多种细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:肝细胞移植是治疗终末期肝功能衰竭的有效方法之一,却面临细胞来源缺乏、体外难以大量增殖、传代后无法保持其原有特性、免疫排斥等因素的限制,寻找新的肝细胞来源尤为迫切.目的:探讨肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子及抑瘤素M诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的能力.设计、时间及地点:细胞对照观察,于2006-0612007-03在泸州医学院附属医院实验室完成.材料:清洁级雄性Wistar大鼠24只用于制备骨髓间充质干细胞.红细胞裂解液由泸州医学院附属医院传染免疫实验室配制重组鼠肝细胞生长因子、抑瘤素M为美国R&D产品,酸性成纤维细胞生长因子由美国Peprotech生产.方法:采用红细胞裂解+贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰蛋白酶消化后传代.传至第4代,以5×107 L-1接种,设立6组向肝细胞诱导分化:第1组作为对照,不加任何细胞因子;第2组加入肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子;第3组加入肝细胞生长因子、抑瘤素M;第4组加入酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素M;第5组加入肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素M;第6组于1～9d加入肝细胞生长因子,9～18d加入酸性成纤维细胞生长因子,9～21d加入抑瘤素M.每组所加入的各种细胞因子终末浓度均为20μg/L.主要观察指标:采用溴甲酚绿法、化学发光法、RT-PCR法检测肝细胞特异性标志物白蛋白、甲胎蛋白的表达.采用谷氨酸脱氢酶法检测尿素含量.结果:诱导0,7,14,21d,未加入诱导因子的对照组及酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组无白蛋白、尿素表达,肝细胞生长因子+酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组培养基上清液中甲胎蛋白、白蛋白、尿素含量均显著高于其余因子组(P<0.05).结论:酸性成纤维细胞生长因子与抑瘤素M共同作用无法诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化,二者联合肝细胞生长因子可成功诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞.分时段加入此三种细胞因子,可能影响了细胞因子间的相互作用而导致分化率降低.     

骨髓间充质干细胞(MSCS)诱导分化为心肌细胞研究进展

近年来人们一直在寻求用一种细胞取代梗死的心肌细胞以期维持正常的心脏功能。研究发现 ,胚胎干细胞 (ES)因牵涉伦理问题应用受限 ;胎儿心肌细胞对缺血耐受性差 ;骨骼肌细胞分化成熟后无法与宿主细胞建立电机械耦联 ;心脏的干细胞数量太少。相比之下骨髓间充质干细胞 (MSCs)不受上述因素制约 ,是目前认为较有希望成为梗死心肌细胞替代治疗的干细胞。笔者就MSCs诱导分化为心肌细胞的研究进展进行综述。1　骨髓间充质干细胞1.1　MSCs的特性　体外研究显示 ,MSCs在不同的分离培养环境下表现出不同的表面抗原特性 ,多次传代后其分化潜能随…     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的:国内外对骨髓间充质干细胞体外成功诱导分化为胰岛素分泌细胞的报道屡见不鲜,但这些诱导方法都比较繁琐,而且大多都应用了细胞因子.实验拟验证体外非细胞因子方法诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的可能性.方法:实验于2005-11/2007-01在大连医科大学诊断学实验中心,校一级实验室完成.①实验材料:4～6周龄Wistar大鼠由大连医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下取大鼠的骨髓细胞,并通过贴壁时间差异性去除单核细胞从而获得骨髓干细胞.应用二甲基亚砜及高糖环境依次对大鼠骨髓间充质干细胞进行体外诱导,以直接加入含体积分数为0.10胎牛血清的L-DMEM培养基培养的为对照.③实验评估:通过形态、双硫腙染色、免疫组织化学及RT-PCR方法对诱导后的细胞进行检测,采用ELISA方法对诱导后细胞分泌的胰岛素进行检测. 结果:①培养10 d时,诱导组细胞呈细胞团样改变,内层的细胞为圆形,外层的细胞呈长梭形并包绕着内层细胞.对照组细胞也呈团样改变,但形态不规则,呈发散状,细胞呈梭形类似骨髓间充质细胞.②诱导组的细胞团双硫腙染色后呈明显猩红色,对照组形成的细胞团双硫腙染色不显色.③诱导组成团及单个存在的圆形和梭形细胞中有胰岛素存在,对照组细胞团及未成团细胞中无胰岛素存在.④在内参蛋白GAPDH表达量大致相等的条件下,诱导组诱导的细胞表达Ins1和Ins2,对照组培养的细胞不表达Ins1和Ins2.⑤ELISA法证实诱导后细胞向胞外分泌胰岛素,与对照组比较差异显著(P < 0.05).结论:大鼠骨髓间充质干细胞体外经过二甲基亚砜和高糖环境诱导可分化为胰岛素分泌细胞.     

