补肾中药HU-ECS对培养成骨细胞增殖、分化及矿化功能的影响

目的：为了解补肾中药HU-ECS对体外培养成骨细胞的作用。方法：应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法及茜素红染色方法观察HU-ECS对体外培养民骨细胞的增殖、ALP表达及矿化结节形成的影响。结果：HU-ECS具有刺激骨细胞增殖作用（10^-6g/ml组,P＜0.01-0.001）,提高ALP活性及矿化结节形成的数量。结论：HU-ECS具有刺激体外培养成骨细胞增殖及分化成熟的功能。     

过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂罗格列酮对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响

目的 观察过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ2的激动剂罗格列酮对大鼠成骨细胞增殖和分化能力的影响。方法 取新生SD大鼠颅骨进行原代培养,经碱性磷酸酶ALP染色和矿化结节检测鉴定为成骨细胞。实验分为6组:取第3代细胞接种至96孔板,根据加入罗格列酮的浓度的不同分为A、B、C、D、E、F组(浓度分别为0、1、2、5、10、20 μmol/L),A组为对照组,B～F组为实验组。每组5个复孔,经罗格列酮作用24h后,应用噻唑蓝(MTT)比色法和PNPP法检测大鼠成骨细胞增殖和ALP活性的变化。结果 作用24h后,6种浓度罗格列酮对大鼠成骨细胞增殖作用均无影响,且组间差异无统计学意义(F=1.335,P＞0.05);但各实验组大鼠成骨细胞ALP活性均较对照组降低,并具浓度依赖性,组间差异有统计学意义(F=82.304,P＜0.01)。结论 一定剂量的罗格列酮对大鼠成骨细胞无明显促增殖作用,但却明显抑制了大鼠成骨细胞的分化,表明罗格列酮可影响成骨活性,提示PPARγ2参与了机体的成骨过程,在骨质疏松的发病中发挥一定了的作用。     

异黄酮类药Genistein对原代培养大鼠成骨细胞增殖、分化、钙含量及矿化功能的影响

目的：了解异黄酮类药Genistein对体外培养成骨细胞的作用。方法：应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法，原子吸收分光光度法及茜素红染色方法观察Genistein对体外培养成骨细胞的增殖、ALP表达，基质钙含量及矿化结节形成的影响。结果：Genistein具有刺激成骨细胞增殖，提高ALP活性，细胞基质钙含量及矿化结节形成的数量的作用。结论：Genistein具有刺激体外培养成骨细胞增殖，分化成熟及促进矿化的作用。     

去卵巢对大鼠颌骨成骨细胞增殖与成骨分化能力的影响

目的探讨去卵巢对大鼠颌骨成骨细胞增殖与成骨分化能力的影响。方法建立去卵巢大鼠骨质疏松模型,分离培养假手术组和去卵巢组颌骨成骨细胞并进行形态学观察。采用CCK-8法检测假手术组和去卵巢组大鼠颌骨成骨细胞的增殖能力差异。通过碱性磷酸酶染色与活性测定、矿化结节茜素红染色与定量、成骨相关基因及蛋白表达检测,探讨去卵巢对大鼠颌骨成骨细胞增殖及成骨分化能力的影响。结果假手术组和去卵巢组大鼠均可成功分离培养颌骨成骨细胞,两组细胞均可贴壁生长,细胞形态未见显著差异。与假手术组相比,去卵巢大鼠颌骨成骨细胞的增殖能力,碱性磷酸酶染色与活性均显著增高;但去卵巢大鼠颌骨成骨细胞的Runx2和OC在mRNA与蛋白水平的表达上及体外矿化结节形成能力方面皆显著低于假手术组。结论去卵巢可影响大鼠颌骨成骨细胞的增殖与成骨分化能力,研究结果将为探讨颌面部骨组织骨质疏松的发病机制与防治提供实验依据。     

