16S rDNA检测在临床细菌检验中的应用

目的根据细菌16S rDNA的高度保守性,设计合成所有细菌的通用引物,建立快速检测细菌的方法。方法应用PCR方法检测细菌16S rDNA基因。同时对白假丝酵母菌、人白细胞DNA和HBV-DNA阳性病人血清同法检测。结果所有检测细菌均出现特异性条带,而白假丝酵母菌、人白细胞DNA和HBV-DNA阳性病人血清阴性。结论该法快速、特异、敏感。一个样品中能同时检测多种细菌,可为实验室初步判断是否存在细菌感染提供客观依据。     

临床几种常见病原细菌的通用基因芯片检测

目的建立一次实验就能检测出同一样品中的多个病原细菌的基因芯片。方法检索相关细菌的16 s rRNA序列,使用生物信息学软件针对每个细菌的四个可变区设计出4条寡核苷酸探针并制成基因芯片;利用此芯片对6种临床常见病原细菌进行检测。结果6种临床常见病原细菌的检测结果中除铜绿假单胞菌两条探针较弱外,其余5种均能正确与自己的探针杂交,并且混合样品检测结果达到了预期的目标。结论利用寡核苷酸芯片系统实现病原菌通用检测是完全可行的,对部分实验菌株进行初步考核,具有理想的特异性和灵敏度,可以进一步用于临床标本的检测。     

16S rDNA序列在艾伯特埃希菌鉴定中的应用

目的 通过16S rRNA基因序列分析快速鉴定艾伯特埃希菌。方法 以30株疑似艾伯特埃希菌为材料,使用通用引物扩增其16S rRNA基因并进行测序。获得的序列与艾伯特埃希菌型菌株LMG 20976,基因组测序菌株KF1、NBRC107761、TW07627以及其他密切相关的细菌种(大肠埃希菌、赫曼埃希菌、费格森埃希菌、志贺菌和Shimwellia blattae)的16S rRNA基因序列进行比较,并使用N-J法构建进化树来分析其相关性。结果 30株疑似艾伯特埃希菌的16S rRNA基因序列与艾伯特埃希菌参考菌株的序列相似性最高,并与其聚类为一簇,为艾伯特埃希菌。结论 16S rRNA基因测序分析可用于艾伯特埃希菌的快速鉴定。     

应用基因芯片快速检测临床常见细菌

目的 应用基因芯片对临床常见的8种致病细菌进行检测.方法 选取8种临床常见的致病细菌,包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、宋内志贺菌.以16S rRNA基因为目的基因,白行设计通用引物系列扩增目的片段,针对高变区域设计探针,建立基因芯片检测体系,并对所选细菌...     

基因芯片用于病原细菌通用检测的研究进展

传统的检测技术一般是通过一次实验，检测一种或少数几种病原体。为了提高病原细菌检测的速度和准确性，建立一次实验能检测出一个样品中多个目标的通用检测技术，是临床微生物检测中重要的研究课题。理想的通用检测技术应具有较好的种属鉴别能力和检测灵敏度，并且能够平行、大量、快速、稳定和特异地实现多种细菌的检测。最近发展起来的基因芯片技术具有微型化、高通量、并行处理的特点，能够实现通用检测的目的，具有良好的应用前景。     

基于16S rDNA数据库的细菌在线分类鉴定平台的构建

目的 利用且兼并简化现有16S rDNA基础数据库,建立可用于传染病预防控制及感染性疾病的临床诊疗的细菌快速分类的核糖体基因数据库,构建快速鉴定在线分析平台。 方法 收集整理已有的包括RDP、GenBank、SILVA、HOMD等国际公认、公开的16S rDNA数据库,进行整理、筛选和去冗余,重新构建16S rDNA数据库。利用生物信息学构建自动化分析流程,并利用先进的web 2.0、JAVAEE等技术开发设计数据库系统及网站,构建了自动化的在线细菌分类鉴定平台。 结果 通过核酸序列比较,将已公布的1 450 265条16S rDNA序列简化为具有代表性的96 138条序列,并构建了序列数据库。结合序列比较、序列聚类等生物信息方法,建立了基于web的快速检索系统(http://ssu.bioinfo-icdc.org)。 结论 通过构建基于16S rDNA序列的细菌分类鉴定在线分析平台,具有快速、简单、明确的特征,能够对病原菌进行快速、准确的分类学鉴定,有效提高传染病预防控制和感染性疾病临床诊疗中的病原菌鉴定和疫情溯源的速度,为及时实施有效治疗和控制措施赢得时间。     

