STAT-3基因腺病毒介导感染ARIP、AR42J细胞的表达

目的:探测4种腺病毒液在胰腺源ARIP、AR42J细胞中的表达,为基因改造干预干细胞分化治疗糖尿病的进一步研究提供基础。方法:①扩增、纯化STAT-3 WT、STAT-3 DN、STAT-3 CA、STAT-3 GF 4种质粒;脂质体转染法转染质粒进入人胚肾293腺病毒包装细胞系,Hela细胞作为包装细胞的对照细胞。②生产含4种基因组合的腺病毒,腺病毒检测、鉴定。③常规与盖玻片法ARIP、AR42J等细胞培养;含目的基因的腺病毒液感染目标细胞。④荧光显微镜观察感染后细胞的基因表达。结果:STAT-3腺病毒基因载体生产了较高滴度(病毒滴度为6 X106pfu/ml)的腺病毒,用含目的基因的腺病毒对靶细胞感染3 d后,荧光显微镜观察到ARIP等细胞中绿色荧光蛋白成功、高效的阳性表达报告。结论:腺病毒介导STAT-3 WT、STAT-3 DN、STAT-3 CA、STAT-3 GF进入ARIP细胞的良好表达为STAT-3基因改造病毒感染干预干细胞分化的进一步相关研究提供了重要依据。     

白蛋白/细胞角蛋白19启动子调控的红绿双色荧光蛋白报告载体的构建及其在肝干细胞分化研究中的应用

目的:利用报告基因监测肝干细胞的分化走向.方法:通过PCR从小鼠基因组中克隆了细胞角蛋白19启动子片段,构建了细胞角蛋白19启动子调控的绿色荧光蛋白(pCK19 EGFP)和白蛋白启动子调控的红色荧光蛋白报告载体(pAlbDsRed),并利用报告载体标记的肝干细胞(liver epithelial progenitor cells,LEPCs)观察了悬浮培养时LEPCs的分化去向.结果:白蛋白/细胞角蛋白19启动子调控的红绿双色荧光蛋白报告载体可以实时地显示肝原始细胞在不同的诱导环境下的分化走向.结论:双色荧光蛋白报告载体的成功构建为研究LEPCs的分化、筛选可诱导LEPCs定向分化的分子提供了便捷的工具.     

组蛋白赖氨酸甲基转移酶Setd7促进Ngn1基因的表达

目的 构建小鼠组蛋白赖氨酸甲基转移酶Setd7真核表达载体并初步探讨其对神经细胞分化的影响.方法 采用基因工程技术,克隆小鼠Setd7基因并将其插入真核表达载体pCMV-3tag-6中,之后转染HEK 293T细胞,Western blot验证其表达;利用实时荧光定量PCR技术检测在神经分化模型(全反式维甲酸诱导P19神经分化)中,Setd7对神经分化关键基因Ngn1的调控;利用双荧光素酶报告系统检测Setd7对Ngn1启动子活性的影响;构建小鼠Setd7 siRNA干扰质粒,利用实时荧光定量PCR技术检测其抑制效果以及对 Ngn1 mRNA表达的影响.结果 成功构建了小鼠Setd7基因的真核表达载体,可在HEK 293T细胞中有效表达;Setd7可促进Ngn1 mRNA表达;Setd7能够促进Ngn1启动子活性; 降低Setd7抑制Ngn1 mRNA 表达.结论 组蛋白赖氨酸甲基转移酶Setd7能够促进神经分化关键基因Ngn1的转录.     

人多药耐药基因1(mdr1)的克隆及重组腺病毒制备

目的:构建表达多药耐药基因1(MDR1)的重组腺病毒表达系统.方法:用基因工程技术将多药耐药基因1的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后在细菌内与pAdEasy同源重组,经脂质体转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒.将重组腺病毒Ad5-mdr1感染小鼠单个核细胞,通过荧光显微镜及流式细胞仪进行检测.结果:酶切鉴定及PCR结果证明多药耐药基因重组腺病毒载体构建成功,构建的人多药耐药基因1(mdr1)重组腺病毒载体的效价达到8.3×1011 pfu/ml.对小鼠单个核细胞的感染效率可达10%～15%,转染小鼠单个核细胞细胞48h后,可检测到mdr1基因的表达.结论:成功构建了表达多药耐药基因1的重组腺病毒载体,为后续对mdr1的相关研究创造了条件.     

