镉对人肝癌细胞增殖及凋亡影响

目的 研究镉对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及凋亡的影响及其作用机制.方法 体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721分别以0、40、80、160 μmol/L的CdCl2处理0～48 h,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞相对存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,分光光度法检测半胱天冬酶Caspase-3酶活性的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(western blot)法测Caspase-3 mRNA和蛋白表达的变化.结果 随着镉处理浓度的增加,氯化镉对细胞活力的抑制作用明显增强,40、80、160 μmol/L氯化镉处理SMMC-7721细胞,其抑制率分别为33.94％、48.04％和68.54％,均明显高于0 μmol/L氯化镉处理组,差异均有统计学意义(P＜0.01);40、80、160 μmol/L镉处理组细胞的凋亡百分率分别为(25.77±4.66)％、(34.97±9.25)％和(55.14±5.67)％,与0 μmol/L镉处理组比较明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.01);镉处理SMMC-7721细胞24和48 h,Caspase-3相对酶活性均随着镉浓度的增加而明显增强;40 μmol/L镉处理SMMC-7721细胞,12、24和48 h可明显上调细胞中Caspase-3基因及蛋白的表达,Caspase-3基因mRNA表达水平分别为对照组的4.1、3.7和3.9倍,Caspase-3蛋白表达分别为对照组的5.8、6.0和7.2倍.结论 镉能明显抑制人肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,Caspase-3基因在镉诱导SMMC-7721细胞凋亡过程中起着重要的作用.     

双(对氯苯基)二氯乙烯与β-六氯化苯对大鼠睾丸支持细胞凋亡的影响

目的 探讨双(对氯苯基)二氯乙烯[1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene,p,p'-DDE]、β-六氯化苯(β-benzenehexachloride,β-BHC)及其联合作用对大鼠睾丸支持细胞凋亡半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)途径的影响及其作用机制.方法 以不同浓度的p,p'-DDE、β-BHC(分别为10、30、50 μmol/L)及其联合(10 μmol/L p,p'-DDE+10 μmol/L β-BHC,30 μmol/L p,p'-DDE+30 μmol/L β-BHC,50 μmoL/L p,p'-DDE+50 μmol/L β-BHC)处理大鼠睾丸支持细胞24 h,设Caspase-3抑制剂组(先用100 μmol/L Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO处理支持细胞2 h,再用50 μmol/L p,p'-DDE+50 μmol/L β-BHC联合处理),采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定支持细胞的活性,吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双重荧光染色测定支持细胞的凋亡率,RT-PCR法检测Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9 mRNA表达量的变化.结果 10、30、50、70 μmol/L p,p'-DDE组吸光度(A值)分别为0.498±0.039、0.481±0.065、0.397±0.032和0.286±0.049,相同浓度β-BHC组A值分别为0.518±0.103、0.490±0.060、0.454±0.054和0.302±0.030,10、30、50 μmol/L p,p'-DDE与β-BHC联合组A值分别为0.483±0.048、0.473±0.058和0.337±0.052,50 μmol/L浓度组与对照组比较,A值降低,差异有统计学意义(t值分别为4.599、2.716、6.537,P＜0.05).AO/EB双重荧光染色分析结果显示,10、30、50 μmol/L各染毒组的支持细胞凋亡率明显升高,与溶剂对照组(9.83±0.95)%、Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO组(15.60±2.74)%比较,p,p'-DDE处理组分别为(23.73±2.24)%、(30.03±2.84)%和(38.04±4.98)%,β-BHC处理组分别为(24.42±3.53)%、(30.64±1.06)%和(39.88±0.17)%,联合处理组分别为(37.08±1.71)%、(42.18±3.32)%和(41.25±3.36)%.逆转录(RT)-PCR结果表明,Caspase-3、Cagpase-8及Caspase-9 mRNA表达量随着p,p'-DDE、β-BHC及其联合浓度的增加而增加.结论 p,p'-DDE、β-BHC及其联合作用可通过激活启动Caspase-8和Caspage-9,进而激活下游效应Caspase-3引起支持细胞凋亡.     

