简易法冻存脐血造血干细胞的研究

目的 :为脐血造血干细胞 (CBHSC)的冻存建立简便、经济且有效的方法。方法 :采用 5 %二甲基亚砜 (DMSO)加6 %羟乙基淀粉 (HES)为冷冻保护剂 ,不用程控降温装置 ,直接置 CBHSC于 - 80℃冰箱中降温 ,后分 - 80℃冰箱组和液氮组保存 1周至 3个月。结果 :冻存 3个月后 ,单个核细胞 (MNC)和粒 -单系造血祖细胞 (CFU- GM)的回收率及台盼兰拒染率在 - 80℃冰箱保存组分别为 (92 .9± 0 .8) % ,(82 .2± 19.6 ) % ,(82 .1± 1.4) % ;在液氮保存组分别为 (93.0± 1.2 ) % ,(93.6± 2 2 .2 ) % ,(85 .6± 1.5 ) %。结论 :这两种简便、经济的方法能很好地保存 CBHSC的造血潜能 ,能为脐血移植冻存CBHSC。     

-80℃冰箱降温-液氮冻存脐血造血干细胞

为脐血造血干细胞 (CBHSC)的冻存建立简便有效的方法 ,采用 5 %二甲基亚砜 (DMSO)加 6 %羟乙基淀粉 (HES)为冷冻保护剂 ,不用程控降温装置 ,直接置CBHSC于 -80℃冰箱中降温 ,次日移至液氮液中保存 1周、1个月、3个月、6个月。结果冻存 6个月后 ,单个核细胞 (MNC)、粒 -单系造血祖细胞 (CFU -GM )和CD+34 细胞的回收率及MNC的台盼蓝拒染率分别为 90 .5± 1.7% ,87.6± 19.5 % ,91.9± 2 .9% ,75 .8± 1.8%。认为这一简便的方法能很好地保存CBHSC的造血潜能 ,因此它能为脐血移植冻存CBHSC。     

脐血造血干细胞不同温度长期冻存效果的实验研究

目的通过观察在不同温度条件下长期冻存的效果,以探讨脐血造血干细胞适宜的保存时间。方法以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,分别采用-80℃冰箱直接冻存和程控降温-196℃液氮冻存,冻存前及冻存3、6及12个月后,应用全自动血细胞分析仪测定脐血单个核细胞(MNC)计数,台盼蓝拒染法显微镜下计数细胞存活率及流式细胞仪测定CD34 细胞计数。结果在-80℃冰箱冻存3个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较差异均无显著性。冻存6个月后,脐血台盼蓝拒染率较冻存前差异有显著性(P<0.05)。冻存12个月后,脐血各项指标较冻存前差异均有显著性,其中台盼蓝拒染率差异存在非常显著性(P<0.01)。在-196℃液氮冻存3、6及12个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较均无显著差异。结论以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,脐血造血干细胞在-80℃冰箱中可以有效保存3个月,6个月后存在部分细胞损害,此时的脐血不适合作干细胞移植。脐血经程控降温-196℃液氮冻存12个月后,造血干细胞仍保存完好,适宜长期保存。     

人脐血基质细胞深低温保存的实验研究

目的　探讨一种简便可行的人脐血基质细胞冻存方法。方法　采用 5 %二甲基亚砜 (DMSO) ,3%羟乙基淀粉 (HES)和 4 %人血白蛋白 (HAS)作冷冻保护剂 - 80℃冻存人脐血基质细胞 ,观察不同时相点的基质细胞活性、细胞计数 ,回收率 ,基质细胞集落形成单位 (CFU F)及其支持集落生长的作用 (CFU S ,CFU GM ,CFU E)。结果　保存 6个月后人脐血基质细胞的细胞活性仍保持在 (90 .6± 2 .8) % ,CFU F产率也达到 (83.6± 1 .8) % ,其支持集落生长的作用与保存前无统计学差异。结论　本方法是一种简便易行的人脐血基质细胞保存法     