C反应蛋白激活原纤毛抑制颅骨成骨细胞的增殖和分化

目的研究C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)对原代培养SD大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖及成骨分化的影响。方法取SD乳鼠颅骨组织用胰蛋白酶和胶原蛋白酶Ⅰ消化得到原代ROB,随后将ROB用α-MEM培养基培养,传代3次后用于后续实验。在对照组和5 mg/mL CRP的处理组中,成骨分化培养基诱导3 d进行免疫荧光检测两组Ki-67和acetylated-α-tubulin和γ-tubulin表达情况;同时,蛋白质印迹分析osteopontin(OPN)、alkaline phosphatase(ALP)、acetylated-α-tubulin和γ-tubulin的表达;成骨分化培养基诱导21 d茜素红染色检测成骨基质矿化结节量。结果免疫荧光显示,5 mg/mL CRP抑制成骨细胞增殖,与对照组差异有统计学意义(P0.001);蛋白质免疫印迹和茜素红染色显示,处理组OPN和ALP表达降低(P0.01),矿化结节生成数量减少(P0.001),与对照组比较差异均有统计学意义;免疫荧光结果显示,细胞原纤毛长度增加(P0.001),免疫印迹结果显示acetylated-α-tubulin和γ-tubulin蛋白的表达均升高(P0.001)。结论5 mg/mL CRP显著抑制ROB增殖与成骨分化矿化并且显著激活细胞原纤毛。CRP为炎症因子典型代表,这些数据表明炎症因子激活细胞原纤毛发挥其抑制成骨细胞的增殖与分化作用,提示抑制原纤毛或阻断炎症因子的释放可以治疗炎症引起的骨丢失疾病。     

补肾健骨方含药血清对ROBs和rBMSCs增殖、分化和矿化的影响

目的观察补肾健骨方含药血清对大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROBs)和大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,r BMSCs)细胞活性及分化、矿化的影响。方法制备补肾健骨方含药血清,将ROBs和r BMSCs分为5%、10%、15%、20%、25%浓度含药血清组、无药血清组及传统诱导组,分别对各组ROBs和r BMSCs进行成骨诱导。MTT法检测ROBs和r BMSCs细胞的增殖情况;用试剂盒检测ROBs和r BMSCs的碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法检测矿化结节形成。结果不同浓度含药血清组与空白无药血清组、传统诱导组相比,均不同程度地促进ROBs和r BMSCs的增殖,使ALP活性提高,增加钙化结节数量和面积。其中含药血清浓度为20%时促进ROBs增殖分化作用最佳,浓度为10%时促进r BMSCs增殖分化效果最为显著。结论不同浓度补肾健骨方含药血清均能够促进ROBs和r BMSCs的成骨增殖、分化和矿化,分别在浓度为20%和10%时最佳。     

蛇床子素骨靶向药物对体外培养大鼠成骨 细胞增殖功能的影响

目的观察以壳聚糖衍生物（NSC)为载体,与蛇床子素（OST)共价结合后形成的具有亲骨性 和亲水性的新型化合物一蛇床子素骨靶向药物（NSC-OST)对体外培养大鼠成骨细胞（Osteoblast ,OB) 增殖功能的影响,探讨其防治骨质疏松的作用机制。方法取新生大鼠颅盖骨进行OB分离、培养, 采用碱性磷酸酶（ALP)染色及茜素红染色法鉴定OB;随机将OB分为5组,即空白对照组及终浓度 为 10—7mmol/L、10 ―6 mmol/L、10-5 mmol/L、10 ―4 mmol/L NSC-OST 实验组,分别加人不同浓度的 NSC-OST作用不同时间,用MTT法检测成骨细胞增殖情况。结果体外分离培养的细胞具有典型成 骨细胞形态学及生物学活性,碱性磷酸酶、茜素红染色均呈阳性结果;作用M h、48 h时,终浓度为 10—5 mmolL NSC-OST 可显著促进 OB 增殖（P <0. 05 ),作用 72 h,终浓度为 10-6mmol/L 和 10-5 mmolLNSC-OST可显著促进OB增殖（尸<0. 05 );终浓度为10—4mmol/L NSC-OST具有明显抑制OB 增殖的作用（P<0.01 )。结论 NSC-OST的水溶性良好,理化性质稳定,适当浓度的NSC-OST可促进 成骨细胞增殖,有望成为有效抗骨质疏松作用的新型药物。     

尼莫地平对体外培养成骨细胞的影响

目的 观察尼莫地平对体外培养成骨细胞的作用.方法 在新生SD大鼠头颅骨第2继代成骨细胞(OB2)培养液中分别加入不同浓度(10-1～10 9g/L)尼莫地平,分别观察OB2的增殖功能(用波长570nm处OD值表示),分化功能(用碱性磷酸酶ALP活性表示)和矿化功能(用矿化结节数量/视野表示).结果 增殖功能OD值为0.12±0.01～0.41±0.04;ALP活性为0.09±0.01U/mg蛋白质;矿化结节数量/视野为1.3±0.9个.结论 与对照组比较,尼莫地平各浓度对OB2的增殖、分化和矿化功能作用各异.当尼莫地平浓度为10 6g/L时,对OB2的增殖和分化功能具有刺激作用,对OB2的矿化功能具有显著的抑制作用;当浓度升高(10-2g/L)时,对OB2的增殖功能具有明显的抑制作用;当浓度降低(10 8g/L)时,对OB2的增殖功能失去作用.     