小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.     

绿色荧光蛋白标记人脂肪基质细胞成骨分化能力体外实验研究

目的研究绿色荧光蛋白(GFP)基因体外转染人脂肪基质细胞的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法体外分离培养人脂肪基质细胞,用重组腺病毒载体Ad-GFP及脂质体介导质粒pEGFP-C1两种方法转染GFP基因,通过流式细胞术观察比较GFP转染和表达的结果;倒置显微镜下观察细胞生长情况;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果重组GFP基因的腺病毒Ad-GFP转染的脂肪基质细胞的感染率达(42.5±1.5)%,16h即有GFP表达,7d时表达趋于稳定,感染6周时仍可见有GFP表达,明显优于脂质体转染组(转染效率最高为11.4%)。感染Ad-GFP后的脂肪基质细胞与未感染的对照组脂肪基质细胞成骨诱导分化后碱性磷酸酶(ALP)表达均逐渐增高,两组间差异无统计学意义(P>0.05);诱导21d后两组均见到茜素红钙盐染色阳性。结论重组GFP基因的腺病毒载体Ad-GFP可高效率感染脂肪基质细胞,基因转染后细胞的增殖分化能力未受到影响,可以作为一种高效可靠的人脂肪基质细胞标记方法。     

利用Gateway克隆技术构建人Hiwi腺病毒载体

目的：获得人的全长Hiwi编码区基因,构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人Hiwi腺病毒载体,为进一步研究Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法：运用重叠延伸PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长;利用Gateway克隆技术将Hiwi编码区基因全长插入带有GFP的载体Flag-IRES -hrGFP中构建成为pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP,再将克隆载体pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP与表达载体pAV.Des1d进行同源重组反应,得到重组腺病毒载体pAV.Ex1d-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP。经PCR筛选阳性克隆提取重组腺病毒质粒,包装成重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒。结果：人Hiwi全长编码区基因克隆成功,经酶切及基因测序鉴定证实重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒构建成功。采用Lipofectamine法将Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP转染入HEK293A细胞中,在荧光显微镜下,可以观察到转染细胞中的绿色荧光。结论：成功构建重组Ad- Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒,其可在HEK293A细胞内表达。     

小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况.方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测.结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012) pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力.结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体.     

小鼠MK基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的死亡受体(Mouse killer,MK)基因干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒并在小鼠子宫基质细胞中鉴定其干扰作用.方法:人工合成靶向MK的siRNA干扰序列,将其克隆到穿梭载体psES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-MKsiRNA,在HEK293细胞中包装并扩增腺病毒颗粒.用纯化后的腺病毒混合液感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞,RT-PCR及Western Blot检测基质细胞中MK的mRNA及蛋白表达水平.结果:Adeasy-SES-HUS-MKsiRNA混合液均效价为6.8 X 10~(11)pfu/ml,感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞48h后,MK的mRNA及蛋白水平均显著下调.结论:构建的MK干扰表达腺病毒能有效地抑制MK基因的表达,为进一步研究MK在小鼠子宫基质细胞的功能提供了有效的工具.     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

成人胰腺干细胞分离、培养及鉴定

目的：从成人胰腺组织中分离并鉴定胰腺干细胞。方法：利用含bFGF的有血清培养基分离、培养出具有高度增殖能力的细胞群，采用RT－PCR技术检测其Nestin mRNA及Insulin mRNA表达情况。同时诱导定向分化，观察其分化后的状态。结果：从成人胰腺组织中分离出的条索状细胞具有高度增殖能力，其Nestin mRNA表达阳性，而胰岛素Insulin mRNA表达阴性，分化后的细胞形成胰岛细胞团样结构。结论：本研究得到的细胞具有高度增殖能力和分化成胰岛细胞的潜能，是来源于胰腺的胰腺干细胞。     

