骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

背景:半月板损伤后自行修复能力有限,组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径.骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞.目的:观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性.方法:采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞.取第3代的骨髓间充质干细胞,实验组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化,对照组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液.在诱导第7,14,21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果.结果与结论:①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为2 d,第4代以后相对延长,为5～9 d.②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变.③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色,尤其细胞密集生长的区域蓝染较深,染色强度随诱导时间延长而增强.对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染.④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性,各期染色无明显差异.对照组未见Ⅱ型胶原表达,实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达.提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质,作为半月板组织工程种子细胞来源可行.     

大鼠骨髓间充质干细胞在特定培养液条件下向软骨细胞表型定向分化的实验

背景：组织工程化软骨的构建为软骨缺损的修复开辟了全新的途径，克服了传统治疗方法的不足、目的：探讨分离骨髓间充质干细胞，在特定培养液条件下诱导其向软骨细胞表型转化的体外培养方法。设计：完全随机实验单位：广西医科大学第一附属医院创伤骨科、手外科及广西医科大学组织学与胚胎学教研率方法：实验于2002-08／2003-04在广西医科大学完成。实验动物选择新生断奶SD大鼠20只抽取大鼠四肢骨髓，Perrcoll梯度分离液离心分离结合贴擘筛选法得到间充质下细胞，在含体积分数0．15的胎牛血清的低糖DMEM培养液中，置于37℃，体积分数为0．05的CO2培养箱内培养10～14d。传代后以体积分数0.15的胎牛血清的高糖DMEM培养液（含转化生长因子β1 10μg/L．地塞米松10^-7mol/L维生素C50mg／L）对其进行诱导培养。主要观察指标：观测在体外特定培养条件下间充质干细胞的形态、生长特点和诱导培养后软骨特异性基质的表达情况结果：所有20只SD大鼠全部进行分析观察，无一例脱失：①分离获取了较高纯度的骨髓间充质干细胞，保持了细胞的活性。②骨髓间充质干细胞原代培养晕均匀分布的集落样生长，呈长梭形；传代培养中形态特性无明显变化，细胞增殖周期缩短，细胞均质性明显提高。③诱导后的细胞由梭形向多角形转变，Ⅱ型胶原免疫组化阳性。④诱导培养后软骨特异性基质Ⅱ型胶原免疫组化阳性结论：①采用Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法可获得较高纯度和活性的骨髓间充质十细胞②间充质于细胞在体外特定培养条件下能大量增殖，实现数量扩增、③间充质干细胞在特定培养液的诱导下能向软骨细胞表型转化，并能分泌软骨特异性基质，可成为软骨组织工程理想的种子细胞。     

转化生长因子β3诱导藻酸钠微球内骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化过程中胰岛素样生长因子Ⅰ的协同效应

背景: 近年来利用藻酸盐微球包被骨髓间充质干细胞进行软骨细胞定向诱导逐渐开展.目的: 采用体外藻酸钠微球三维立体培养骨髓间充质干细胞,观察转化生长因子β3在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中胰岛素样生长因子Ⅰ的作用.设计、时间及地点: 细胞组织工程体外实验,于2007-03/10在武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室完成.材料: SPF级1月龄雄性Wistar大鼠7只用于制备骨髓间充质干细胞.藻酸钠盐、胰岛素样生长因子Ⅰ,转化生长因子β3均为Sigma公司产品.方法: 第5代骨髓间充质干细胞以3X109>L-1密度重悬于1.2%藻酸钠盐溶液中,用22号针头将该溶液缓慢滴加在100mmol/L氯化钙溶液中使其聚合形成凝胶,10min后洗涤微球2次,即为包被骨髓间充质干细胞的藻酸盐微球.联合组加入含100μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ、10μg/L转化生长因子β3的软骨诱导培养基,诱导3周.同时设立胰岛素样生长因子Ⅰ组、转化生长因子β3组、空白对照组.主要观察指标: 甲苯胺蓝染色检测细胞外基质的形成,RT-PCR法及免疫组织化学法检测Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达,Western blot检测Sox9蛋白表达及其与PCR产物的相关性.结果: 包被于藻酸盐微球的骨髓间充质干细胞经胰岛素样生长因子Ⅰ、转化生长因子β3联合诱导3周,细胞周围有大量均质蓝染物质.联合组Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA及蛋白表达水平最高,转化生长因子β3组表达居中,胰岛素样生长因子Ⅰ组表达较弱,空白对照组几乎无表达(F=10.52,P<0.01).各组Sox9蛋白表达水平与上述指标类似(F=7.95,P<0.05),Sox9与Ⅱ型胶原、aggrecan的相关系数分别为0.95和0.91.结论: 体外定向诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的过程中,胰岛素样生长因子Ⅰ可能通过促进Sox-9的表达来起到与转化生长因子β3的协同效应.     