小剂量阿司匹林对去势大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]检测不同浓度低剂量阿司匹林对去势后(OVX)大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响.[方法]建立SD大鼠去势模型,全骨髓贴壁法培养骨髓基质干细胞(BMSCs),传代4次后进行成骨诱导,建立对照组和不同浓度阿司匹林组(0.25、0.5、1、2及5mmol/L).于不同的培养时间点,倒置显微镜观察并进行MTT检测细胞增殖生长情况;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测培养细胞上清ALP活性;于诱导7d和21d时分别行细胞碱性磷酸酶染色和茜素红钙化结节染色.[结果]阿司匹林无明显促进BMSCs增殖作用,而大剂量阿司匹林(5 mmol/L)具有抑制BMSCs增殖作用.实验组(0.25、0.5、1、2 mmol/L阿司匹林组)细胞培养上清中ALP浓度较对照组显著增强(P＜0.05);碱性磷酸酶染色(1、2 mmol/L组)阳性表达增强;茜素红染色显示,实验组(0.5、1、2mmol/L组)钙结节数量、钙化面积均高于对照组(P＜0.05).[结论]阿司匹林不能直接促进去势大鼠BMSC增殖活性,但小剂量阿司匹林可显著提高体外培养BMSC成骨活性,增强钙盐沉积,促进钙结节形成.     

铁饱和乳铁蛋白对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的 探讨铁饱和乳铁蛋白对体外培养的大鼠成骨细胞增殖和分化的影响.方法 用酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞进行原代培养;乳铁蛋白螯合Fe~(2+)获得铁饱和乳铁蛋白;将其稀释到不同浓度作用于成骨细胞,四唑盐比色法(MTT)测定细胞增殖;碱性磷酸酶法(ALP)测定细胞碱性磷酸酶活性.结果 随着时间的增加,各浓度组均可促进成骨细胞增殖及增强碱性磷酸酶活性.其中100 μg/mL浓度组在72 h时细胞增殖数目最大、碱性磷酸酶活性最高,较对照组有统计学意义(P＜0.01).结论 铁饱和乳铁蛋白能促进大鼠成骨细胞的增殖和分化.     

静磁场不同处理时间对体外培养成骨细胞增殖与分化的影响

目的:研究静磁场不同处理时间对体外培养成骨细胞增殖与分化成熟的影响。方法:原代培养大鼠颅骨成骨细胞,传代后随机分为9组,用磁场强度为3.9mT的静磁场,分别处理0(对照组)、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h。倒置相差显微镜下观察细胞形态;48h后检测细胞增殖情况;第3、6、9、12天测定碱性磷酸酶活性和钙盐沉积量;第8天进行碱性磷酸酶染色;第10天进行茜素红钙化结节染色;在SMFs(static magnetic fields)处理0、24、48、72h后,Real-time PCR检测骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2),Runx-2,骨保护素(osteoprotegerin,Opg)的mRNA表达水平变化。结果:与对照组相比,磁场组均促进细胞增殖(P<0.01或P<0.05),也能明显促进其分化成熟,表现为提高细胞的ALP活性,促进钙盐沉积量,提高BMP-2、Runx-2和Opg的mRNA表达。结论:磁感应强度为3.9mT的静磁场处理体外培养成骨细胞2.5h时,其对成骨细胞的增值与分化效果最为明显。     

