6株抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体的鉴定及初步应用

目的对6株抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体生物学特性进行鉴定,并探讨其在血吸虫病诊断中的应用价值。方法采用酶联免疫吸附试验及免疫印迹法对6株单克隆抗体的类和亚类、腹水效价、亲和常数、检测灵敏度和特异性进行测定与鉴定。建立检测日本血吸虫感染兔血清14-3-3蛋白的Dot-ELISA方法,对感染兔吡喹酮治疗前、后不同时间的配对血清中14-3-3蛋白含量的动态变化进行观察,并通过对一批血吸虫感染兔血清样本进行检测,以评价该方法的诊断价值。结果 6株抗日本血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体3F1、3F7、5C6、5D1、5G9、1G6的抗体亚类分别为IgG1、IgG2 a、IgG2b、IgG1、IgG1和IgG1;腹水单克隆抗体效价分别为1∶6.4×105、1∶8.0×105、1∶6.4×105、1∶3.2×105、1∶4.8×105和1∶2.0×104;亲和常数分别为8.82×108、4.93×108、1.56×108、5.12×108、1.41×108mol/L和2.30×107mol/L;Dot-ELISA方法检测14-3-3蛋白的灵敏度分别为1、10、100、10、10 ng和100 ng。免疫印迹试验结果表明,6株单克隆抗体均可与体外重组表达纯化的日本血吸虫14-3-3蛋白特异性结合,同时也能与日本血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原和成虫抗原中的天然14-3-3蛋白特异性反应,而与大肠埃希菌和华支睾吸虫抗原均无明显交叉反应。以单抗3F1和5D1为检测抗体建立的Dot-ELISA方法检测日本血吸虫感染兔治疗前、后不同时间点血清,发现随着感染时间的延长,兔血清中14-3-3蛋白含量逐渐增加,吡喹酮治疗后兔血清中14-3-3蛋白含量逐渐降低。采用此Dot-ELISA方法检测42份血吸虫感染兔血清,41份阳性,敏感性为97.6%;10份健康兔血清均为阴性,特异性为100%。结论 6株单克隆抗体均能有效识别天然的日本血吸虫信号蛋白14-3-3,初步证明以单抗3F1和5D1为检测抗体建立的Dot-ELISA方法具有一定的日本血吸虫活动性感染诊断及潜在的疗效考核价值。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的纯化及抗体制备

目的制备日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白Sj14-3-3的多克隆抗体与单克隆抗体。方法将合Sj14-3-3重组蛋白的凝胶条带冻干磨粉,免疫家兔,制备抗Sj14-3-3多克隆抗血请;用电洗脱纯化的Sj14-3-3免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗Sj14-3-3单克隆抗体。测定所得抗体效价及特异性鉴定。结果获得大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64。获得1株能稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞株4D9,单抗亚类为IgG1。此株单抗能与重组Sj14-3-3蛋白发生特异性反应。结论获得了高度敏感、特异的抗Sj14-3-3多克隆抗血清及稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞。     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的　初步探讨重组信号蛋白 14 3 3及 14 3 3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。　方法　用rSj14 3 3和rSj14 3 3 /SjGST免疫BALB/c小鼠 ,日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染 ,收集实验组与对照组成虫和虫卵 ,计算减虫率和减卵率 ;间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化 ;显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小 ,观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。　结果　上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为 3 1.93 %和 3 4.3 9% ;每克肝组织减卵率分别为 5 3 .2 4%和 60 .0 6% ,每对成虫减卵率分别为 3 3 .3 9%和 40 .48% ;免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性 ,免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组 ;实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降3 5 .2 3 %和 46.13 %。　结论　信号蛋白 14 3 3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用 ,复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的初步探讨重组信号蛋白14-3-3及14-3-3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。方法用rSj14-3-3和rSj14-3-3／SjGST免疫BALB／c小鼠，日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染，收集实验组与对照组成虫和虫卵，计算减虫率和减卵率；间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化；显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小，观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。结果上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为31．93％和34．39％；每克肝组织减卵率分别为53．24％和60．06％，每对成虫减卵率分别为33．39％和40．48％；免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性，免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组；实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降35．23％和46．13％。结论信号蛋白14-3-3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用，复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。     