藻酸钠微球介导髓核细胞对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响

背景：椎间盘退行性变的理想治疗方法是利用组织工程技术修复退行性变的椎间盘,而修复所需的髓核细胞来源十分有限。目的：观察在藻酸盐微球的介导下,髓核细胞与骨髓间充质干细胞非接触共培养时,髓核细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用。设计、时间及地点：细胞学体外观察,实验于2007-10/2008-08在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和中心实验室进行。材料：4月龄健康新西兰大耳白兔5只,取髓核细胞与骨髓间充质干细胞原代培养,利用传代法分离纯化。方法：①将纯化的骨髓间充质干细胞经胰蛋白酶消化、收集,并与适量的藻酸钠溶液混合,形成109L-1的单细胞悬液,将混合好的单细胞悬液经注射器滴加至35g/L的CaCl2溶液中,形成海藻酸钙凝胶珠。②将海藻酸钠凝胶微球与髓核细胞共培养。在7d和15d时,分组溶解海藻酸钙凝胶珠,收集骨髓间充质干细胞。主要观察指标：利用免疫组化技术、RT-PCR技术和Westernblot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达,用以判断髓核细胞对骨髓间充质干细胞在非接触条件下的诱导作用。结果：在骨髓间充质干细胞的细胞爬片免疫组化染色中可见,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖染色阳性,RT-PCR和Westernblot结果显示经诱导后骨髓间充质干细胞中已有Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖基因的表达,且诱导15d组的目的条带明显亮于诱导7d组的目的条带。结论：在藻酸盐微球的介导下,体外非接触共同培养时髓核细胞能够实现对骨髓间充质干细胞的诱导作用。     

间充质干细胞向软骨细胞表型分化的研究进展

软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞,负责维持细胞外基质的稳态与平衡,软骨细胞数量的丢失和功能的失衡在骨关节炎的发病中起关键作用。但是由于关节软骨几乎没有再生能力,目前临床上用来治疗关节软骨缺损的方法和药物难以获得满意的疗效。软骨组织工程致力于通过人工手段在体内外生成透明软骨,为关节软骨缺损的修复提供了一条新的方法。间充质干细胞作为软骨组织工程的种子细胞可在特定诱导条件下分化为软骨细胞。因此,阐明该过程中软骨形成的相关转录因子和具体机制对于未来软骨再生医学的成功至关重要。     

骨髓间充质干细胞在诱导液条件下向软骨细胞的定向诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞易于从骨髓中分离,来源取材方便,对供体损伤小,具有强大的增殖能力及多向分化潜能,便于自体移植,如能成功诱导为软骨细胞将是软骨组织工程理想的种子细胞.目的:观察体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化,并对分化后细胞进行鉴定.设计、时间及地点:细胞形态学、蛋白质组学的比较观察于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于二三个月龄新西兰健康大白兔,体质量2～2.5 kg.方法:采用全骨髓法分离培养兔骨髓间充质干细胞.取生长良好的细胞第4代细胞消化传代,以1×105密度接种于24孔板中将生长状态良好的细胞在含有地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C及转化生长因子β的培养液中诱导分化. 主要观察指标:采用免疫组化的方法进行细胞鉴定,RT-PCR法检测诱导分化细胞 Ⅱ型胶原的表达.结果:骨髓间充质干细胞经成骨诱导后,由长梭形变为椭圆形及肾形.免疫组织化学方法显示所培养间充质干细胞不表达CD34、CD45,但CD105显阳性.骨髓间充质干细胞在未经诱导时不表达Ⅱ型胶原蛋白,经诱导后在500～750 bp之间可见明显条带.结论:骨髓间充质干细胞经含地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子维生素C及转化生长因子β等培养液诱导后,可以在体外向软骨细胞转化,高表达Ⅱ型胶原,并经细胞形态学及蛋白质组学RNA水平鉴定验证.     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化