左归丸含药血清调节Runx2激活ALP、OPN蛋白促进BMSCs增殖和分化的研究

目的 探讨左归丸(Zuoguiwan, ZGW)的补肾填精、益髓壮骨的作用,促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的增殖和向成骨细胞方向分化。方法 制备ZGW含药血清,设置10%FBS DMEM组、成骨诱导液组、2.5%空白大鼠血清-成骨诱导液组、2.5%ZGW含药血清-成骨诱导液组。采用MTT法观察各组对BMSCs的增殖,使用碱性磷酸酶钙钴染色法检测BMSCs向成骨细胞方向的分化能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)法检测细胞培养液中AKP的含量,Western blot检测BMSCs中Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙蛋白(osteocalcin, OPN)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)蛋白的表达。结果 2.5%ZGW含药血清-成骨诱导液组能够促进BMSCs的快速增殖,较早地进入平台期,促进BMSCs中AKP的分泌,提高ALP含量,上调BMSCs细胞中Runx2、ALP和OPN的蛋白表达水平。结论 ZGW抗骨质疏松的分子机制,可能与调节Ru...     

流体切应力下SIVA-1凋亡诱导因子促成骨细胞增殖分化的双向调节作用

目的探讨流体切应力（fluid shear stress,FSS）对KM小鼠成骨细胞增殖分化及相关细胞凋亡诱导因子（SIVA-1）的调节作用。方法将传至3代成骨细胞分为应力刺激组（试验组）和非应力刺激组（对照组）。5个试验组分别给予1.2PaFSS作用0.25,0.5,1,2,4h;对照组为0h。MTT法测定细胞增殖,检测碱性磷酸酶（ALP）活性,半定量RT-PCR测定凋亡诱导因子SIVA-1的表达水平。结果FSS促增殖作用在短期（0.25,0.5h）明显,且细胞生长曲线前移;但在1,2,4h却有明显抑制增殖作用。FSS同样增加了ALP活性,尤其在应力作用0.5h时显著（ALP含量为2.4320±0.205金氏单位/100ml,相对对照达158%）（P〈0.05）;而应力作用1,2,4h后减低了ALP的表达。应力初期SIVA-1mRNA表达量明显下降,尤其在FSS作用0.5h后SIVA-1/GAPDH相对表达量为0.099±0.002,相对对照明显下调了71.3%（P〈0.01）,此效应在作用1h后减退,SIVA-1mRNA表达开始升高,4h后升高明显。结论1.2PaFSS在短时间刺激下可刺激成骨细胞增殖分化,尤其在0.5h后效应明显。早期促细胞增殖和ALP水平升高主要与SIVA-1mRNA表达下调有关,而后期抑制作用可能与SIVA-1mRNA表达升高有关。     

低频振动对人成骨细胞生物学特性影响的研究

目的:研究低频振动对人成骨细胞增殖分化及基质分泌的影响。方法:取成人的髂骨松质骨,获得人成骨细胞。并在培养48h后,施加0.1、0.2、0.5、2和5Hz的低频微振动,通过流式细胞仪检测成骨细胞增殖状况:化学比色法和放射免疫法检测碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素含量。结果:加载0.2和0.5Hz可使成骨细胞的ALP活性明显增高(P<0.01);0.1和2Hz振动后其ALP活性与对照组无明显差异;5Hz振动则明显降低ALP活性(P<0.01)。加载0.2和0.5Hz振动的成骨细胞,S期细胞从10.4％增加至12.45％和16.12％,增殖指数从20.14％增加到26.21％和28.75％。0.1和2Hz低频振动则显示出对细胞增殖指数无明显影响(P>0.05)。而5Hz使细胞增殖指数明显降低至13.22％(P<0.05)。同时,加载0.2和0.5Hz振动可明显增加成骨细胞骨钙素分泌量至1.87和2.47ng/ml(P<0.05),而加载0.1Hz对骨钙素分泌量无明显影响(P>0.05),加载2和5Hz相应降低了骨钙素分泌量(P<0.05)。结论:0.2～0.5Hz的低频振动能促进成骨细胞增殖分化和成骨活性物质分泌,对低频振动应用于骨折治疗有指导作用。     