不同的冻存方法对脐血CD34~+细胞的影响

目的 :研究不同冻存方法对脐血CD34+ 细胞的影响 ,探讨脐血CD34+ 细胞先分离后冻存的可能性 ,以寻找脐血保存的更好方法。方法 :对 31份脐血采用全脐血直接冻存 ,分离为单个核细胞冻存 ,和分离为CD34+ 细胞冻存 ,3种不同的冻存方法 ;用造血祖细胞培养技术、活细胞染色技术、流式细胞技术等方法研究冻存前后脐血造血祖细胞活性的变化。结果 :冻存后细胞活度下降 ,集落形成率下降 ,以全脐血冻存组为甚 ;CD34+ CD38- 比例冻存后增高。结论 :先分离后冻存法可行 ,且具有减小冻存体积 ,对造血祖细胞损伤较小的特点 ;早期造血祖细胞可能更能耐受冻存处理     

造血干细胞采集、分离与冻存的研究

目的 :研究外周血造血干细胞的采集、分离、冻存及干细胞活性的检测。方法 :用封闭式动脉采血法采集 10例脐血 ,经Ficoll溶液分离获得干细胞 ,分成 3组 ,分别用 10 %二甲亚矾 (DMSO)、自配的 5 % DMSO+6 %羟乙基淀粉 (HES) +4 %人体白蛋白及 CP- 13种不同的冷冻保存液冻存于 196℃的液氮和 80℃的低温冰箱中 ,对冷冻后的样本进行单个核细胞 (MNC)计数。锥虫蓝拒染试验及流式细胞仪 CD+ 34 细胞计数。结果 :采集的血量平均数为 (72 .2± 17.3) ml,3种不同冷冻保存液对造血干细胞的保存效果在 1、3、6个月差异无显著性 (P>0 .0 5 )。随着冷冻时间的延长 ,特别是 6个月后 ,流式细胞仪对 CD+ 34 细胞检测的相对数逐渐增高。在 6个月内 ,80℃低温冰箱中的冻存与 196℃液氮内的冻存相比 ,对造血干细胞的影响差异无显著性 (P>0 .0 5 )。结论 :自配的冷冻保存液效果良好 ,短期造血干细胞的冻存可以在 80℃低温冰箱内进行 ,冷冻保存造血干细胞 1、3、6个月对细胞的活性影响不大。     

冻存对血管内皮干细胞增殖、分化能力的影响

目的 探讨冻存对人脐血来源血管内皮干细胞（EPCs）增殖、分化能力的影响。 方法 采用密度梯度离心法结合MACS分选法提取人脐血中CD133＋细胞，进行流式细胞仪检测纯度；将EPCs冻存3, 6, 12, 18个月后进行常规培养、诱导分化，利用细胞免疫组化进行鉴定，并比较不同冻存时间的EPCs的增殖能力。 结果 经流式细胞仪检测CD133＋细胞平均占单核细胞的（1.13±0.10）％，磁珠分选所得CD133＋细胞平均纯度为(91.45±1.04)％；CD133＋细胞贴壁生长，可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落，经免疫组化检测大部分表达CD34和Ⅷ因子；冻存3, 6, 12, 18个月后，EPCs的增殖、分化能力有所下降。结论 长时间的冻存可减弱EPCs的增殖、分化能力。     

脐血造血干细胞冻存和纯化的研究

为观察脐血造血干细胞—80℃保存以及脐血CD34~ 细胞的纯化效果,采用-80℃深低温冰箱冻存脐血干细胞,结果表明保存1个月脐血单个核细胞(MNC)数量、锥虫蓝拒染率、粒一单祖细胞集落(CFU—GM)数回收率分别为85.17％±5.38％、91.67％±3.22％、60.50％±4.42％。保存1、3、6个月动态观察3项指标除锥虫蓝拒染率1个月与6个月外均无显著性差异{均P>0.05)。用Isolex50免疫磁珠分离系统,可从脐血中获得高纯度CD34~ 细胞。上述研究为脐血造血干细胞移植的临床应用提供了实验依据。     