细菌性肺炎快速诊断基因芯片的初步构建

目的：根据细菌16 S rRNA基因特点设计常见病原菌的特异性探针,采用酶显色技术构建基因芯片,探讨其临床应用的可能性。方法选取肺炎链球菌、流感嗜血杆菌及铜绿假单胞菌等8种细菌性肺炎常见的病原菌的标准菌株作为研究对象,并选择12份患者的痰液标本进行检测。在16 S rRNA基因保守区设计 PCR反应的通用引物及革兰阳性菌、革兰阴性菌的通用探针,利用可变区的差异设计合成特异性探针,构建基因芯片。利用细菌16S rRNA基因设计的PCR通用引物进行扩增,所有8种细菌均获得350 bp的扩增产物。以地高辛标记特异性探针,构建完成可用于8种常见病原菌检测的基因芯片,结果8种标准菌株基因芯片检测均取得了预期效果,对12份痰标本中常规培养阳性7份,其对应芯片检测结果均成阳性,5份常规培养阴性的标本中,芯片结果提示阳性的有3份,其中1份为嗜肺军团菌,2份为使用抗生素后的患者标本。结论设计合成的 PCR通用引物对扩增细菌的16 S rRNA基因具有较高的特异性及灵敏度。构建的基因芯片可用于常见细菌性肺炎病原菌的检测鉴定,且对抗生素使用后的临床标本及苛养菌有一定的诊断价值。本研究所获得基因芯片对于细菌性肺炎的检测具有简单、快速、特异性及敏感性高的特点。     

16S rRNA基因序列分析在感染性心内膜炎瓣膜内病原菌检测中的应用

目的探讨16S rRNA基因序列法在感染性心内膜炎(IE)患者瓣膜赘生物内致病原检测中的应用价值。方法对129例IE患者术中赘生物进行DNA提取、PCR扩增及测序分析,并与传统血培养及赘生物培养进行比较分析。结果配对卡方检验显示16S rRNA基因序列分析法检测阳性率明显高于血培养[83.53%(71/85)vs 28.24%(24/85),P0.05]和赘生物培养[77.5%(100/129)vs 18.6%(24/129),P0.05],可检出苛养菌及立克次体、巴通体、支原体等特殊病原体。结论应用16S rRNA基因序列分析法可提高IE患者瓣膜赘生物致病原的检出率。     

16S rRNA及相关技术用于临床细菌鉴定的研究进展

<正>快速、准确地鉴定细菌是临床微生物学最基本的任务,传统的细菌鉴定方法依赖于直接涂片检查、纯培养,从表型特征方面加以鉴定。该方法繁琐、费时,主要又依赖于专业人员的经验和专业知识。随着核酸技术发展,16SrRNA序列测定被用于细菌分型鉴定,还可用于发现和描述新的细菌种类,尤其是表型鉴定难于确定的细菌。随着细菌基因组研究的进展,利用分子生物学对细菌进行鉴定已初步应用于临床,包括16S     

临床常见病原菌16S rDNA单链构象多态性分析

目的 原核生物的rRNA基因位点具有高度的保守性,同时不同种属细菌之间又存在相对稳定的变异性,因此可被用于细菌的分类和鉴定.本研究试图利用16S rRNA基因结合分子生物学方法,达到快速鉴定临床常见病原菌的目的.方法 收集临床常见各种病原菌333株,筛选2对通用引物在5′端用不同荧光标记,然后对细菌基因组DNA进行聚合酶链反应（PCR）扩增,产物在测序仪上通过毛细管电泳-单链构象多态性（CE-SSCP）分析,通过不同细菌的峰谱不同达到快速鉴定病原菌目的.结果 所有受试细菌经过CE-SSCP分析后都有各自不同的峰谱出现,相互之间容易区别.结论 利用PCR-CE-SSCP作为病原菌鉴定手段,高效、准确,较传统方法省时,而且灵敏度较高,是一种很有应用前景的细菌快速鉴定方法.     

High-throughput screening of bacterial pathogens in clinical specimens using 16S rDNA qPCR and fragment analysis

Molecular-based detection of bacterial pathogens directly from clinical specimens permits rapid initiation of effective antimicrobial treatment and adequate patient management. Broad-range polymerase chain reaction (PCR) amplification of the 16S rRNA gene (16S rDNA qPCR) is used in many diagnostic laboratories as a complement to cultural identification of bacterial pathogens. However, efforts for automation of 16S rDNA PCR workflows are needed in order to reduce turnaround times and to enhance reproducibility and standardization of the technique. In this retrospective method evaluation study, clinical specimens (N?=?499) from patients with suspected bacterial infections were used to evaluate 2 diagnostic semiautomated workflows for rapid bacterial pathogen detection. The workflows included automated DNA extraction (QIASymphony), 16S rDNA qPCR, fragment or melting curve analysis, and amplicon sequencing. Our results support the use of the 16S rDNA qPCR and fragment analysis workflow as it enabled rapid and accurate identification of bacterial pathogens in clinical specimens.     