胎胰蛋白促进人脂肪来源的间充质干细胞向胰岛素及C-肽阳性细胞的分化及细胞鉴定

目的：利用大鼠胚胎胰腺组织蛋白提取物诱导人脂肪来源的间充质干细胞(hASCs)向胰岛素分泌细胞分化,为临床胰岛移植寻找新的细胞来源。方法：将新生SD大鼠的胚胎胰腺匀浆后提取胎胰蛋白,重建胰腺微环境,诱导hASCs向胰腺方向分化。诱导组为胎胰蛋白培养组,对照组不添加胎胰蛋白,其余培养条件相同,诱导20 d后,荧光定量PCR技术检测2组胰腺发育相关基因的表达水平,ELISA法检测细胞悬液胰岛素水平,荧光免疫组织化学检测细胞C-肽蛋白表达。结果：在胎胰蛋白诱导过程中,hASCs重要标志基因Oct3/4及Nanog的表达持续降低,说明hASCs逐渐失去全能干细胞的特性;在诱导的第6天开始检测到PDX-1和CK-19的表达上调,诱导细胞出现了胰腺方向的分化,12 d开始检测到胰岛素的阳性表达。所获分化细胞基础相分泌胰岛素量为（287.17± 15.67） mIU•L^-1,高糖刺激下为（401.09±28.94 ）mIU•L^-1,二者比较差异有统计学意义（P<0.01）,且均明显高于对照组的（4.85±1.04） mIU•L-1 (P<0.01);免疫荧光检测,诱导组可见C肽阳性细胞,对照组未见C-肽阳性细胞。结论：模拟的微环境可诱导hASCs分化为有功能的胰岛素产生细胞,具有替代胰岛细胞治疗糖尿病的潜在可能性。     

胰腺干细胞和胰岛细胞在糖尿病 大鼠治疗中的疗效观察

目的 探讨大鼠胰腺干细胞与胰岛细胞移植在大鼠糖尿病治疗中的疗效。方法 通过链脲菌 素复制1 型糖尿病大鼠模型并随机分为胰岛细胞组和胰腺干细胞组。用胶原酶V 分别消化新生和成年大鼠 胰腺,Percoll 梯度离心分离胰岛细胞和胰腺干细胞。采用Bonner-Weir 法诱导胰腺干细胞分化,DTZ 染色 检测移植物纯度,AO/PI 检测移植物活性。分别记录手术前后大鼠血糖水平、胰岛素水平及移植物存活时 间;高糖刺激实验和腹腔糖耐量评价移植物功能;取各组大鼠移植部位标本行HE 染色和免疫组织化学染 色,观察组织形态学变化。结果 胰岛细胞组和胰腺干细胞组血糖分别在术后3 和5 d 恢复正常（P <0.05）, 两组大鼠术后不同时间点的血糖有差异（P <0.05）,胰腺干细胞组的降糖能力强于胰岛细胞组（P <0.05）。 两组大鼠移植后7 d 血清胰岛素水平均较术前升高（P <0.05）。高糖刺激实验表明,各组移植后15 和65 d 高糖刺激后的C 肽水平较刺激前升高（P <0.05）,胰岛细胞组移植后65 d 高糖刺激后C 肽水平低于胰腺 干细胞组（P <0.05）,胰岛素和C 肽水平监测结果表明胰腺干细胞组移植物胰岛素分泌维持时间长于胰岛 细胞组。移植后腹腔糖耐量实验结果表明移植物均功能良好。胰岛细胞组和胰腺干细胞组移植物的中位 存活时间分别为73 和88 d,Kaplan-Meier 曲线分析提示胰腺干细胞组移植物生存时间较胰岛细胞组延长 （P <0.05）。HE 染色提示肝脏门静脉移植区域可见新生血管包绕的胰岛细胞团,免疫组织化学染色证实细 胞团胰岛素阳性。结论 胰腺干细胞分化后经门静脉移植能安全有效地发挥降糖作用,疗效优于胰岛细胞 移植。     

BDNF和IGF-1对皮层神经干细胞向神经元定向分化的影响

目的:探讨脑源性神经营养因子(BDNF)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)对大鼠皮层神经干细胞向神经元定向分化的影响.方法:采用细胞培养技术、免疫细胞化学方法观察BDNF和IGF-1对皮层神经干细胞向神经元定向分化的影响.结果:皮层神经干细胞在去除丝裂原后开始进行分化,至7 d可分化为成熟神经元,神经元特异烯醇化酶(NSE)明显阳性.BDNF、IGF-1组与对照组相比,定向分化为神经元的比率增加21.7%(P＜0.01).结论:BDNF,IGF-1对皮层神经干细胞向神经元的定向分化具有促进作用.     