体外模拟心肌环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的:以往研究将长有一层心肌细胞的半透膜放于骨髓间充质干细胞培养皿中,或用培养过心肌细胞的培养基来培养骨髓间充质干细胞,均未发现心肌细胞特异蛋白表达.为此体外模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并与常规诱导剂5-氮杂胞苷的诱导效果进行比较.方法:实验于2007-03/09在山西医科大学中心实验室完成.①动物:Wistar大鼠20只,新生1 d龄Wistar乳鼠10只,均由山西医科大学动物房提供,清洁级,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.诱导剂5-氮杂胞苷为美国Sigma公司产品.②实验方法:自新生Wistar乳鼠心脏分离培养心肌细胞,取第1、2代制成1×109 L-1细胞悬液,-70 ℃放置4～5 h后融化,吸管吹打,反复3次,离心取上清,过滤后即为心肌细胞冻融液,以此作为培养基体外模拟心肌微环境.自成年Wistar大鼠骨髓分离骨髓间充质干细胞,取生长良好的第2代制成1×108 L-1细胞悬液,分为4组:血清对照组加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基;5-氮杂胞苷组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷37 ℃避光孵育24 h后,换DMEM/F12培养基继续培养;5-氮杂胞苷 心肌细胞冻融液组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导24 h后,在培养体系中加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液;心肌细胞冻融液组加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液.③实验评估:诱导1周后观察骨髓间充质干细胞的形态变化,利用免疫细胞化学技术鉴定心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、α-横纹肌肌动蛋白、CD31的表达情况.结果:①体外模拟心肌微环境情况:培养7 d时心肌细胞形成细胞簇或细胞单层,呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长,细胞簇搏动呈明显同步性.传代后的心肌细胞仍具有自主收缩的特性.②骨髓间充质干细胞的体外诱导结果:诱导处理1周后,5-氮杂胞苷组多数细胞呈杆状,紧密平行排列生长,细胞体积变大,可见肌丝样结构形成;心肌细胞冻融液组细胞有聚集生长趋势,形成大量的子细胞,可见大量的肌丝样的结构;5-氮杂胞苷 心肌细胞冻融液组脱落或降解的细胞数明显少于5-氮杂胞苷组,也形成肌丝样结构,但部分细胞内有脂肪空泡形成.③免疫细胞化学鉴定结果:诱导培养1周后,血清对照组仅表达α-横纹肌肌动蛋白;5-氮杂胞苷组表达心肌特异性蛋白T、α-横纹肌肌动蛋白、连接蛋白43,其阳性率分别为20%,28%,25%,抗CD31染色呈阴性;心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率分别为23%,32%,28%,明显高于5-氮杂胞苷组(P < 0.05),同时抗CD31染色呈阳性;5-氮杂胞苷 心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率略低于心肌细胞冻融液组,抗CD31染色呈阳性.结论:①以心肌细胞冻融液体外模拟心肌微环境,可高效诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞.②部分骨髓间充质干细胞表达CD31,即可向血管内皮细胞分化,提示与5-氮杂胞苷单一的肌细胞诱导作用相比,心肌细胞冻融液更能提供一个心肌再生所需的自然条件.     