目的：探讨小香猪骨髓间充质干细胞（MSC）向成骨细胞和成软骨细胞诱导分化的能力。方法：选用早期贴壁培养的小香猪骨髓MSC，在传代两三次后加入条件培养基，观察了细胞的形态学变化，同时检测碱性磷酸酶、钙盐沉积以及细胞外基质和Ⅱ型胶原的表达。结果：MSC在骨形成蛋白（BMP）、地塞米松和β－磷酸甘钠的作用下，两三天细胞从梭形变为圆形或类圆形，细胞体积增大，12－15d时细胞集落的表面可见有颗粒状物质分泌，碱性磷酸酶染色为阳性，20－25d时，分泌颗粒更加明显，核固红染色为阳性，表现出成骨细胞的特点，在培养体系中加入地塞米松和转化生长因子－β1后两三，可见细胞由类成纤维状变为圆形成椭圆形状，有的呈肾性，体积增大，10d后可见细胞周围有基质分泌，Ⅱ型胶原染色为阳性，表现为软骨细胞分化的特点。结论：在一定培养条件下成功诱导小香猪骨髓MSC向成骨细胞和成软骨细胞分化，为我们进一步的研究打下基础。     

与软骨细胞共培养和条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的比较

背景:骨髓间充质干细胞体外转化很大程度上依赖于合适的培养条件。目的:比较与软骨细胞共培养和条件培养液2种不同的诱导方案诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特点。方法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳软骨细胞,采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养及条件培养液诱导成软骨的方法,诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。以MTT法及流式细胞仪检测细胞活性及周期,糖胺多糖、甲苯胺蓝以及免疫组化染色检测细胞生物学特性,以RT-PCR法检测诱导后的软骨细胞Ⅱ型胶原RNA表达情况。结果与结论:采用共培养方式诱导的软骨细胞,其生物学特性与采用条件培养液诱导的软骨细胞相比,前者优于后者,如分泌糖胺多糖的能力以及基质分泌量均较高。提示共培养方式诱导的软骨细胞更接近正常软骨细胞,更有利于作为组织工程软骨的种子细胞。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化

目的探讨小香猪骨髓间充质干细胞(MSC)向成骨细胞和成软骨细胞诱导分化的能力。方法选用早期贴壁培养的小香猪骨髓MSC,在传代两三次后加入条件培养基,观察了细胞的形态学变化,同时检测碱性磷酸酶、钙盐沉积以及细胞外基质和II型胶原的表达。结果MSC在骨形成蛋白(BMP)、地塞米松和β-磷酸甘油钠的作用下,两三天细胞从梭形变为圆形或类圆形,细胞体积增大,12～15d时细胞集落的表面可见有颗粒状物质分泌,碱性磷酸酶染色为阳性,20～25d时,分泌颗粒更加明显,核固红染色为阳性,表现出成骨细胞的特点;在培养体系中加入地塞米松和转化生长因子-β1后两三天,可见细胞由类成纤维状变为圆形或椭圆形状,有的呈肾性,体积增大,10d后可见细胞周围有基质分泌,II型胶原染色为阳性,表现为软骨细胞分化的特点。结论在一定培养条件下成功诱导小香猪骨髓MSC向成骨细胞和成软骨细胞分化,为我们进一步的研究打下基础。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子B1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达。结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96．97％的细胞表达CD44、13.72％的细胞表达CD45,第2代有99．11％的细胞表达CD44、8．54％的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。     

骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用

目的:综述具有向多种细胞分化潜能的骨髓间充质干细胞的生物学特性、分离纯化与培养技术、向骨和软骨定向诱导分化技术、细胞载体支架及其应用于骨组织工程的实验研究。资料来源:应用计算机检索Medline数据库1990-01/2004-12期间的相关文章,检索词“mesenchymalstemcell,tissueengineer”,限定文章语言种类为英文。同时计算机检索中国期刊全文数据库、万方数据库1994-01/2004-12期间的相关文章,检索词″间充质干细胞、组织工程″,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,选取间充质干细胞特性、分离培养技术和其应用于组织工程的文献,重复研究选取代表性的、年代相对较近的文献作为纳入标准;然后筛除非骨组织工程的研究和重复研究,对剩余的文献开始查找全文。资料提炼:共收集到78篇关于间充质干细胞应用于组织工程方面的文章,纳入31篇;排除47篇,13篇为重复研究,34篇为非骨组织工程研究。资料综合:间充质干细胞主要存在于骨髓中,能向多种组织细胞分化,在体外可大量扩增。①间充质干细胞的分离纯化和培养目前主要有3种方法:密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、贴壁筛选法。也有学者采用单细胞克隆技术获得纯化的间充质干细胞细胞株,但此种方法不便于大量获得种子细胞,目前应用较广泛的是密度梯度离心技术。②间充质干细胞在适宜的培养基中加入诱导剂可向骨、软骨细胞分化,其理想的载体支架应能均匀地搭载并保留细胞,支持血管快速内生,能透X射线利于观察新骨形成,新骨形成后能被吸收和替代以利骨改建,能容许或提高宿主骨的骨传导性桥接,表面与细胞相互作用以保留分化细胞的功能,组织相容性好。③间充质干细胞是理想的基因治疗的靶细胞,它可以转入生长因子和细胞因子基因,经多次分裂后体外仍表达外源蛋白。它应用于骨组织工程的动物试验中已获得了成功。结论:以干细胞工程为代表的现代组织工程学近年来发展迅猛,但间充质干细胞组织工程学尚处于起步阶段。骨髓间充质干细胞具有易于取材、多组织分化潜能、遗传背景稳定、植入体内无排斥反应、高增殖的特性,决定了其将会成为细胞、基因治疗以及组织工程中十分有用的工具。     

骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用

目的：综述具有向多种细胞分化潜能的骨髓间充质干细胞的生物学特性、分离纯化与培养技术、向骨和软骨定向诱导分化技术、细胞载体支架及其应用于骨组织工程的实验研究。 资料来源：应用计算机检索Medline数据库1990—01／2004-12期间的相关文章，检索词“mesenchymal stem cell，tissue engineer”，限定文章语言种类为英文。同时计算机检索中国期刊全文数据库、万方数据库1994—01／2004—12期间的相关文章，检索词”间充质干细胞、组织工程”，限定文章语言种类为中文。 资料选择：对资料进行初审，选取间充质干细胞特性、分离培养技术和其应用于组织工程的文献，重复研究选取代表性的、年代相对较近的文献作为纳入标准；然后筛除非骨组织工程的研究和重复研究，对剩余的文献开始查找全文。 资料提炼：共收集到78篇关于间充质干细胞应用于组织工程方面的文章，纳入31篇；排除47篇，13篇为重复研究，34篇为非骨组织工程研究。 资料综合：间充质干细胞主要存在于骨髓中，能向多种组织细胞分化，在体外可大量扩增。①间充质于细胞的分离纯化和培养目前主要有3种方法：密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、贴壁筛选法。也有学者采用单细胞克隆技术获得纯化的间充质干细胞细胞株，但此种方法不便于大量获得种子细胞，目前应用较广泛的是密度梯度离心技术。②间充质干细胞在适宜的培养基中加入诱导剂可向骨、软骨细胞分化，其理想的载体支架应能均匀地搭载并保留细胞，支持血管快速内生，能透X射线利于观察新骨形成，新骨形成后能被吸收和替代以利骨改建，能容许或提高宿主骨的骨传导性桥接，表面与细胞相互作用以保留分化细胞的功能，组织相容性好。③间充质干细胞是理想的基因治疗的靶细胞，它可以转入生长因子和细胞因子基因，经多次分裂后体外仍表达外源蛋白。它应用于骨组织工程的动物试验中已获得了成功。 结论：以干细胞工程为代表的现代组织工程学近年来发展迅猛，但间充质干细胞组织工程学尚处于起步阶段。骨髓间充质干细胞具有易于取材、多组织分化潜能、遗传背景稳定、植入体内无排斥反应、高增殖的特性，决定了其将会成为细胞、基因治疗以及组织工程中十分有用的工具：     

三维支架中骨髓间充质干细胞及软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞的成软骨效应

背景：软骨修复的关键是种子细胞在三维支架中的定向分化,但细胞放入三维支架中很难有透明软骨表现。目的：考察3种种子骨髓间充质干细胞,软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞在支架中的成软骨特性。方法：抽取羊骨髓,胰酶消化后获得原代骨髓间充质干细胞细胞、软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞,单层培养扩增。取P1骨髓间充质干细胞,P3软骨细胞和P3脂肪源性成熟基质细胞种植入不同比例（10%,20%,50%,80%,100%）的胶原/透明质酸支架中,在无血清培养液中三维培养。2周后,用SO染色和免疫组织化学染色分析,观察硫酸软骨素和Ⅱ型胶原合成情况。结果与结论：种子细胞在三维支架中特定条件下有成软骨效应,骨髓间充质干细胞在含20%透明质酸的胶原/透明质酸支架扩增少于3代有成软骨效应,软骨细胞传代数更高仍然有成软骨效应,但脂肪源性成熟基质细胞成软骨效应能力较弱。结果提示,在同样条件下骨髓间充质干细胞、软骨细胞较脂肪源性成熟基质细胞有更好的成软骨性能。     