猪带绦虫Tsl4-3-3.6蛋白多克隆抗体制备及在不同发育阶段的表达北大核心CSCD

目的制备猪带绦虫Ts14-3-3.6蛋白多克隆抗体,并检测Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫及囊尾蚴阶段的表达情况。方法合成Ts14-3-3.6基因全长,然后克隆至pCznI原核表达质粒,转化至大肠埃希菌ArctieEx-press中并诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析,通过Ni柱亲和纯化获得Ts14-3-3.6重组蛋白。将该重组蛋白免疫新西兰兔,制备抗Ts14-3-3.6多克隆抗体,以此为一抗采用Western blot检测Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段的表达。结果pCznI一Ts14-3-3.6重组表达质粒构建成功,诱导表达的Ts14-3-3.6重组蛋白存在于包涵体中,相对分子质量约29.43X102。Western blot检测纯化带有His标签的Ts14-3-3.6重组蛋白能被His标签抗体识别;用该蛋白免疫新西兰兔获得效价为1:512000的多克隆抗体;分别以提取的猪带绦虫成虫和囊尾蚴总蛋白为抗原进行Westernblot,均出现与Ts14-3-3.6多克隆抗体、囊虫病人血清及囊虫病猪血清反应条带,即均有该蛋白的表达。结论成功制备猪带绦虫Ts14-3-3.6重组蛋白并获得较高纯度的特异性高效价多克隆抗体。Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达。     

日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3的制备及其特性分析

目的制备可溶性重组日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3（rSj14-3-3）,并研究其免疫学特性。方法采用反转录聚合酶链反应方法从日本血吸虫成虫mRNA中制备Sj14-3-3基因cDNA片段,将此cDNA片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-3的谷胱甘肽还原酶的基因下游,构建重组表达质粒Sj14-3-3/pGEX-4T-3。重组质粒转化大肠埃希菌BL21,转化子细菌采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导,表达产物经SDS-PAGE以观察重组GST-Sj14-3-3表达情况。GST-rSj14-3-3经凝血酶消化后,经过Glutathione Sepharose-4B胶亲和层析制备纯化的rSj14-3-3。rSj14-3-3免疫家兔制备免疫兔血清,经免疫印迹试验分析rSj14-3-3免疫原性和反应性。结果日本血吸虫江苏株Sj14-3-3蛋白基因编码序列被成功克隆,开放阅读框的DNA序列与基因库中的登录序列同源性为99.08%。构建的含Sj14-3-3蛋白基因的重组表达质粒经IPTG诱导能表达分子量约为55 kDa的融合蛋白,融合蛋白经凝血酶切割和亲和层析获得纯化的rSj14-3-3。rSj14-3-3能诱导家兔产生高效价的特异性抗体,该抗体可识别重组和天然的14-3-3蛋白。结论本研究成功制备了可溶性rSj14-3-3,其具有良好的免疫原性与反应性。     

rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响

目的　探讨日本血吸虫信号蛋白 14 - 3- 3基因重组蛋白 (rSj14 - 3- 3)及其与谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(rSj14 - 3- 3/SjGST)对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。 方法　用rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST免疫雌性BALB/c小鼠 ,末次免疫后 5d ,各组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 4 0± 1条 /鼠 ,6周后 ,剖杀 ,取肝组织计数肝表面虫卵结节密度和肝切片上单个虫卵肉芽肿直径大小。结果　免疫组 (14 - 3- 3组和 14 - 3- 3/GST组 )和对照组肝表面虫卵结节数分别为 6 72±1 14、5 89± 1 0 3和 2 1 0 5± 1 2 6 ,前两者比后者分别减少了 6 8 0 8%和 72 0 2 % ;肝肉芽肿平均直径免疫组为 178 12±32 18μm和 14 8 13± 2 9 6 5 μm ,与对照组 2 75 0 0± 38 2 1μm相比分别减少了 35 2 3%和 4 6 13%。结论　重组抗原rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST对日本血吸虫具有较好的抗病效果。     

重组小鼠脑14-3-3γ蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备重组小鼠脑14-3-3γ蛋白单克隆抗体(McAb),为神经系统退行性疾病的诊断提供标志物.方法 采用重组小鼠脑14-3-3γ蛋白免疫小鼠,制备抗小鼠脑14-3-3γ蛋白的多克隆抗体,并应用多克隆血清检测14-3-3蛋白在大鼠脑中的分布.进一步应用杂交瘤技术制备其单克隆抗体,并鉴定其特异性以及与天然抗原的亲合力.结果 制备的多克隆血清能有效识别大鼠脑组织的14-3-3蛋白,免疫组化显示在黑质,蓝斑,室周核,背外侧核染色阳性.制备的单克隆抗体可特异性识别重组14-3-3γ蛋白、大鼠脑及人脑中14-3-3蛋白.结论 重组小鼠脑14-3-3γ蛋白多克隆血清和单克隆抗体成功制备;此可用于神经系统退行性疾病的诊断.     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其单克隆抗体用于诊断的价值