原代人视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏培养

目的 :观察对原代人视网膜色素上皮 (retinalpig mentepithelium ,RPE )细胞进行冻存和复苏培养的效果 .方法 :将 6只尸供眼 ,常规酶消化法分离、纯化的人原代RPE细胞 ,分为两组 ,实验组为即刻进行常规梯度降温液氮冷冻保存 ,1wk后行常规复苏培养 ;对照组为细胞直接进行后续实验 .台盼蓝拒染观察细胞存活率及生长状态 ;计算细胞贴壁率 ;初步计算克隆形成率 .结果 :RPE细胞存活率分别为试验组 (90± 7) % ,对照组 (87± 1 5 ) % ,两组相比无显著性差异(P >0 .0 5 ) ;两组接种细胞贴壁率从 2 4h开始分别为 (5 .0±3.1 ) %～ (6 1 .0± 7.3) %和 (1 5 .0± 6 .3) %～ (6 0 .0± 3.3) % ;培养 4 8h之前 ,两组之间存在统计学差异 (P <0 .0 5 ) ,4 8h之后组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 5 ,7和 1 0d初步克隆形成率两组分别为 (1± 0 ) % ,(1± 1 ) % ,(3± 1 ) %和 (1±0 ) % ,(3± 1 ) % ,(2± 1 ) % ,组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ,n=3) .冻存后复苏培养的RPE细胞生长状态良好 ,增生活跃 ,与对照组类似 .结论 :对原代人RPE细胞进行冻存 ,复苏培养的RPE细胞活性、存活能力、单细胞分裂增生能力不受影响 .     

脐血浆造血活性的研究

目的　研究脐血浆刺激造血细胞体外生长的作用及脐血浆造血因子的水平。方法　以ELISA法检测 33例脐血浆GM -CSF ,IL - 3和IL - 6水平 ,RIA法检测EPO水平 ,液体培养和甲基纤维素半固体培养方法检测脐血浆对外周造血干细胞 (PBSC)造血刺激活性 ,并分析二者的相关性。结果　①脐血浆造血因子中位数和全距水平分别为 :GM-CSF为 0ng/L和 0～44ng/L ,IL - 3为 3ng/L和 0～ 35ng/L,IL - 6为 3ng/L和 0～ 2 1ng/L ,EPO为 1 6U/L和 5～ 72U/L ;②脐血浆刺激下PBSC半固体培养造血祖细胞集落数为 (1 3± 1 1 ) / 1× 1 0 5细胞 ,胎牛血清刺激下的集落数为 0 ,二者差异有显著性 (P <0 .0 1 )。脐血浆或胎牛血清刺激下PBSC液体培养有核细胞数分别为 (1 .0 8± 0 .2 0 )× 1 0 6 /ml与 (0 .72±0 .0 5)×1 0 6 /ml,二者差异有显著性 (P <0 .0 5) ;③脐血浆刺激下PBSC体外培养集落数和有核细胞数均与脐血浆IL -3水平成正相关 ,相关系数分别为 0 .660和 0 .397,与IL - 6和EPO则不相关。结论　脐血浆含有多种造血因子 ,在体外具有刺激造血细胞生长的作用。脐血浆刺激造血活性与其所含有的造血因子有关 ,造血活性的高低与IL - 3浓度成正相关。IL - 6和EPO所起的作用则相对较小。     

深低温冻存对SLE患者外周血CD34+ 阳性细胞活性的影响

目的探讨深低温冻存对系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血CD34^＋细胞活性的影响。方法ClinMACS磁性分选系统分选CD34^＋细胞。采用5％二甲基亚砜,6％羟乙基淀粉和4％人血白蛋白作冷冻保护剂,-80℃直接冻存。观察不同时相复温后的细胞台盼兰拒染率、CFU—GM计数以及移植后造血恢复时间。结果SLE患者与正常人脐血CD34^＋细胞冻存后1～90d,细胞活性无明显差异。SLE患者与非自身免疫性疾病患者同样方法冻存造血干细胞,移植后造血恢复特征相似。结论-80℃深低温保存对SLE患者造血干细胞活性无影响。     