成人骨髓间充质干细胞体外低氧培养及生物学特征

目的建立人骨髓间充质干细胞（human marrow mesenchymal stem cells,hMSCs）体外低氧培养及向成骨细胞分化的生物模型,研究其生物学特征,为骨组织工程提供实验依据。方法采用人淋巴细胞分离液分离健康成人hMSCs,DMEM-LG（含20%胎牛血清）中培养,10～14d后传代培养。取第2代细胞,根据培养氧浓度及培养基类型分为4组：正常氧组（20%O2加DMEM-LG,A组）、低氧组（1%O2加DMEM-LG,B组）、正常氧成骨诱导组（20%O2加条件培养基,C组）及低氧成骨诱导组（1%O2加条件培养基,D组）,通过细胞计数、细胞增殖测定（MTT法）、集落形成检测、RT-PCR检测、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测及茜素红染色,研究低氧环境对hMSCs生物学行为的影响。结果与A组相比,B组及D组中的hMSCs有较高的增殖速度,并且不受条件培养基的影响,比较差异有统计学意义（P〈0.01）。B组中的hMSCs生成的集落逐渐增多,A组9d后生成的集落数基本不发生变化。D组培养的hMSCs的ALP活性逐渐增高,但明显低于C组,两者差异有统计学意义（P〈0.01）。定量RT-PCR检测,C组ALP、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白及骨粘连蛋白mRNA表达量明显增加（P〈0.01）。培养4周后,与其他3组相比,C组可见到明显的钙盐沉积和染成红色的钙结节。结论低氧使hMSCs增殖率增加,集落形成能力增强,抑制向成骨细胞分化。     

阿司匹林联合辛伐他汀对成骨细胞增殖及分化的影响

目的探索阿司匹林(aspirin,ASP)联合辛伐他汀(simvastatin,SIM)对成骨细胞增殖和分化的影响,为临床上两者联合使用的可行性提供细胞学基础。方法获取SD大鼠成骨细胞,随机分为对照组(CON)、ASP组、SIM组和ASP-SIM组等4组,培养基中分别添加安慰剂、ASP、SIM和ASP联合SIM干预,培养7 d后,通过MTT法检测细胞的增殖情况,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及茜素红染色观察细胞的功能状态,蛋白电泳观察骨钙素(osteocalcin,OCN)及Runx2蛋白的表达情况。结果 ASP及SIM单独作用于成骨细胞时,都可以明显促进成骨细胞的增殖,增加ALP活性及矿化能力,同时明显促进OCN及Runx2蛋白的表达;联合使用效果明显优于单独使用,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 ASP及SIM都可以明显促进成骨细胞增殖和分化,且联合使用效果更佳。     

骨形成蛋白联合雷奈酸锶对成骨细胞增殖和分化的影响

目的探索骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)联合雷奈酸锶(strontium ranelate,SR)对成骨细胞增殖和分化的影响,为临床上两者联合使用可行性提供细胞学基础。方法获取SD大鼠成骨细胞,随机分为对照组、SR组、BMP组和BMP-SR组等4组,培养基中分别添加安慰剂、SR、BMP-2和SR联合BMP-2干预,培养12 d后,通过MTT法检测细胞的增殖情况,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及茜素红染色观察细胞的功能状态,蛋白电泳观察骨钙素(osteocalcin,OCN)及Runx2蛋白的表达情况。结果 SR及BMP-2单独作用于成骨细胞时,都可以明显促进成骨细胞的增殖,增加ALP活性及矿化能力,同时明显促进OCN及Runx2蛋白的表达;联合使用效果明显优于单独使用,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 BMP-2及SR都可以明显促进成骨细胞增殖和分化,且联合使用效果更佳。     

镁锌合金在体外对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响

目的 观察镁锌合金(Mg-zn)在体外的降解及对小鼠前成骨细胞(MC313-E1)增殖、分化和矿化的影响,探讨Mg-Zn成为新型骨科内植物材料的可行性.方法 Mg-Zn和纯镁(Mg)试样置入模拟体液(SBF)中,3 d后通过电化学方法和静态浸泡失重的方法来测定其腐蚀电位及腐蚀速率;在Mg-Zn上接种MC3T3-E1细胞,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测1、3、5、7、9 d时细胞增殖活性,采用碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测14、28 d时细胞ALP活性,并用四环素荧光染色检测14d时矿化结节.与左旋聚乳酸(PLLA)作对照研究.结果 Mg-Zn的腐蚀电位增高,腐蚀速率降低;培养第5、7、9天后,Mg-Zn成骨细胞增殖活性明显高于PLLA(P<0.01);14、28 d时,Mg-Zn ALP活性明显高于PuA(P<0.01);Mg-Zn矿化结节面积明显大于PLLA(P<0.01).结论 Mg-Zn明显改善了Mg的耐腐蚀性能,同时能促进MC333-E1细胞的增殖、分化和矿化功能,具有良好的生物相容性.