目的探讨纯化的日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其相应单克隆抗体对日本血吸虫病的诊断价值。方法利用纯化的rSj14-3-3抗原和可溶性虫卵抗原(SEA)间接ELISA方法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清中特异性抗体;以纯化的抗rSj14-3-3单克隆抗体包板,以兔抗rSj14-3-3多抗和酶标羊抗兔多抗为检测系统的酶标夹心法检测患者血清中的循环抗原。结果用rSj14-3-3检测急、慢性血吸虫病患者血清中特异性抗体的阳性率分别为100%和933%,用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原的阳性率分别为100%和956%,两者联合检测的总阳性率分别为100%和978%;经治疗后2、4、6、12个月,抗体转阴率分别为387%、548%、75%、90%,血清循环抗原转阴率分别为177%、419%、55%、85%,两者联合检测的总转阴率分别为452%、63%、85%、90%;对正常人血清的检测未见假阳性反应,与华支睾吸虫病和钩虫病患者血清出现轻微的交叉反应;用SEA检测抗体的阳性率分别为978%和956%,与正常人及华支睾吸虫病和钩虫病患者血清均有不同程度的交叉反应,治疗后2、4、6、12个月阴转率分别为32%、65%、125%、15%。结论rSj14-3-3检测急慢性血吸虫病患者血清中的特异性抗体和利用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原具有高度的特异性和敏感性,抗原和单抗可规模化     

猪带绦虫Ts14-3-3.6蛋白多克隆抗体制备及在不同发育阶段的表达

目的制备猪带绦虫Ts14-3-3.6蛋白多克隆抗体,并检测Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫及囊尾蚴阶段的表达情况。方法合成Ts14-3-3.6基因全长,然后克隆至pCznI原核表达质粒,转化至大肠埃希菌Arctic Express中并诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析,通过Ni柱亲和纯化获得Ts14-3-3.6重组蛋白。将该重组蛋白免疫新西兰兔,制备抗Ts14-3-3.6多克隆抗体,以此为一抗采用Western blot检测Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段的表达。结果 pCznI-Ts14-3-3.6重组表达质粒构建成功,诱导表达的Ts14-3-3.6重组蛋白存在于包涵体中,相对分子质量约29.43×10~3。Western blot检测纯化带有His标签的Ts14-3-3.6重组蛋白能被His标签抗体识别;用该蛋白免疫新西兰兔获得效价为1∶512 000的多克隆抗体;分别以提取的猪带绦虫成虫和囊尾蚴总蛋白为抗原进行Western blot,均出现与Ts14-3-3.6多克隆抗体、囊虫病人血清及囊虫病猪血清反应条带,即均有该蛋白的表达。结论成功制备猪带绦虫Ts14-3-3.6重组蛋白并获得较高纯度的特异性高效价多克隆抗体。Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达。     

空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的表达及单克隆抗体的制备

目的表达CJPEB1重组蛋白,制备并鉴定CJ PEB1蛋白的单克隆抗体。方法诱导培养工程菌E．co-liBL21（DE3）表达CJPEB1重组蛋白,以PEB1蛋白溶液与等体积的佐剂完全乳化作为免疫原常规免疫BALB／C小鼠,制备单克隆抗体。无菌取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行融合,建立杂交瘤细胞株。将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水制备抗体,应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测腹水中抗体的效价,应用Western-blot和玻片凝集试验检测抗体的特异性。结果得到高纯度的CJPEB1重组蛋白,蛋白质分子量大小与预计的理论值相符。获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。两株杂交瘤细胞诱生的腹水,经间接ELISA法检测,腹水中的抗体效价分别为8×10^4和5×10^4,经双向琼脂扩散试验检测效价均为1：16。通过Westem-blot鉴定,两株杂交瘤细胞分泌的抗体均与PEB1蛋白特异性地结合;其诱生的腹水与CJ菌液混合出现凝集现象,而与大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等菌液混合均未出现凝集现象。结论成功建立了两株稳定分泌抗CJPEB1重组蛋白抗体的杂交瘤细胞株并制备了抗CJPEB1蛋白的单克隆抗体,为今后研究多种检测CJ的方法创造了条件。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3DNA免疫保护作用的观察