三维支架中骨髓间充质干细咆及软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞的成软骨效应

背景:软骨修复的关键是种子细胞在三维支架中的定向分化,但细胞放入三维支架中很难有透明软骨表现.目的:考察3种种子骨髓间充质干细胞,软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞在支架中的成软骨特性.方法:抽取羊骨髓,胰酶消化后获得原代骨髓间充质干细胞细胞、软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞,单层培养扩增.取P1骨髓间充质干细胞,P3软骨细胞和P3脂肪源性成熟基质细胞种植入不同比例(10%,20%,50%,80%,100%)的胶原,透明质酸支架中,在无血清培养液中三维培养.2周后,用SO染色和免疫组织化学染色分析,观察硫酸软骨素和Ⅱ型胶原合成情况.结果与结论:种子细胞在三维支架中特定条件下有成软骨效应,骨髓间充质干细胞在含20%透明质酸的胶原/透明质酸支架扩增少于3代有成软骨效应,软骨细胞传代数更高仍然有成软骨效应,但脂肪源性成熟基质细胞成软骨效应能力较弱.结果提示,在同样条件下骨髓问充质干细胞、软骨细胞较脂肪源性成熟基质细胞有更好的成软骨性能.     

自体骨髓间充质干细胞移植治疗心绞痛临床研究

目的:评价自体骨髓间充质干细胞移植治疗心绞痛的安全性和有效性.方法:40例心绞痛患者,分为观察组与对照组各20例.观察组在接受常规药物治疗和经皮冠状动脉介入治疗后,行冠状动脉内自体骨髓间充质干细胞移植,对照组仅接受常规药物治疗和经皮冠状动脉介入治疗.2组在术前和术后6个月行二维超声、单光子体层扫描和动态心电图检测;在术中、术后3,6个月观察2组是否有心肌梗死、心律失常等并发症,并评价疗效.结果:观察组心绞痛发作频率、硝酸甘油用量、运动时间及加拿大心血管学会心绞痛分级明显优于对照组(P<0.05).与对照组比较,观察组灌注缺损明显减小(P<0.01).2组均无心肌梗死、心律失常及其他不良事件发生.结论:冠状动脉内注射自体骨髓间充质干细胞治疗心绞痛安全有效.     

构建可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系**

背景：高草酸尿是结石形成的危险因素之一,利用基因工程和干细胞技术构建具有高代谢草酸能力的细胞系,将成为防治草酸钙结石的有效手段。目的：将产甲酸草酸杆菌的草酸分解基因 Frc 和 Oxc 共转染至正常成人骨髓间充质干细胞,构建可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系,使之获得分解草酸的功能。方法：PCR 法扩增出 Frc 和 Oxc 基因的编码序列,构建真核表达载体 pLEGFP-N1-myc-Frc 和pBaBE-puro-flag-Oxc,将其共转染至正常成人骨髓间充质干细胞,以转染空载体及未进行转染的正常成人骨髓间充质干细胞作为对照。采用 Western blot 检测目的基因表达情况;离子色谱法测定转基因后细胞培养液中草酸浓度。结果与结论：酶切鉴定和测序结果显示实验成功扩增了 Frc 和 Oxc 基因,并构建了 pLEGFP-N1-myc-Frc 和pBaBE-puro-flag-Oxc 载体。将其转染至正常成人骨髓间充质干细胞后,Western blot 检测结果显示其可稳定表达目的蛋白 myc-甲酰辅酶 A 转移酶和 flag-草酰辅酶 A 脱羧酶;离子色谱仪检测结果显示,随着培养时间的延长,转染目的基因的人骨髓间充质干细胞培养液中草酸浓度逐渐下降。而转染空载体及未进行转染的正常成人骨髓间充质干细胞无目的蛋白表达,也无分解草酸能力。说明实验成功构建了可分解草酸的成人骨髓间充质干细胞系,该细胞系可稳定表达草酸分解蛋白 Frc 和 Oxc,并具有草酸分解能力。     