细菌rDNA分类鉴定的方法学研究

目的 研究细菌rDNA快速鉴定方法.方法 以细菌16S rDNA、16S-23S rDNA基因间隔区（ISR）和常见细菌耐药基因为对象,通过改进标本中细菌DNA提取方法,指纹分析、直接测序与多重聚合酶链反应（PCR）技术,建立快速细菌分子鉴定方法.结果 细菌属种不同表现出独特的16S-23S rDNA ISR指纹,在分析软件指导下进行初步细菌鉴定和亲缘关系研究;16S rDNA和16S-23SrDNA ISR序列可确定细菌种与型;序列分析与生化鉴定一致.多重PCR可解决葡萄球菌16S rDNA与mecA基因、产超广谱β内酰胺酶菌16S rDNA与TEM和SHV基因同步检测.结论 细菌rDNA分类方法,提高了非培养细菌的鉴定能力.     

临床常见病原菌16S rDNA单链构象多态性分析

目的原核生物的rRNA基因位点具有高度的保守性,同时不同种属细菌之间又存在相对稳定的变异性,因此可被用于细菌的分类和鉴定。本研究试图利用16SrRNA基因结合分子生物学方法,达到快速鉴定临床常见病原菌的目的。方法收集临床常见各种病原菌333株,筛选2对通用引物在5′端用不同荧光标记,然后对细菌基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增,产物在测序仪上通过毛细管电泳-单链构象多态性(CE-SSCP)分析,通过不同细菌的峰谱不同达到快速鉴定病原菌目的。结果所有受试细菌经过CE-SSCP分析后都有各自不同的峰谱出现,相互之间容易区别。结论利用PCR-CE-SSCP作为病原菌鉴定手段,高效、准确,较传统方法省时,而且灵敏度较高,是一种很有应用前景的细菌快速鉴定方法。     

16S metagenomics for diagnosis of bloodstream infections: opportunities and pitfalls

Introduction: Bacterial bloodstream infections (BSI) form a large public health threat worldwide. Current routine diagnosis is based on blood culture (BC) but this technique suffers from limited sensitivity. Molecular diagnostic tools have been developed for identification of bacteria in the blood of BSI patients. 16S metagenomics is an open-ended technique that can detect simultaneously all bacteria in a given sample based on PCR amplification of the 16S ribosomal RNA gene (rDNA) followed by sequencing of the PCR amplicons and taxonomic labeling of the sequence reads at genus or species level.

Areas covered: Here we review the studies that have used 16S metagenomics for the identification of bacteria in human blood samples. We also discuss the potential added value of 16S metagenomics in the diagnosis of BSI, challenges as well as future directions for implementation in clinical settings.

Expert commentary: 16S metagenomics has the potential to complement conventional BC; however, the technique currently suffers from several technical limitations jeopardizing implementation in routine clinical microbiology laboratories. Further studies are required to assess the cost-efficiency and clinical impact of 16S metagenomics in comparison to BC which remains the gold standard diagnostic method for BSI.     

嗜麦芽寡氧单胞菌临床株与环境株的16S rRNA基因序列及系统发育分析

目的:比较嗜麦芽寡氧单胞菌临床株与环境株16S rRNA基因序列,构建系统发育树,分析其进化关系.方法:对选取的3株嗜麦芽寡养单胞菌临床株和1株环境株的16S rRNA基因进行PCR扩增并测序.将上述及从GenBank中挑选出的其他32株不同来源的嗜麦芽寡养单胞菌的16S rRNA基因序列进行对比分析.并绘制系统发育树.结果:系统发育分析表明大部分菌株可根据来源分为3个簇,序列分析显示某些高度可变区可能存在可区分临床株与环境株的关键序列.结论:嗜麦芽寡养单胞菌基因型及表现型具有多样性:大部分嗜麦芽寡氧单胞菌临床株与环境株可根据16S rRNA基因序列进行鉴别.     