目的　研究日本血吸虫 (中国大陆株 )重组信号蛋白 14 - 3- 3(rSj14 - 3- 3)DNA作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能。方法　碱裂解法大量制备rSj14 - 3- 3和rSjGSTDNA ,将两种DNA分别免疫BALB/c小鼠进行攻击感染实验。 结果　在尾蚴攻击感染 6w后 ,剖杀小鼠计算各组的减虫率 ,rSj14 - 3- 3DNA组为 34 2 0 % ,rSj14 - 3- 3+rSjGSTDNA组为32 4 0 % ;减卵率为 (按以上组序 ) 5 0 74 %和 5 5 2 3%。结论　重组Sj14 - 3- 3DNA具有一定的抗血吸虫病潜能 ,有可能作为日本血吸虫病的候选疫苗 ,但未见Sj14 - 3- 3、SjGST两种重组DNA的协同作用。     

日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3在原核细胞的高效融合表达和特性鉴定

目的　构建重组质粒pET2 8a -Sj14 - 3- 3,并在大肠杆菌中表达 ,检测表达产物的免疫活性。 方法　用亚克隆技术把Sj14 - 3- 3基因克隆至 pET2 8aT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α和BL2 1感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE和Westernblot分析。结果　获得pET2 8a -Sj14 - 3- 3重组表达载体 ,SDS -PAGE和Westernblot显示Sj14 - 3- 3基因在 pET2 8a中表达的融合蛋白约为 32 4kDa ,与天然 14 - 3- 3蛋白具有相同的免疫活性。 结论　日本血吸虫信号蛋白14 - 3- 3在原核细胞中得以高效表达 ,表达产物具有免疫活性 ,为进一步研究其免疫保护作用和信号转导奠定了基础     

抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究

目的建立分泌抗华支睾吸虫代谢抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法用华支睾吸虫成虫代谢抗原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫全虫可溶性抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应。结果获得3株分泌高滴度抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应，3株单抗均属IgG。结论制备的抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗，为制备免疫诊断试剂盒奠定了基础。     

抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6抗原识别表位的鉴定

目的 目的 采用噬菌体展示肽技术鉴定抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6的抗原识别表位。 方法 方法 将纯化的抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6作为固相配基筛选噬菌体随机展示12肽库, 按照吸附?洗脱?扩增的淘洗过程进行3轮生物淘洗, 富集特异性结合的噬菌体颗粒。随机挑取第3轮洗脱的独立噬菌体克隆, 分别依次进行噬菌体扩增、基因组DNA抽提和DNA序列分析。选择外源性插入DNA序列完全相同或高度相似的同源性噬菌体, 采用ELISA及免疫印迹分析对其免疫反应性作进一步鉴定, 以确定单克隆抗体5C6的抗原识别表位。 结果 结果 第3轮淘洗物中33个独立噬菌体克隆的DNA测序结果显示, 其中25个噬菌体编码外源性插入肽的核酸序列均为5′?CCACCTAGTAGCAGACCGATTCT? CAGTCGAAGGAAA?3′, 其对应的演绎氨基酸序列为PPSSRPILSRRK, 该肽与日本血吸虫信号蛋白14?3?3及自然界其他已知蛋白的氨基酸序列均无同源性。免疫印迹试验证实此短肽可被自然感染的日本血吸虫病人血清所识别, 而不与健康人血清反应。 结论 结论 本研究成功鉴定了抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6所识别的模拟抗原表位, 并证明该表位为空间构像表位。     

抗重组日本血吸虫P38抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的?摇在大肠埃希菌中可溶性表达日本血吸虫P38（SjP38）抗原分子，并以其纯化产物为抗原，制备抗SjP38单克隆抗体(McAb)。 方法 将pET32(a)-P38重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)，在1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达，超声破菌后获得可溶性表达产物，通过镍柱一步法纯化，以纯化的重组SjP38为抗原，免疫BALB/ｃ小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，用ELISA和有限稀释法筛选出高分泌滴度McAb杂交瘤细胞株，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，蛋白质印迹法（Western blotting）分析其特异性。 结果 筛选出能稳定分泌抗重组SjP38单克隆抗体的8株杂交瘤细胞株，均为IgG1； Western blotting 分析显示8株单抗能与日本血吸虫虫卵抗原中的天然P38发生特异性结合。 结论 制备的抗P38杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的McAb。