全骨髓贴壁法获纯化骨髓间充质干细胞向神经干细胞的诱导分化

目的:来源于骨髓间充质干细胞的神经干细胞是最近研究的一个热点.实验拟进一步验证通过全骨髓贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞并诱导分化为神经干细胞的效率,并对其的体内外标记进行了观察.方法:实验于2006-11/2007-05在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成.①实验材料:选取出生4周左右Wistar大鼠,雌雄不拘,SPF级,体质量200 g左右,由青岛市实验动物和动物实验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:选用出生4周左右Wistar大鼠,由其股骨和胫骨分离纯化骨髓间充质干细胞,加碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子诱导其分化为神经干细胞,并进行免疫组织化学鉴定.以5.溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记神经干细胞,在24孔板中进行细胞免疫组织化学和免疫荧光鉴定.将标记的神经干细胞定位注入大鼠基底节区,1周后取脑作石蜡切片,进行免疫组织化学和免疫荧光染色.结果:获得了较纯化的骨髓间充质干细胞,经诱导72 h后,部分细胞增殖分裂成小圆形,呈团簇状半悬浮状态.继续培养72 h可见细胞呈现典型神经元样改变,细胞伸出两个或多个突起,胞体呈多角形或不规则形,折光性较强,细胞突起之间相互连接成网状,可见细胞核及核仁,经诱导后有巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达.采用BrdU掺入DNA合成期的神经干细胞,1周后体内外标记阳性率＞85%.结论:采用全骨髓贴擘法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化神经干细胞.BrdU可作为神经干细胞体内示踪的理想标记物.     

胎儿肠壁结缔组织诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞

背景:间充质干细胞具有多向分化能力,在体外能诱导分化为上皮细胞,而胚胎原始消化管上皮的分化受肠壁间充质的诱导.肠壁结缔组织能否诱导骨髓间充质干细胞分化形成上皮细胞,尚不明确.目的:观察胎儿肠壁结缔组织能否诱导骨髓间充质干细胞分化形成上皮细胞.设计:体外培养,对比观察.单位:实验于2004-07/2006-07在重庆医科大学组织胚胎学教研室完成.材料:表皮生长因子为Sigma公司产品:CK,CK20为中山生物有限公司产品.收集四五个月流产胎儿标本6例的四肢骨髓,Ficoll离心,分离、培养、扩增获取骨髓间充质干细胞.取胎儿十二指肠乳头以下肠段,剥去肌层和外膜,酶消化去除上皮,剪成约15 mmx5 mm的组织块.胎儿标本由临床学院妇产科提供,产妇同意提供胎儿用于实验,实验经医院伦理委员会批准.方法:实验分4组进行:干细胞移植组和干细胞移植 表皮生长因子组分别将DAPI标记的第3代骨髓间充质干细胞(3×104)个移植于肠壁结缔组织块的黏膜下层表面:干细胞组和干细胞 表皮生长因子组为骨髓间充质干细胞爬片:其中干细胞移植 表皮生长因子组和干细胞 表皮生长因子组加入终浓度为10 μg/L表皮生长因子;4组均体外培养12 d.主要观察指标:①用荧光显微镜观察DAPI标记的骨髓间充质干细胞的形态及分布.②干细胞移植组和干细胞移植 表皮生长因子组组织块培养12 d后,采用苏木精-伊红染色观察与荧光显微镜观察同一肠壁结缔组织表面细胞形态.③免疫组化染色检测标记细胞CK及CK20的表达,以及肠学结缔组织是否表达表皮生长因子.④高碘酸-希夫反应(PAS反应)检测DAPI标记细胞与结缔组织间有无基膜样物质产生.结果:①荧光显微镜下干细胞移植组和干细胞移植 表皮生长因子组的组织块表面均有DAPI标记的荧光阳性细胞.苏木精-伊红染色显示该部位细胞呈上皮样形态,而且在培养时经多次换液末被洗去为长在结缔组织表面的细胞.②免疫组织化学染色显示两组组织块表面的细胞均可表达CK及CK20.③免疫荧光染色显示组织块表面的细胞同时有标记细胞核的DAPI蓝色荧光与标记CK的红色荧光,表明DAPI标记的骨髓间充质干细胞已经分化为上皮细胞.④干细胞组细胞CK及CK20阴性,而干细胞 表皮生长因子组则为阳性,提示表皮生长因子有诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞的作用.⑤PAS反应显示在标记细胞与结缔组织之间有基膜样结构糖蛋白出现.未经培养的结缔组织组织块内有表皮生长因子表达.结论:表皮生长因子和胎儿肠璧结缔组织在体外均能诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞;肠壁结缔组织中的表皮生长因子可能是结缔组织诱导骨髓间充质干细胞分化为皮细胞的因素之一.     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞

背景:体外培养扩增的骨髓间充质干细胞可诱导分化为神经细胞,但是有些诱导剂有一定的毒性,不能应用于人体内.目的:以黄芪为诱导剂,诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞.设计、时间及地点:随机对照实验,于2002-01/2005-01 在大理学院基础医学院的云南省重点实验室和四川大学基础医学院与法医学院的干细胞研究中心完成.材料:6周龄健康SD大鼠,体质量120～130g.方法:以密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞,并传代扩增.采含体积分数为0.125的黄芪无血清L-DMEM培养液诱导分化为神经样细胞,观察细胞形态变化,以免疫组织化学染色方法检测分化细胞中巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶窒宋嵝缘鞍椎谋泶?主要观察指标:①诱导分化细胞的免疫组织化学鉴定.②RT-PCR方法半定量分析相关基因Ngn-1和Wnt-1基因在诱导过程中的表达.结果:经传代后,骨髓间充质干细胞呈纤维细胞样,有较强的增殖能力.经黄芪诱导后,细胞形态发生改变,巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白均阳性.Ngn-1和Wnt-1基因在黄芪诱导骨髓间充质干细胞过程中表达量升高.结论:骨髓间充质干细胞在黄芪诱导下可向神经样细胞分化.Ngn-1和Wnt-1基因在其分化过程中起正调控作用.     

小儿骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能

背景:国内报道人骨髓间充质干细胞多取材于成人细胞,小儿骨髓间充质干细胞的研究较少.目的:拟分离培养小儿的骨髓间充质干细胞,观察其生物学特性以及向成骨、成脂肪、成神经分化的潜能.设计:观察对比实验.单位:华中科技大学同济医学院.材料:实验于2006-03109在武汉同济医院骨科实验室完成,小儿骨髓间充质干细胞取自5～8岁因髋关节发育不良行骨盆截骨术的患儿,男1例,女2例,实验经过医院伦理委员会批准许可,并征得所有患儿家属知情同意.地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、甲基异丁酸黄嘌呤、胰岛素、吲哚醚辛、羟基丁酸苯甲醚均为Sigma公司产品,二甲基亚砜为Amersco公司产品.方法:经Percoll梯度分离接种获得小儿骨髓间充质细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态、排列分布情况.分别采用成骨细胞诱导剂(β-甘油磷酸钠,地塞米松,维生素C)、成脂肪细胞诱导液(地塞米松,甲基异丁酸黄嘌呤,牛胰岛素,吲哚美辛)及二甲摹亚砜和羟基丁酸苯甲醚无血清培养摹诱导剂干预细胞向成骨、脂肪、神经细胞分化,经免疫组织化学染色、PCR、免疫细胞染色方法检测成骨标志物(碱性磷酸酶、骨钙素mRNA、钙结节)、脂肪标志物(脂滴、PPAR Y-2mRNA)、以及类神经标志物(尼克氏体、神经烯醇化酶、神经丝蛋白).主要观察指标:①d,JL骨髓间充质细胞形态以及增殖情况.②成骨、脂肪及类神经标志物检测结果.结果:①小儿骨髓间充质细胞贴壁容易,细胞细长梭形,增殖能力强,融合后呈旋涡状分布.②骨髓间充质细胞分别经各诱导剂诱导后,细胞形态均发生相应的变化,用化学染色、PCR、免疫细胞染色等方法检测成骨标志物、脂肪标志物及类神经标志物有明显阳性表达.结论:小儿骨髓间充质细胞生长具有稳定增殖、传代的能力,具有成骨、成脂肪、成神经等多方向的定向分化潜能.     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的研究进展

学术背景:近几年采用胰岛细胞或胰腺移植治疗糖尿病取得一些疗效,但仍存在供体匮乏和免疫排斥两大难题.骨髓间充质干细胞在体外可诱导成为胰岛样细胞.目的:分析总结骨髓间充质细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化研究进展. 检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1997-08/2007-08的相关文献,检索词"mesenchymal stem cells,insulin secreting cell",并限定文章语言种类为English.同时计算机检索中国期刊全文数据库1997-08/2007-08的相关文献,检索词"骨髓间充质干细胞, 胰岛素分泌细胞",并限定文章语言种类为中文.共检索到108篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①文章所述内容应与骨髓间充质细胞体外诱导分化为胰岛样细胞密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:①重复性研究.②Meta分析.文献评价:文献的来源主要是通过对骨髓间充质细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化方面内容进行汇总分析.所选用的30篇文献中,2篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:①由于胰腺和神经系统具有相似的发育控制机制,目前认为神经生长因子可能是胰腺发育的关键信号.利用人骨髓间充质干细胞多向分化能力,用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子将其诱导成为nestin阳性细胞,该细胞在添加含有胰岛细胞赖以生存的条件培养液中为适宜微环境,将被进一步诱导为胰腺样细胞.②目前针对胰岛素样细胞的鉴定与功能学研究有以下几方面:细胞形态学观察是否有类似胰岛样细胞团的聚集;免疫组织化学检测诱导后细胞胰岛素、胰高血糖素和生长抑素的表达;用RT-PCR法对诱导后细胞的胰岛素及胰高血糖素基因表达测定;葡萄糖刺激的胰岛素释放试验来研究诱导后胰腺细胞的功能.结论:随着骨髓间充质干细胞在体外可诱导成胰岛样细胞技术的不断发展,为解决糖尿病细胞治疗所面临的问题提供一个新的方案.经过诱导分化所得到的胰岛样细胞,其胰岛素分泌量远小于正常胰岛细胞,因此目前急需解决在体外高效诱导且符合人生理的胰岛细胞,并将其安全移植入人体等问题.     