溴氰菊酯对大鼠脑神经细胞凋亡及Caspase-3表达的影响

目的 研究Caspase-3在溴氰菊酯(deltamethrin,DM)诱导大鼠脑神经细胞凋亡机制中的作用。方法 成年雄性Wistar大鼠腹腔注射12.5 mg/kg的DM染毒,并分成不同时间观察组;以FACS420型流式细胞仪测定大鼠海马和皮层细胞凋亡率和Caspase-3蛋白的表达;以四肽化合物Ac-DEVD-pNa为底物测其神经细胞Caspase-3活力。结果 DM染毒后24 h、48 h、5 d组大鼠海马、皮层神经细胞凋亡率[海马:(8.45±1.02)％、(9.44±1.14)％、(7.58±0.75)％,皮层:(7.90±0.49)％、(8.01±0.87)％、(7.97±0.41)％]均高于对照组[海马:(2.97±0.36)％,皮层:(3.50±0.48)％],差异有统计学意义(P<0.01),而5 h组未见明显变化;DM染毒后5、24、48 h,大鼠海马、皮层神经细胞Caspase-3活力(A405nm吸光度值,海马:0.389±0.038、0.472±0.041、0.295±0.049,皮层:0.321±0.068、0.429±0.077、0.344±0.047)与5 d组大鼠海马Caspase-3活力(0.246±0.065)均明显高于对照组(海马:0.184±0.054,皮层:0.198±0.049),差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);DM染毒后5、24、48h,大鼠脑组织Caspase-3蛋白表达亦明显高于对照组,5 d组未见明显变化。结论DM可影响大鼠脑海马和皮层神经细胞凋亡率、Caspase-3活力及蛋白表达;Caspase-3活力及蛋白表达升高发生在神经细胞     

ABT-263诱导A431细胞凋亡及其对AKT下游信号通路影响

目的 观察抗凋亡蛋白抑制剂ABT-263对人皮肤鳞状细胞癌细胞系A431细胞功能的影响,并探讨相关分子机制。方法 (1)取对数生长期的人永生化表皮细胞(Ha Ca T细胞)与A431细胞提取总蛋白,采用蛋白印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)和BCL-XL的蛋白表达水平。(2)分别以浓度为50μmol/L的ABT-263(抑制剂组)和二甲基亚砜(对照组)处理A431细胞,培养4和9 h后,采用透射扫描电子显微镜(TEM)检测各组细胞的形态变化。(3)以剂量为0、10、25、40和50μmol/L的ABT-263处理A431细胞24 h后,采用CCK-8法检测细胞活力。(4)以不同剂量的ABT-263处理A431细胞,采用蛋白印迹法检测活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)、活化聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1(PARP-1)、磷酸化蛋白激酶B(p AKT)ser473、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p GSK3β)和磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)的蛋白相对表达水平。结果 A431细胞中的BCL-2和BCL-XL蛋白相对表达水平均高于Ha Ca T细胞(P0.01)。TEM检查结果显示,抑制剂组A431细胞从正常的形态逐渐变化为凋亡的形态,表现为微绒毛消失,核染色质密度增高并凝聚在核膜周边,核仁裂解。10、25、40和50μmol/L剂量组A431细胞的细胞活力均低于对照组(P0.05)。10、30和50μmol/L剂量组A431细胞的活化Caspase-3和活化PARP-1蛋白的相对表达水平均高于对照组(P0.05)。10、25、40、50μmol/L剂量组A431细胞的p AKT(ser473)和p GSK3β的蛋白相对表达水平均低于对照组(P0.05),γH2AX蛋白相对表达水平高于对照组(P0.05)。A431细胞活力和p GSK3β蛋白相对表达水平均随抑制剂剂量的增加而减少(P0.01),活化Caspase-3和γH2AX的蛋白相对表达水平均随抑制剂剂量的增加而增加(P0.01),均呈剂量-效应关系。结论 ABT-263可诱导A431细胞发生线粒体途径的凋亡,并可诱导AKT/GSK3β信号通路失活,从而促进A431细胞凋亡,呈一定程度的剂量-效应关系。     

葛根素对低氧性肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡及Kv1.5表达的影响

目的 观察葛根素对低氧性肺动脉平滑肌细胞( PASMCs)增殖与凋亡及电压门控型钾离子通道亚型(Kv1.5)表达的影响,探讨葛根素在改善低氧性肺动脉高压与抑制肺血管重建中可能的作用机制.方法 原代培养大鼠PASMCs,随机分为正常对照组(5％CO2常氧),低氧组(5％O2、5％CO2、90％N2三气培养),3个浓度葛根素干预组(在低氧组基础上分别加入终浓度为1×104、1×10-4、1×10-3 mol/L葛根素,37℃培养24 h).采用CCK-8法和流式细胞仪检测细胞增殖情况,分光光度法检测caspase-3活力,蛋白印迹及实时定量聚合酶链反应(PCR)法分别检测Kv1.5蛋白和mRNA表达.结果 与正常对照组(细胞活性:0.940±0.045,S期细胞比例:9.67％±1.28％,Caspase-3活力:0.1073±0.0113,Kv 1.5蛋白:0.886±0.038,Kv 1.5 mRNA 0.0377±0.0031)比较,低氧组细胞活性(1.296±0.034)、S期细胞比例(18.19％±1.19％)升高,Caspase-3活力(0.0664±0.0049)下降,Kv1.5蛋白(0.602±0.064)及mRNA (0.0108±0.0014)表达下降,差异均有统计学意义(P＜0.05);与低氧组比较,各剂量葛根素干预组细胞活性和S期细胞比例下降,Caspase-3活力升高,Kv 1.5蛋白及mRNA表达上调,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 葛根素可抑制低氧性PASMCs增殖,促进其凋亡,其作用机制可能通过上调Kv 1.5表达抑制PASMCs的增殖.     