-80℃条件下不同细胞浓度外周血干细胞冻存效果的实验观察

目的　观察不同细胞浓度外周血干细胞在 - 80℃条件下的冻存效果。方法　采用一种简便的 - 80℃干细胞冻存方法 ,其干细胞保护剂终浓度为 5 %二甲基亚砜 (DMSO) ,3%羟乙基淀粉 (HES)和 4 %人血白蛋白 (HSA) ,不经程序降温 ,直接 -80℃冰箱冻存外周血干细胞 ,并在不同时相点 (冻存后 1、3、6、9、1 2个月 )对推荐细胞浓度组 (1 .3～ 3.9)× 1 0 7/ml、调整细胞浓度组 (8.0～ 2 9.9)× 1 0 7/ml和高细胞浓度组 (30 .1～ 70 .1 )× 1 0 7/ml的外周血干细胞的细胞活性进行检测 ,观察台盼蓝拒染率和MNC、CFU GM、CD34+ 细胞的回收率。结果　 3组干细胞活性在 1 2个月内无明显下降 ;干细胞冻存后 9个月期间 ,3组冻存细胞的台盼蓝拒染率 ,MNC回收率、CFU GM回收率、CD34+ 细胞回收率都在 80 %以上。冻存 1 2个月中 ,3组在冻存后同一时间相互比较无统计学差异 (P >0 .0 5 ) ,说明该 - 80℃干细胞冻存方法适用于不同浓度的细胞液 ,短期内具有良好的冻存效果。结论　5 %DMSO、3%HES和 4 %HAS作为干细胞冷冻保护剂直接 - 80℃冰箱冻存外周血干细胞的方法能有效地保护不同浓度细胞液的外周血干细胞活性 ,适当地提高细胞保存时的浓度 ,减少回输量 ,可避免因干细胞冻存而引起的副作用     

脐带血造血干细胞的采集、浓缩与低温冷冻保存

目的 :探讨脐带血造血干细胞库建立中的脐带血采集、分离、低温冻存的方法。方法 :自 1997年 7月至2 0 0 0年 7月已冻存经过HLA配型的脐带血 (cordblood ,CB) 3 74 4份。CB采自经检查符合要求的足月顺产或剖宫产新生儿 ,经 (citratephosphateadeninedextnse ,CPD A)抗凝 ,用密闭式血袋采集法采集。采集后置于室温保存 ,18h内处理。用羟乙基淀粉 (hydroxythylstarch ,HES)沉降后一次分离方法去除绝大多数红细胞及大部分血浆。采用以二甲亚砜 (dimethylsulfoxide ,DMSO)为主的冷冻保剂 ,冷冻保存CB。DMSO的终质量分数为 10 %。经序控降温后 ,置于 - 196℃液氮中保存。结果 :分析了 3 74 4份冻存CB ,平均采集量为 (93± 2 2 )ml(45～ 198ml)。浓缩后平均体积为 (3 8± 8)ml(3 0～ 60ml) ;浓缩前后有核细胞数 .浓缩前平均有核细胞数为 11.2× 10 8± 5 .3× 10 8(4.5× 10 8～ 4 5 .1× 10 8) ;采用HES沉降一次离心浓缩去除红细胞后的平均有核细胞数为 9.7× 10 8± 4 .6× 10 8(3 .1× 10 8～ 3 0 .5× 10 8) ;平均有核细胞回收率为 79%。质控检测 4 0份标本细胞活率为 88.2 % ,CFU GM回收率和CD3 4 +细胞计数分别为 97.6%和 86.4 %。结论 :本研究采用的CB采集、冻存及造血干细胞和病原生物检测的方法是安     

F68及其联合DMSO对脐血造血细胞的低温保护作用

目的研究普鲁兰尼克(F68)及其联合DMSO在-80℃条件下对脐血造血干细胞的低温保护作用,为临床应用提供依据.方法脐血造血细胞冻存30、60、90 d后复苏,应用台盼蓝拒染率、集落形成试验、3H-TdR掺入率等,测定经F68保护体系冻存的脐血活力,并与目前通用的冷冻保护剂二甲亚砜及CP-1进行了对比研究.结果在-80℃条件下,F68对脐血造血细胞具有明显的冷冻保护作用,并与DMSO具有协同保护效果,联合F68及DMSO的保护体系可使MNC、CFU-GM的平均回收率及台盼蓝拒染率在第90天时分别达到(83.4±6.3)%,(68.8±7.9)%, (92.5±5.1)%,优于目前通用的细胞冻害保护液CP-1及DMSO.90 d的冻存期内,脐血细胞活力无明显下降.结论 F68及其与DMSO组成的冻存方案对脐血造血干细胞具有良好的冻存保护效果.     