骨髓间充质干细胞和心血管疾病

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)能通过取代缺血坏死的心肌细胞,在损伤区域形成新生血管,修复损伤的细胞外基质,分泌各种细胞因子、细胞活素(旁分泌作用)等作用机制来治疗心血管疾病,MSCs将成为心血管疾病治疗最有前途的"种子"干细胞.     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子B1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达。结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96．97％的细胞表达CD44、13.72％的细胞表达CD45,第2代有99．11％的细胞表达CD44、8．54％的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。     

芒果苷对缺氧损伤骨髓间充质干细胞的保护作用

背景：研究表明骨髓间充质干细胞移植在临床治疗方面具有广阔的应用前景。然而,移植细胞的死亡限制了组织再生,寻找新的抗自由基和保护骨髓间充质干细胞的药物有着重要意义。目的：研究芒果苷对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤的保护作用。方法：采用氯化钴（CoCl 2）建立体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞缺氧损伤模型。将细胞分为正常对照组、氯化钴缺氧损伤组、氯化钴加芒果苷20,40,80,160μmol/L组。缺氧损伤12,24 h检测各组骨髓间充质干细胞培养上清液中超氧化物歧化酶、丙二醛、过氧化氢酶水平。缺氧损伤3,6,12,24 h检测各组骨髓间充质干细胞内活性氧变化。结果与结论：芒果苷能明显提高缺氧损伤的骨髓间充质干细胞的存活率,提高细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性,降低细胞内丙二醛、活性氧水平,有效保护缺氧损伤下的骨髓间充质干细胞。芒果苷具有较强的抗氧化能力及缺氧保护作用,可明显减轻骨髓间充质干细胞的氧化应激损伤。     

姜黄素调控大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:姜黄素能明显降低破骨细胞的骨重吸收,诱导破骨细胞凋亡,抑制破骨细胞形成。目的:观察不同浓度姜黄素对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代后采用成骨培养基进行成骨诱导,在诱导前3d于诱导培养基中分别加入0(对照),10,15μmol/L姜黄素。结果与结论:接种培养7d,倒置显微镜下可见分散的骨髓间充质干细胞小集落,集落细胞呈放射状生长。随培养时间延长,细胞集落增大,细胞形态为长梭形。加入成骨培养基7d后细胞形态逐渐由长梭形变为多角形,随成骨诱导时间延长形态变化更加明显。加入不同浓度姜黄素后骨髓间充质干细胞增殖无变化。姜黄素呈剂量依赖性促进骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性及Runx-2、血红素单加氧酶1的表达。提示姜黄素能有效促进大鼠骨髓间充质干细胞早期成骨分化,其机制可能与提高干细胞血红素单加氧酶1的表达有关。     

骨髓间充质干细胞诱导分化特征

骨髓间充质干细胞现阶段研究方向主要包括生物学特性、诱导分化和调控机制等内容，对其生物学特性和成骨成脂诱导方面研究比较成熟，在培养分化过程中展示出贴壁性、可塑性、异质性、自我更新能力、快速形成克隆能力、可移植性等生物学特征，贴壁法联合密度梯度离心法在骨髓间充质干细胞的分离、纯化过程中被广泛采用。而在神经诱导方面争议颇多，功能性神经元不仅要具有典型神经元的形态、特异性标记，还要求具有可兴奋性、能和其他神经元形成突触联系、产生突触电位等，所以对于骨髓间充质干细胞是否能诱导出真正具有功能的神经元存在很大分歧。此外，由于其调控机制还有很多未知因素，所以临床应用上仍存在许多安全性问题。     