16S rDNA实时荧光定量PCR法与全自动培养法在血小板细菌污染检测中的应用比较

目的比较16S rDNA实时荧光定量PCR法与全自动培养法在血小板制品细菌污染检测中的灵敏度和特异性,评价2种方法的应用前景。方法将血小板制品污染中常见的6种细菌用浓缩血小板悬液进行稀释,并选取浓度为102、101、100的菌悬液,分别用实时荧光定量PCR法和全自动培养法进行检测。结果用16S rDNA实时荧光定量PCR法对6株细菌检测,其灵敏度和特异性均为100%,Κ=1.000。用全自动培养仪对6株细菌检测,其特异性均为100%;灵敏度分别为:金黄色葡萄球菌需氧瓶95.5%,Κ=0.886,厌氧瓶90.9%,Κ=0.787;表皮葡萄球菌及大肠杆菌2种培养瓶均为83.3%,Κ=0.667;蜡样芽孢杆菌2种培养瓶均为86.7%,Κ=0.684;铜绿假单胞杆菌需氧瓶度为100%,Κ=1.000,厌氧瓶为44.4%,Κ=0.286;痤疮丙酸杆菌需氧瓶为16.7%,Κ=0.105,厌氧瓶为91.7%,Κ=0.886。结论实时荧光定量PCR法检测血小板制品中的细菌污染,灵敏度高,特异性好,且省时、经济,能应用于临床上血液样本的大规模筛查。     

质粒介导16S rRNA甲基化酶肺炎克雷伯菌临床分离株的检测及分子流行病学研究

目的 调查165 rRNA甲基化酶在肺炎克雷伯菌临床分离株中的流行情况.方法 收集我院2006年1月至2007年9月从临床标本中分离的肺炎克雷伯菌337株,所有菌株均为非重复株.菌种鉴定采用全自动微生物分析仪,庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素的药敏试验采用琼脂稀释法.超广谱B内酰胺酶(ESBLs)检测采用美国临床和实验窒标准协会(CLSI)规定的纸片确证法.使用PCR检测16S rRNA甲基化酶基因、整合酶基因和ESBL基因.接合试验检测质粒的可转移性;脉冲场电泳分析菌株的同源性.结果 337株肺炎克雷伯菌对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐药率分别为19.0%(64/337)、8.3%(28/337)和16.3%(55/337).21株16S rRNA甲基化酶基因阳性,阳性率为6.2%(21/337),其中13株rmtB阳性、3株armA阳性、5株rmtB和atmA同时阳性.所有16S rRNA甲基化酶基因阳性株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星同时耐药且都为高度耐药(MICs≥256μL),21株甲基化酶基因阳性株有19株产ESBLs,ESBL基因主要为CTX-M-14-like、CTX-M-15-like和SHV-12-like.21株均为Ⅰ类整合酶基因阳性.13株通过接合试验把质粒传递给受体菌E. coliJ53.所有接合子Ⅰ类整合酶基因阳性、blaTEM-1基因阳性、产ESBLs及对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和复方磺胺甲噁唑耐药,对其他抗菌药物敏感.接合子ESBL基因型与供菌一致.21株16S rRNA甲基化酶基因阳性株经脉冲场凝胶电泳(PFGE)分成14个基因型,主要为A型和Ⅰ型.结论 armA和rmtB型16S rRNA甲基化酶基因已经在肺炎克雷伯菌中播散,既可通过克隆株播散也可通过接合性质粒在不同菌株间播散.     

16SrRNA、16S-23SrRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较

目的比较细菌16SrRNA、16S-23SrRNA基因测序分析在血流感染病原菌检测中的作用。方法提取临床上血流感染常见的金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组DNA,运用16SrRNA、16S-23SrRNA基因进行PCR扩增。扩增产物经测序后在美国国家生物技术中心（NCBI）上进行比对分析,确定菌种。结果在所分析的19种临床血流感染常见细菌中,16SrRNA基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属;16S-23SrRNA成功鉴定17种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平。结论16S-23SrRNA基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标。     

慢性前列腺炎患者前列腺液细菌16SrRNA基因的检测

目的通过采用聚合酶链反应（PCR）技术对慢性前列腺炎患者前列腺液中细菌16SrRNA基因检测,探讨PCR方法诊断慢性前列腺炎细菌学病因的价值。方法收集102例慢性前列腺炎患者的前列腺液进行细菌培养,同时采用PCR法检测前列腺液中细菌16SrRNA基因,并测定和分析所得片段的DNA序列。对培养结果与PCR法检测结果进行了比较。结果102份前列腺液标本中,细菌培养法18例阳性,84例阴性,阳性率17．7％;PCR法71例阳性,31例阴性,阳性率69．6％。细菌培养法与PCR法检测结果比较,其差异有统计学意义（P〈0．05）。测序结果显示DNA序列与GenBank公布的16SrRNA基因序列具有很高的同源性。结论PCR技术对慢性前列腺炎的临床诊断具有重要意义。