stx2基因序列完全一致且为Stx2原型毒素。和Stx2原型毒素相比，这3株携带stx2：：IS1203v基因的菌株对HeLa细胞的毒性明显降低。结论分离到IS1203v插入stx2基因的大肠埃希菌O157：H7菌株；IS1203v的插入可导致对HeLa细胞的细胞毒性降低。     

12株疑似O157：H7大肠菌PER鉴定研究

目的：对12株疑似O157：H7大肠菌采用PCR法进行鉴定。方法：利用单一PCR和多重聚合酶链反应（mPCR）检测不同来源菌株志贺样毒素（stx1和stx2）、溶血素（hly）、粘附抹平因子（eaeA）、β-葡糖醛酸糖苷酶（uidA）、O157抗原编码（血E）、H7鞭毛抗原编码（niC）基因。结果：4株大肠菌rfbE和fliC基因检测为阳性，确认为EHEC O157：H7，其中1株菌株扩增出全部毒力基因，另3株菌株扩增出除stx1外其它全部毒力基因；2株大肠菌rfbE基因检测阳性，确认为O157：H7-大肠菌；其它均为非O157：H7其它大肠菌。结论：PCR技术的应用能对可疑O157：117大肠菌进行有效鉴定与分析，应成为今后病原学鉴定的主要技术手段。     

城区动物携带O157大肠杆菌状况及致病力研究

目的 了解重庆市区及近郊家禽家畜中O157大肠杆菌的存在和致病力情况以及对人群可能存在的威胁。方法 采集重庆近郊5个区养殖场动物粪便和环境标本共570份检测O157大肠杆菌，对分离菌株问的流行病学关系及菌株的致病力情况进行了探讨。结果 分离出17株O157大肠杆菌，其中有3株无动力O157：NM，总分离率2．89％。通过质粒图谱和限制性酶切图谱分析发现2株菌有流行病学相关性，属同一克隆株。通过溶血因子检测、小鼠毒力实验、Vero细胞毒实验及PCR毒力基因检测，发现多数大肠杆菌O157不含志贺毒素基因、不产志贺毒素，但却携带eae和hly基因，同时有溶血活性并均能致实验小鼠死亡。结论 重庆市区的养殖场动物携带有O157大肠杆菌，并造成了环境的污染，污染细菌有不同程度的致病力，表明本地区已存在O157大肠杆菌感染的威胁。     

宁夏地区167株大肠杆菌临床分离株HPI和LEE毒力岛的分子流行病学研究

目的为了研究宁夏地区人源大肠杆菌耶尔森菌强毒力岛(HPI)和肠细胞脱落位点(LEE)毒力岛的分子流行情况。方法根据Genbank报道的参考序列设计HPI核心区基因(irp2和fyuA)和LEE毒力岛核心区基因(ler和eaeA)的特异性引物,分别建立了两种毒力岛的双重PCR检测方法;采用已建立的PCR方法对167株人源大肠杆菌临床分离株进行HPI和LEE毒力岛的分布检测,并进行基因克隆和核苷酸序列分析。结果耶尔森菌强毒力岛(HPI)irp2和fyuA基因的阳性率均为68.86%(115/167);肠细胞脱落位点(LEE)毒力岛ler和eaeA基因的阳性率均为1.80%(3/167),且irp2、fyuA、ler、eaeA基因的核苷酸序列与GenBank中报道的基因核苷酸同源性高达95.41%~98.85%。结论 HPI毒力岛可能是引起本地大肠杆菌病的主要原因之一,irp2、fyuA、ler、eaeA四个基因具有较高的保守性。     

PCR方法检测EHEC O157：H7的rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及其变种基因

目的：应用当前国际上常用的rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及其变种5对引物，对45株疑似肠出血性大肠埃希菌O157：H7（EHEC O157：H7）检测鉴定，全面了解此类菌的致病力情况。方法：分纯并富集被鉴定菌株，首先以单克隆诊断血清学凝集，阳性者再经100℃水煮制成粗模板，应用PCR检测各菌株是否具有rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及stx2及其变种5种基因，扩增结果经EB染色后在凝胶成像仪下观察特异性条带并拍照。结果：45株被检测菌经PCR扩增检测，5种基因全部阳性的有10株，4种基因出现阳性的只有1株，3种基因阳性的有6株，2种基因阳性的有17株，1种基因阳性的有10株，1株菌的5种基因检测均为阴性。45株菌中和。，阳性的有44株fliCH7基因阳性的菌株有30株，hlyA阳性的菌株只有10株，eaeA阳性基因的菌株有21株，stx2及其变种阳性的也只有11株。结论：这次45株菌中有5株具有全部的5种基因，44株为EHEC O157，其中30株为EHEC O157：H7，这次选择的5种基因不仅能给被检测菌株定性，而且能较全面地反应其毒力强度，适合于有条件的基层实验室开展。     