细胞密度与骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:细胞种植密度是影响干细胞分化的因素之一,对于细胞种植密度在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用尚缺乏深入研究.目的:观察细胞种植密度对骨髓间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的影响.方法:采用贴壁培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代后将其按2×102,2×103,4×103,8×103,2×104,4×104/cm2种植于六孔板,每组均加入碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子+维甲酸诱导向神经元样细胞分化,并通过免疫组织化学染色鉴定,计算每组细胞出现神经元样细胞的比例,比较各组的分化率.结果与结论:各组骨髓间充质干细胞加入诱导剂后均出现神经元样细胞,Nestin、NSE、GFAP细胞化学染色呈阳性.不同种植密度组出现神经元样细胞比例不同,以8×103/cm2组神经元样细胞比例最高,且神经元样存活时间最长,达7 d.结果说明骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化与细胞接种密度有关,过高或过低细胞密度均不利分化.     

鼠骨髓间充质干细胞对缺氧/复氧心肌细胞的影响

目的:观察在体外培养条件下骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)对缺氧/复氧新生大鼠心肌细胞的保护作用.方法:无菌条件下分离、培养、传代Wistar大鼠MSC,细胞融合达90%时更换培养基培养24 h,收集细胞培养液作为MSC条件培养基;原代培养新生Wistar大鼠心肌细胞,先用5% CO2、10% H2、85% N2混合气造成细胞缺氧24 h,再给予95% O2 和 5% CO2混合气复氧2 h,建立缺氧/复氧模型.MSC 处理组于复氧时加入MSC 条件培养基,正常细胞作为对照组,分别于复氧后用MTT法、乳酸脱氢酶(lactated dehydrogenase)法测定各组心肌细胞活性的改变;RT-PCR观察细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达.结果: 与对照组比较,缺氧/复氧组细胞活力显著降低(P ＜ 0.01).与缺氧/复氧组比较,MSC处理组细胞活力明显增加(P ＜ 0.01).缺氧/复氧组抗凋亡基因Bcl-2的表达明显降低,促凋亡基因Bax的表达明显增加,而MSC条件培养基可以减少Bax基因的表达,提高Bcl-2/Bax值,与缺氧/复氧组比较差异具有显著性(P ＜ 0.01).结论:MSC对体外缺氧-复氧诱导的心肌细胞的凋亡有保护作用.     

骨髓间充质干细胞向软骨的诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞在体外不同环境及生物因子的作用下, 可以转化为软骨细胞,是目前软骨组织工程领域研究的重点.目的:对近年来细胞因子、应力刺激、三维空间结构在骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的作用作一综述.方法:应用计算机检索CNKI和Pubmed数据库中2001-01/2010-06关于骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的文章,在标题和摘要中以"骨髓间充质干细胞,软骨细胞,诱导分化"或"bone marrow mesenchymal stem cells,chondrocyte,differentiation"为检索词进行检索.选择文章内容与骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞有关者,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章.初检得到109篇文献,根据纳入标准选择关于骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的26篇文章进行综述.结果与结论:细胞因子、应力刺激、三维空间结构等因素影响骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,优化这些因素的条件,可以更容易分化出软骨细胞表型.随着骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的深入研究,这些因素的应用必将更为广泛.     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点

背景:黄芪提取物有较好的抗氧化、清除氧自由基的作用,加之骨髓间充质干细胞的多向分化潜能及其自体移植的优越性,可能为神经退行性疾病的治疗提供新的方式.目的:探讨黄芪诱导后大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点.设计:细胞学体外观察.材料:清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心.黄芪注射液批号060105,为大理药业有限公司产品.方法:全骨髓法体外分离培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代时,按4×108L-1密度接种于置有盖玻片的12孔板内,制备细胞爬片.盖玻片上细胞达80%～90%融合后全量换液,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基连续诱导6 d;对照组DMEM培养基中不加入黄芪注射液.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导前后骨髓间充质干细胞的形态变化,诱导后免疫细胞化学染色鉴定特异性标志物的表达.结果:原代培养的骨髓间充质干细胞多呈圆形,扩增至第4代后细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状,诱导后细胞形态发生改变,自胞体长出突起,随诱导时间延长,长出突起的细胞数量逐渐增多,部分突起末端呈分叉状,可见网络状连接.免疫细胞化学染色结果显示,诱导第3天巢蛋白阳性细胞、神经元特异性烯醇化酶阳性细胞和神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较多,诱导第6天微管相关蛋白2阳性细胞较多.结论:黄芪首先诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化,然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化,并能够使已分化细胞的进一步成熟、老化.     