存放时间对脐血T细胞亚群测定的影响

脐血已成为造血干细胞移植的重要来源之一 ,脐血与骨髓及外周血一样 ,含有一定量成熟的Ｔ细胞[1] ,脐血移植也可能发生不同程度的移植物抗宿主病(ＧＶＨＤ)。作者在进行免疫毒素去除脐血Ｔ细胞效率及对造血祖细胞的影响[1] 研究过程中发现室温下标本保存时间可能对Ｔ表 1　标本放置时间对脐血Ｔ细胞亚群的影响 ( ｘ±ｓ) %方法 ＣＤ+ 5细胞ＣＤ+ 8细胞0～ 2ｈ～ 12ｈ >12ｈ 0～ 2ｈ～ 12ｈ >12ｈＦＡＣＳ镜检法38.1± 2 .6 (3)42 .3± 7.5(3)　 2 6 .2± 8.9(6 )　 31.2± 6 .8(6 )　 2 1.3± 7.1 (7)　 2 3.4± 5.4 (6 )17.7± 4.0 (3)17±…     

-80℃简易冻存外周造血干细胞临床应用观察

目的:探索一种简便易行、安全有效、成本低的干细胞的冻存方法。方法:6份外周造血干细胞以1640培养液和二甲基亚砜、10%白蛋白作保护剂在-80℃条件下直接冻存,检测冻存前后外周血干细胞的活性、单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数及回收率。结果:冻存前后外周血干细胞活性、MNC和CD34+细胞的数量及回收率满足移植要求,输注后造血均重建。结论:1640培养液和二甲基亚砜、10%白蛋白作保护剂在-80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法。     

新改良外周血造血干细胞冷冻技术的临床应用观察

目的为临床自体造血干细胞移植提供一种简单易行、安全有效、成本低廉的干细胞冻存方法。方法 10份外周造血干细胞以二甲基亚砜、自体血浆作保护剂在-80℃条件下直接冻存,冻存前后检测外周血干细胞的活性、单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数及回收率。结果冻存前后外周血干细胞活性单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数及回收率满足移植要求,输注后造血均重建。结论二甲基亚砜、自体血浆作保护剂在-80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周造血干细胞冻存方法。     

深低温冻存对正常人和白血病患者天然杀伤细胞杀伤活性的影响

应用深低温生物技术对正常人(N=4)和白血病患者(N=9)天然杀伤(NK)细胞冻存后,采用~(125)I 释放法,研究 NK 细胞对杀伤肿瘤细胞活性的影响。结果表明使用防冻剂二甲亚砜(DMSO),液氮(-196℃)储存,能保存 NK 细胞活性(冻前:正常人54.7±8.0%,白血病8.4±5.2%,冻后:正常人55.2±7.3%,白血病8.6±4.6%。P 值均分别>0.5。     

-80℃冻存外周血造血干细胞的应用研究

目的:探求一种操作简便实用、造血干细胞回收率和存活率高、成本低的外周血造血干细胞的冻存方法。方法:CP-1和5%白蛋白作保护剂在?80℃条件下直接冻存,并检测冻存前后外周血干细胞的活性,单个核细胞(MNC)和CFU-GM、CD34 细胞的回收率。结果:冻存前后外周血干细胞活性,单个核细胞(MNC)和CFU-GM、CD34 细胞的回收率无明显差异(P>0.05),输注后造血均重建。结论:CP-1和5%白蛋白作保护剂在?80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法,具有广泛的临床推广价值。     

脐血库造血干/祖细胞的分离、保存和集落培养

目的探讨脐血库脐血分离、保存方法及造血干祖细胞的体外培养条件。方法采用建立在密度梯度离心基础上的HES分离法对脐血进行有核细胞分离、冻存及粒巨系造血祖细胞集落（CFU—GM）培养。结果离心管收集分离和四联袋采集分离的方法均可获得较高的单个核细胞量。但四联袋采集分离在回收率和浓缩程度上更为优越，且粒巨系造血祖细胞（CFU—GM）含量丰富。10％DMSO冻存液保存复苏后仍可获得较高活率和CFU—GM。结论我们建立的HES分离结合密度梯度离心分离脐血造血干祖细胞以及脐血长期冻存的方法为广泛、大规模地建立脐血库提供了基础。