大肠埃希菌O157:H7分离鉴定过程中赫尔曼埃希菌的鉴别

目的：鉴别大肠埃希菌O157：H7和赫尔曼埃希菌。方法：观察菌株在山梨醇麦康凯，营养琼脂及Chromagar O157培养基上菌落形态。生化试验检测菌株的生化特性，血清凝集试验检测菌株的O157和H7抗原，聚合酶链反应法检测O157和H7特异性基因。结果：在营养琼脂培养基上，5株赫尔曼埃希菌均产黄色色素，2株O157：H7菌不产色素；在Chromagar O157培养基上，2株O157：H7菌株呈紫红色，2株赫尔曼埃希菌株呈蓝色，其余3株赫尔曼埃希菌株呈黄绿色。O157：H7菌株KCN试验均为阴性，而赫尔曼埃希菌阳性。O157和H7抗血清坡片凝集试验，7析均为强凝集。O157：H7菌株与O157单克隆抗血清玻片凝集试验均为强凝集，而赫尔曼埃希菌均不凝集。O157：H7菌株O157和H7特异性基因均为阳性，赫尔曼埃希菌均为阴性。结论：赫尔曼埃希菌与O157多克隆抗血清有交叉反应，但单克隆抗血清能区分O157：H7和赫尔曼埃希菌。KCN试验和特异性基因检测亦能鉴别这两种菌。在营养琼脂和Chromagar O157培养基上的菌落形成也有助于两菌的区分。     

郯城县2000～2001年0157大肠杆菌动物宿主带菌情况调查

目的：了解郯城县O157大肠杆菌动物宿主带菌情况。方法：标本直接接种mEC肉汤增菌液，先用免疫金标法筛选，后用免疫磁珠富集分离山梨醇麦康凯、麦康凯琼脂平板，点种CHROMagar O157显色琼脂平板，纯化菌进行生化反应、血清学等检测。结果：入户采集牛、驴、羊、猪、鸡等新鲜粪便，2000年共采集275份，检出4株O157：H7，6株O157：H-，2株O157：H38，1株O157：H19，1株O157：H45，共计14株（5．09％）；2001年共采集629份，检出4株O157：H7，1株O157：H-，1株O157：H8，共计6株（0．95％）。结论：2000～2001年调查的动物宿主带菌率为2．21％。2001年调查的动物粪便带菌率比2000年明显下降（X^2=13．29，P〈0．01）。     

O157大肠杆菌溶原性噬菌体的初步探讨

[目的]探讨E．coli O157携带噬菌体的情况及噬菌体特性。[方法]从3种血清型E．coli O157菌株中分离筛选噬菌体，并分别从O157：H7和O157：NM检出的噬菌体中各筛选出5株对同源菌进行裂解试验。[结果]3种不同血清型的E．coli O157携带噬菌体的检出率O157：H7为29．9％，对同源菌的裂解率为75．0％；O157：NM检出率为17．3％，对同源菌的裂解率为23．1％；O157：H7为8．1％。[结论]3种不同血清型的E．coli O157均携带温和噬菌体，裂解力较差，噬菌斑均为磨玻璃状，符合前噬菌体的特性。     

厂东省食品中O157：H7大肠杆菌分离株的生化特征、毒力因子与耐药性的探讨

目的：了解广东省食品中O157：H7大肠杆菌分离株中生化特征、毒力因子的携带与耐药情况。方法：采用免疫磁珠富集法进行O157：H7大肠杆菌分离，对O157：H7大肠杆菌分离株进行生化、噬菌体、血清学鉴定后，应用PCR技术检测其毒力因子，应用纸片法（K—B法）进行药敏试验。结果：从277份样品中分离出2株O157：H7大肠杆菌，总检出率为0．72％；对这2株O157：肿大肠杆菌分离株进行PCR毒力因子的测定，其中1株为携带eaeA、Hly和SLT2毒力因子的强毒株．而另1株分离株未检出毒力因子。药敏试验结果显示，这两个O157：H7大肠杆菌分离株对青霉素类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类5大类的部分抗生素有多重耐药性。结论：广东省食品中存在O157：H7大肠杆菌强毒株的污染。O157：肿大肠杆菌多重耐药株的出现，提示应关注我国畜牧养殖业抗生素的使用情况。     

漳州市家畜家禽携带O157大肠杆菌的调查

[目的]了解漳州市家畜家禽携带O157大肠杆菌的情况，为防制工作提供依据。[方法]采集家畜家禽的新鲜粪便或肛拭标本，EC肉汤增菌，O157大肠杆菌病原体快检金卡筛选，SMAC选择性培养基分离培养，对可疑菌落进行血清学、生化试验鉴定，及PCR检测rfbO157、fliCH7基因。[结果]从1122份猪、鸭、鹅、鸡粪便或肛拭标本中检出19株O157大肠杆菌，其中猪源17株、鸭1株、鹅1株。根据血清学及动力试验，11株O157：H7；3株O157：H?；5株O157：NM。[结论]漳州市部分家畜家禽中存在3种类型的0157大肠杆菌，在防制工作中应引起重视。     