胶原-壳聚糖支架材料与间充质干细胞的组织相容性

背景:近年来一些研究发现胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料可作为神经组织工程的支架材料,但相关细胞相容性研究较少。目的:观察兔骨髓间充质干细胞在胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料表面生长及分化情况。方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,无血清培养液培养,流式细胞仪检查细胞表型;然后,将其接种到凝胶支架材料表面(实验组)及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面(对照组),神经诱导培养基内培养,倒置相差显微镜观察干细胞的生长及分化情况。结果与结论:细胞表型为CD29+、CD44+、CD166+。倒置相差显微镜观察:实验组中,接种的骨髓间充质干细胞生长良好,7d后可见有突起神经细胞,细胞生长情况与对照组未见有明显差别。证实胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料对骨髓间充质干细胞有良好细胞相容性。     

胶原-壳聚糖支架材料与间充质干细胞的组织相容性

背景：近年来一些研究发现胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料可作为神经组织工程的支架材料,但相关细胞相容性研究较少。目的：观察兔骨髓间充质干细胞在胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料表面生长及分化情况。方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,无血清培养液培养,流式细胞仪检查细胞表型;然后,将其接种到凝胶支架材料表面（实验组）及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面（对照组）,神经诱导培养基内培养,倒置相差显微镜观察干细胞的生长及分化情况。结果与结论：细胞表型为CD29＋、CD44＋、CD166＋。倒置相差显微镜观察：实验组中,接种的骨髓间充质干细胞生长良好,7d后可见有突起神经细胞,细胞生长情况与对照组未见有明显差别。证实胶原蛋白-壳聚糖复合支架材料对骨髓间充质干细胞有良好细胞相容性。     

视网膜干细胞培养上清液诱导骨髓间充质干细胞的分化

背景：骨髓间充质干细胞向神经细胞诱导分化可为神经系统受损伤后的修复和再生带来了新的希望。
　　目的：探讨骨髓间充质干细胞在视网膜干细胞培养上清液诱导条件下向神经元细胞分化。
　　方法：采用全骨髓培养方法,用视网膜干细胞培养上清液诱导骨髓间充质干细胞,通过免疫荧光染色鉴定其分化的结果。
　　结果与结论：诱导72 h,骨髓间充质干细胞表达神经干细胞的特异性抗体巢蛋白和神经元中的标志性微管相关蛋白微管相关蛋白2。视网膜干细胞培养上清液能够促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,提示视网膜干细胞可能分泌神经生长因子。     

藻酸盐凝胶三维培养条件下体外定向诱导骨髓间充质干细胞成软骨

背景:目前有关诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究不少,但选用何种生长因子调节以及如何保证其持续高效刺激尚处于探索阶段.目的:实验以软骨源性形态发生蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein 1,CDMP1)和转化生长因子β1(transforming growth factor-β 1,TGF-β1)作为主要诱导因子,通过三维培养微环境诱导,观察独立及联合应用时,促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化的能力.设计、时间及地点:体外观察实验,于2007-04/2008-04在辽宁医学院附属医院耳鼻喉实验室完成.材料:选择辽宁医学院附属第一医院自然流产或咪嗦流产的12-20周胚胎,胚胎的使用经孕妇同意.实验经医院医学伦理委员会批准.方法:无菌条件下取出胚胎股骨,用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化人胚骨髓间充质干细胞,体外培养传代.采用特定的诱导培养液使骨髓间充质干细胞向软骨分化,按培养基内添加生长因子的为同分成4组:①联合诱导组:无血清的软骨诱导液+CDMP1(300 μ g/L)+TGF-β1(10 μg/L).②TGF-β1诱导组:无血清的软骨诱导液+TGF-β1(10 μg/L).③CDMP1诱导组:无血清的软骨诱导液+CDMP1(300μ g/L).④对照组:无血清的软骨诱导液.先进行单层细胞培养10 d,再置干藻酸盐凝胶中继续培养11 d.主要观察指标:①于培养21 d后倒置显微镜观察细胞在凝胶球中的生长和增殖情况.②二甲基亚甲基蓝比色法测定各组标本的铵聚糖含量.③免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原的表达.结果:第21天后,倒置显微镜观察藻酸盐凝胶呈现透明胶冻状,有黏性.加入不同生长因子的藻酸盐凝胶,细胞呈散在分布于凝胶介质中,呈现"悬浮"状态.第21天时联合诱导组铵聚糖含量、Ⅱ型胶原表达阳性率高于其他3组,差异有显著性意义(P＜0.05);TGF-β1诱导组、CDMP1诱导组铵聚糖含量、Ⅱ型胶原表达阳性率高于对照组,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:骨髓间充质干细胞在三维培养条件下,TGF-β1和CDMP1联合作用促进骨髓间充质干细胞成软骨的作用明显.