七种癌基因在HL-60-AR细胞中的表达及药物诱导分化后的变化

用Northern杂交和斑点杂交方法分别探测HL-60-AR细胞中七种癌基因的表达及其在诱导分化后的变化。结果表明,在HL-60-AR细胞中c-myc基因高度活跃表达,H-ras基因次之,fos、sis、abl和erb-B基因表达微弱,而K-ras基因表达极微弱或检测不出。当HL-60-AR细胞被药物诱导成熟分化后,c-myc基因表达大为下降,H-ras、fos、sis、abl和erb-B基因表达亦相应降低,而K-ras的表达则无变化。对诱导分化前后c-myc基因拷贝数的比较分析表明,c-myc基因表达下降可能主要发生在基因的转录或/和转录后调节水平。     

烟酰胺对高糖介导胰岛细胞bax及bcl-2表达的影响

目的 探讨烟酰胺对高糖环境下胰岛细胞bax及bel-2蛋白表达的影响。方法 体外培养大鼠胰岛细胞，应用免疫组化方法检测培养液中葡萄糖终浓度为22．2mmol／L及加入烟酰胺后胰岛细胞bax及bcl-2蛋白表达。结果 培养液中葡萄糖终浓度为22．2mmol／L时，胰岛细胞bax表达阳性，bcl-2表达较对照组降低。加入烟酰胺后bax表达降低，bcl-2表达增强。结论 烟酰胺能够上调bcl-2表达，下调bax表达，在高糖介导的胰岛细胞损伤中起一定作用。     

K562细胞向不同细胞系分化时bcl-6表达变化及其机制

目的 研究诱导K562细胞向不同髓系细胞系定向分化过程中bcl-6表达变化及其机制，以探讨bcl-6与K562细胞定向分化的关系。方法 以Western blot方法检测TPA（tetradecanoylphorbol 13-acetate）、羟基脲（Hu）及HMBA（hexamethylene bisacetamide）为诱导剂分别诱导K562细胞向巨核细胞系、红细胞系及巨噬细胞系分化时bcl-6表达变化。PCR、克隆、直接DNA测序方法分析bcl-6基因5′调控区序列变异情况。结果 bcl-6仅在TPA诱导K562细胞向巨核细胞分化时表达上调，bcl-6基因5′调控区序列未发现有突变发生。结论 bcl-6可能是调控K562细胞向不同细胞系定向分化的关键基因，在TPA诱导的K562细胞向巨核细胞分化过程中发挥重要作用，TPA诱导的K562细胞bcl-6表达上调与其调控区基因变异可能无关。     

SHH基因修饰的大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞向神经样细胞的诱导分化

目的: 探讨音猬因子（sonic hedgehog,SHH）基因转染对大鼠鼻黏膜外胚层间充质干细胞（ectomesenchymal stem cell, EMSCs）分化为神经样细胞的影响。方法: 利用组织贴壁法分离、培养和纯化EMSCs,SHH基因重组腺病毒转染EMSCs（SHH-EMSCs）,免疫荧光染色观察转染前后EMSCs的干细胞标志蛋白巢蛋白、波形蛋白和Connexin-43,蛋白质印迹检测SHH蛋白表达。诱导分化实验分为4组：SHH-EMSCs诱导组、SHH-EMSCs正常培养组、EMSCs诱导组、EMSCs正常培养组;倒置相差显微镜观察分化过程中细胞形态变化;免疫荧光染色和蛋白质印迹检测诱导后轴突膜蛋白（GAP-43）、 β-3微管蛋白（TUBB3）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和髓鞘碱性蛋白（MBP）的表达。并将SHH-EMSCs悬液注入大鼠脊髓组织内,观察该细胞在脊髓内存活和分化情况。结果： 免疫荧光染色结果显示,经SHH基因转染后的EMSCs巢蛋白、波形蛋白和Connexin-43阳性率达90%;蛋白质印迹结果显示,SHH蛋白表达明显升高。SHH-EMSCs诱导组培养7 d后,细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经细胞样形态;免疫荧光染色和蛋白质印迹结果表明SHH-EMSCs诱导组GAP-43、TUBB3、MBP和Smoothen的表达水平明显高于其他3组,差异有统计学意义;GFAP在4组细胞中均为弱表达,无显著差异。SHH EMSCs在大鼠脊髓内存活情况良好且表达TUBB3。 结论： SHH基因转染的EMSCs具有更高的向神经样细胞分化效率,并可在脊髓内存活;EMSCs可望成为移植脊修复髓损伤的一种新的种子细胞。     