脉冲场电凝胶技术在肠道致病菌分子流行病学调查中的应用研究

目的：探讨建立快速敏感的肠道病原菌的诊断分型方法，有效地追踪溯源和控制传染源。方法：用脉冲场电泳胶与噬菌体分型实验方法对29株S．sonnei分离株与12株EHEC O157：H7菌株进行分型。结果：4起S．sonnei暴发事件的PFGE的试验结果显示，同起事件的DNA条带几乎一致；2起EHEC O157：H7暴发事件中，同起事件的PFGE条纹几乎一致，而3株散发菌株的PFGE条纹各异；另外对12株EHEC O157：H7进行噬菌体分型试验，也显示了比较好的分型力。结论：PFGE具分型力强、重复性高等特点，能直观地判断肠道致病菌的亲缘关系，及时查明暴发流行的传染源，从而有效地控制疫情的蔓延。     

厦门市O157:H7肠出血性大肠埃希氏菌调查分析

目的 了解厦门市家畜，水产品，外环境中O157：H7大肠菌的带菌情况，为防治提供依据。方法 2002年5～10月采集本市家畜粪便标本。外环境污水及水产品等标本。用E．coli O157试条对样品进行初筛，初筛阳性的样品再进行分离培养鉴定。用VITEK(GNS—120卡)对所分离菌进行NCCLS推荐的14种药敏实验。结果 在厦门市107头猪和44只羊中各分离出一株O157：H7，在324份水产品中分离出3株O157：H7，所分离的5株O157：H7对所测14种药物敏感度高。结论 本次所分离5株O157：H714种药敏实验全部敏感。可指导临床用药。本市家畜和水产品中存在O157：H7大肠杆菌，要加强监测。     

多重PCR方法快速检测E.coli O157毒力及rfbEO157基因

[目的]探索一种快速、特异的检测大肠埃希菌O157的多重PCR(multiplex PCR)方法。[方法]选用针对大肠埃希菌O157志贺样毒素1、2(stx1、stx2)基因、溶血素(hlyA)基因、粘附抹平因子(eae)基因和O157特异性基因(rfbEO157)的5对引物，在同一扩增体系中进行PCR，检测9株不同来源的O157和其他大肠埃希菌21株。[结果]通过优化多重PCR反应条件和循环参数，5对特异性引物只扩增相应的基因片段，检测结果与应用常规PCR获得的结果一致。[结论]该多重PCR方法能够在一次扩增中同时反应待测菌株是否为大肠埃希菌O157及其携带毒力基因的情况，可为大肠埃希菌O157的诊断及流行病学调查提供一种简便、经济、快速的检测手段。     

中国部分地区大肠埃希菌O157的分子分型及变异研究

目的了解出血性大肠埃希菌（EHEC）O157的分子流行特征和遗传变异关系并完善EHECO157：H7感染性腹泻监测制度。方法采用聚合酶链反应分析毒力基因的分布情况；用脉冲场凝胶电泳技术对1988-2005年部分地区分离到的249株EHECO157：H7（其中产志贺毒素的245株，不产志贺毒素的4株）和51株O157非H7进行分子流行病学分析。结果stx2基因在我国的EHECO157：H7菌株中有着很高的分布率，部分菌株携带stx2基因变种。300株O157共分为161种带型，其中51株O157非H7菌株共有42种带型，4株O157：H7非产毒株分别为4种带型，245株EHECO157：H7共有115种带型。结论EHECO157间的基因变异较大；产stx2原毒素的菌株和5衄2毒素发生变异的菌株带型相差较大。部分菌株之间存在着一定的交叉，说明虽然这两大类菌株有其特有的流行克隆系，但是它们的克隆系之间亲缘关系较近。     

福建省O157：H7大肠杆菌毒力及特征基因的初步研究

目的 对福建省分离的80株E.coli O157：H7菌株进行毒力及特征基因的检测分析。方法 应用聚合酶链反应（PCR），以志贺毒素基因（stx)，粘附抹平因子基因（eaeA)，溶血素基因（hlyA)，O157抗原编码基因(rfbO157)和H7抗原编码基因（fliCH7)为靶基因进行检测。结果 福建省分离的O157：H7菌株毒力基因携带率为6．25％（5／80）。菌株毒力基因图谱为stx eaeA hlyA和eaeA hlyA。rfb O157基因阳性与O157血清型符合率为100％。结论 福建省分离的O157：H7菌株毒力基因携带率（6．25％）低于江苏省疾病高发地区（85．7％，P＜0．05）。