醋酸铅对小鼠星形胶质细胞凋亡及Caspase-3表达影响

目的 探讨醋酸铅对小鼠星形胶质细胞凋亡和Caspase-3表达的影响.方法 10 μmol/L醋酸铅处理小鼠星形胶质细胞24、48 h后,采用Hoechst33258染色法观察细胞形态学变化;聚合酶链反应(PCR)、细胞免疫化学法测定Caspase-3的转录与表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 经10μmol/L醋酸铅处理24、48 h后小鼠星形胶质细胞呈凋亡形态学改变.Caspase-3转录与表达水平升高,醋酸铅组细胞凋亡率与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 醋酸铅可促进小鼠星形胶质细胞凋亡,Carpase-3参与了凋亡过程.     

甲基汞致人肝细胞株HL-7702凋亡及相关机制

目的 研究甲基汞对体外培养的人肝细胞株HL-7702的凋亡作用及其机制.方法 实验分为阴性对照组及甲基汞受试物组,甲基汞的浓度分别为10、20、30、40、50 μmol/L.采用丫啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)染色法和流式细胞技术检测甲基汞对细胞凋亡的影响;流式细胞技术检测甲基汞对细胞线粒体膜电位的影响;免疫细胞化学方法 检测甲基汞对凋亡相关蛋白表达的影响.结果 不同浓度氯化甲基汞作用24 h均可诱导细胞凋亡,AO/EB染色法检测阴性对照组细胞凋亡率为(2.62±0.19)%,10～50μmol/L 甲基汞受试物组细胞凋亡率分别为(7.97±0.64)%、(12.66±0.76)%、(19.16±0.87)%、(18.42±0.88)%、(11.52±0.63)%,各剂量组细胞凋亡率明显高于对照组(q值分别为17.057、32.009、52.732、50.373、28.375;P＜0.05).随着作用浓度的升高细胞线粒体膜电位明显下降,阴性对照组线粒体膜电位为(10.23±3.43)mV,10～50 μmol/L 甲基汞受试物组线粒体膜电位分别为(3.25±0.66)、(3.03±0.35)、(1.68±1.26)、(1.69±1.13)、(1.77±0.88)mV,各剂量组明显低于对照组(q值分别为9.569、9.871、11.722、11.708、11.598;P＜0.05).随着甲基汞作用浓度的升高 Bax、Bel-2、CytC、Caspase-3 及AIF表达有上升的趋势,且Bax/Bcl-2值升高.阴性对照组Bax表达的积分吸光度值(IOD)为21 295.86±1969.81,10、20、30μmol/L 组Bax表达的IOD分别为42 807.87±4416.64、55 651.65±4662.72、72 708.56±910.10,各剂量组明显高于对照组(g值分别为14.191、14.320、33.917;P＜0.05);阴性对照组Bcl-2表达的IOD为12 588.33±4091.02,10、20、30μmol/L组Bel-2表达的IOD分别为20 539.16±4906.09、23 689.97±2281.42、28692.80±4655.86,各剂量组明显高于对照组(g值分别为4.322、6.035、8.754;P＜0.05);阴性对照组AIF表达的IOD为12 942.72±457.94、10、20、30、40μmol/L组AIF表达的IOD分别为16 973.57±1922.87、29 998.91±6803.58、52 467.16±1916.25、106 342.53±1273.19,20、30及40 μmol/L组明显高于对照组(q值分别为11.449、26.530、62.692;P＜0.05).结论 甲基汞可以通过线粒体通路诱导体外培养的人肝细胞株HL-7702发生凋亡.     