成年大鼠非胰岛内Nestin阳性细胞的体外分离、培养及分化

目的:建立成年大鼠胰腺非胰岛内Nestin阳性细胞的体外分离培养及分化的方法。方法:采用胰管内注入胶原酶消化法分离3只成年大鼠胰腺组织,并经含10%胎牛血清RPMI 1640液（pH 7.6）体外培养,36 h后弃去悬浮细胞及胰岛,改用无10%胎牛血清RPMI 1640液（pH 7.4）加bFGF、EGF及N₂添加剂培养,18～22 d后收集新生类胰岛样细胞团并传代培养。挑选新分离的胰岛和新生类胰岛样细胞团每次各40个,共3次,采用¹³¹Ⅰ放射免疫法测定分离的胰岛及新生类胰岛样细胞团的胰岛素分泌量,并计算葡萄糖刺激指数（SI）;免疫荧光细胞化学法检查贴壁细胞及传代后的新生类胰岛样细胞团Nestin阳性细胞的表达。 结果:胰管内注入胶原酶消化法可获得功能、形态良好的胰岛;分离后胰腺组织在pH 7.6的10%胎牛血清RPMI 1640液培养条件下,36 h内胰岛细胞不贴壁,贴壁细胞中大多数表达Nestin阳性细胞,无胰岛素和胰高血糖素表达,但Nestin表达不一,培养18～22 d可见新生类胰岛样细胞团出现,新生类胰岛样细胞团传代后仍可见Nestin阳性细胞。新分离的40个胰岛在含糖3.3、16.7 mmol•L^-1培养液中胰岛素分泌量为(63.6±4.0)、(202.2±14.8)mIU•L^-1;而新生的40个类胰岛样细胞团胰岛素分泌量为(3.5±0.2)、(3.3±0.2)mIU•L^-1,差异有显著性（P<0.001）。 结论:胰管内注入胶原酶消化法可获得功能、形态良好的胰岛;在pH 7.6条件下可分离培养出成年大鼠胰腺非胰岛内Nestin阳性细胞,经无血清培养形成的类胰岛样细胞团,可传代培养,并表达胰岛素。胰腺非胰岛内Nestin阳性细胞具有胰腺干细胞特点。     

兔骨骼肌干细胞向平滑肌细胞分化的实验研究

目的:探讨兔骨骼肌干细胞(MDSCs)分离、鉴定及诱导分化为平滑肌细胞的方法。方法:应用酶消化法消化兔骨骼肌组织,应用改良差速贴壁法获得MDSCs,并用免疫组化和免疫荧光鉴定,体外诱导骨骼肌干细胞向平滑肌细胞定向分化,镜下观察细胞生长情况;Real-time PCR和Western blot检测平滑肌细胞特异标记α-SMA和SM-MHC的表达情况。结果:骨骼肌干细胞具有良好的增殖能力和分化潜能,免疫细胞化学染色法和免疫细胞荧光法显示MDSCs呈结蛋白、干细胞抗原-1(Sca-1)和CD34阳性,CD45阴性,诱导后细胞排列形态呈漩涡状,Real-time PCR和Western blot结果提示α-SMA和SM-MHC表达增高。结论:骨骼肌干细胞经体外培养及诱导后,呈明显的平滑肌细胞特性,可作为输尿管组织工程新的种子细胞来源。