RNA干扰Caspase-3基因对镉诱导转化人胚肾293细胞凋亡的影响

目的 研究RNA干扰Caspase-3基因对镉致转化人胚肾293细胞凋亡的影响,探讨Caspase-3基因在镉致细胞凋亡中的作用.方法 选择转化人胚肾293细胞进行体外培养,以小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)处理细胞36 h后,再以40 μmol/L氯化镉分别处理12～24 h,以四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞活力,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blot法分别检测Caspase-3基因表达水平和蛋白表达水平,以流式细胞仪Annexin-V-PI双染法检测细胞凋亡率.结果 40μmol/L氯化镉处理转化人胚肾293细胞12 h后,Caspase-3基因mRNA水平显著增高,相对分子质量为20 kDa的活性亚单位条带显著增强;24 h后,细胞凋亡率显著增加(n=4,P＜0.01),RNA干扰显著抑制镉诱导的细胞Caspase-3基因mRNA和相对分子质量为20 kDa的蛋白表达水平,使细胞凋亡率显著降低(n=4,P＜0.01).结论 体外实验表明,RNA干扰Caspase-3基因对镉诱导转化人胚肾293细胞凋亡具有明显的抑制作用,Caspase-3基因在镉诱导转化人胚肾293细胞凋亡过程中起着重要的作用.     

PCB153对INS-1细胞毒性作用及机制

目的 探讨2,2＇,4,4＇,5,5＇-六氯联苯(PCB153)对体外培养胰岛β细胞株(INS-1)细胞毒性作用及机制.方法 PCB153设3个剂量组(1、3、6μmol/L),二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照组,染毒INS-1细胞24 h后,检测细胞存活率、凋亡、活性氧(ROS)水平、Caspase 3和Caspase 12等凋亡相关基因表达水平.结果 3、6 μmol/L PCB153剂量组细胞存活率分别为(80.9±8.7)％和(42.2±4.3)％,与对照组比较均有下降(P＜0.05);3μmol/L PCB153剂量组ROS为(9.2±0.4)、凋亡率为(30.7±3.4)％,6μmol/L PCB153剂量组ROS为(13.7±1.6)、凋亡率为(40.4±1.3)％,与对照组比较,ROS水平和细胞凋亡率均增加(P＜0.05);与对照组比较,3 μmol/L PCB153剂量组Caspase 3及3、6μmol/L PCB153剂量组Caspase 12基因表达水平均有增加(P＜0.05).结论 PCB153可诱导INS-1细胞凋亡,氧化应激和内质网信号通路可能参与PCB153对INS-1细胞的毒性作用.     

褪黑素对溴氰菊酯致大鼠海马神经细胞Bcl-2和细胞色素C表达及细胞凋亡率的影响

目的 观察褪黑素(MT)对溴氰菊酯(DM)引起的大鼠大脑海马脑神经细胞凋亡率、Bcl-2蛋白表达水平及细胞色素C表达的影响.方法 40只Wistar雌性大鼠随机分为5组:橄榄油对照组(1 ml/kg橄榄油)、单纯DM组(12.5 mg/kg DM)、DM+MT25组(25.0 mg/kg MT+12.5mg/kg DM)、DM+MT50组(50 mg/kg MT+12.5 mg/kg DM)、DM+MT100组(100 mg/kg MT+12.5 mg/kg DM),每组8只,一次性给药24 h后,每组大鼠分别断头处死.应用流式细胞术测大鼠海马细胞凋亡率;应用免疫组化和计算机显微图像分析技术测大鼠海马神经细胞中Bcl-2蛋白表达水平和细胞色素C的表达.结果 DM+MT25、DM+MT50、DM+MT100各组Bcl-2蛋白表达水平分别为(45.26±3.84)、(39.40±4.04)、(34.40±4.52),明显低于对照组(59.33±4.03),但明显高于单纯DM组(20.73±3.34),差异均有统计学意义(P＜0.05);DM+MT25、DM+MT50、DM+MT100组的细胞色素C表达水平分别为(20.53±3.17)、(28.73±2.61)、(28.66±4.82),DM+MT50、DM+MT100组细胞色素C表达水平明显高于对照组,3个MT剂量组均明显低于对单纯DM组,且差异均有统计学意义(P＜0.05).3个MT剂量组神经细胞凋亡率分别为(15.00±1.77)%、(14.88±1.84)%、(11.75±1.93)%,明显低于单纯DM组(23.06±3.63)%,但高于对照组(5.69±1.37)%,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 MT能够抑制DM引起的大鼠海马神经细胞中Bcl-2蛋白水平的降低和细胞色素C的升高,抑制细胞凋亡率,MT可能通过改变蛋白的表达水平和抗凋亡能力发挥脑保护作用.