糖皮质激素对骨髓间充质细胞分化的影响

背景:糖皮质激素引起的髓内脂肪蓄积是由机体脂肪代谢异常在髓内形成的脂肪沉淀,还是由于激素直接作用于骨髓间充质细胞使细胞发生了分化,以及具体生成的过程目前还没有定论.目的:观察不同浓度地塞米松对骨髓间充质细胞成脂分化的影响.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-01/2009-01在中国医科大学生物化学教研室完成.材料:3或4周龄SD大鼠80只,体质量(110±10)g,雌雄不拘.方法:分离培养大鼠骨髓间充质细胞,并进行传代,取第3代细胞作为实验标本.主要观察指标:①倒置显微镜下观察骨髓间充质细胞在地塞米松10-7 mol/L浓度和正常培养状态下3,7,14,21 d时的形态变化.②细胞碱性磷酸酶、Sundan Ⅲ染色后骨髓间充质细胞的形态变化.③酚试剂法测定碱性磷酸酶活性.④四甲基偶氮唑盐法检测地塞米松对细胞增殖的影响.结果:①原代细胞接种24 h后,培养瓶底即出现少许贴壁细胞,多呈纺锤形或梭形;随着培养时间延长,贴壁细胞明显增多,呈放射状排列.传代后细胞分布均匀,呈典型的成纤维细胞样.地塞米松刺激后,细胞由梭形变为多角形或不规则形,后期,随着浓度增大和作用时间延长,细胞团聚现象消失,很多贴壁的细胞悬浮、死亡.②在正常培养细胞中,没有或很少见到橘红色的脂肪颗粒着色,在含有地塞米松培养的细胞中,随着激素浓度增高和时间持续,细胞内Sundan Ⅲ着色的脂肪颗粒明显增加.⑨在21 d时,正常培养的细胞碱性磷酸酶活性值分别是10-8,10-7,10-6 mol/L地塞米松组的1.57倍,4.49倍和5.0倍.在7,14,21 d时,正常培养的细胞碱性磷酸酶分别是相应107 mol/L地塞米松组的2.93倍,3.80倍和4.39倍,差异具有显著性意义(P＜0.05).④高浓度地塞米松对细胞增殖活力的抑制效果明显.10-7 mol/L和10-6 mol/L与其他各组相比,差异具有显著性意义(P＜0.05).结论:大剂量地塞米松促进骨髓间充质细胞的脂肪生成,抑制成骨分化,并且随着浓度增高和作用时间延长,作用加强.     

茶黄素对兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞诱导分化的影响

目的:茶黄素是红茶中的主要成分,具有调节血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗心脑血管疾病等多种药理活性.以往茶黄素对人体内脂肪代谢的影响多数属于宏观分析,实验在细胞水平上探讨茶黄素对兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化的影响.方法:实验于2007-05/09在安徽医科大学附属省立医院中心实验室完成.①动物:清洁级4～8周龄家兔10只,由安徽医科大学动物试验中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:兔全身肝素化后麻醉状态下处死,取双侧股骨胫骨和肱骨,去除软组织,切除包括骺板在内的两侧骺端,采用全骨髓法分离培养骨髓基质干细胞,按2×108 L-1密度接种,当细胞生长至80%～90%融合时消化传代.取传至3代的细胞按1×105/cm2密度接种,加入含重组人胰岛素 10 mg/L、地塞米松10-6 mol/L、0.5 mmol/L IBMX的DMEM成脂诱导液培养2周.设立3组:脂肪对照组单纯放入成脂诱导液1 mL;茶黄素组向1 mL成脂诱导液中加入500μg/L茶黄素;空白对照组仅加入等量普通DMEM培养液.③实验评估:取第2代培养细胞绘制生长曲线;油红O染色对诱导的脂肪细胞进行鉴定,计算脂肪细胞转化率.结果:①细胞生长曲线:骨髓基质干细胞具有旺盛的增殖能力,培养1 d为细胞适应期,3 d后为对数增长期,8 d时进入平台期,之后细胞增殖迅速减慢,细胞数下降.②脂肪细胞油红O染色鉴定结果:脂肪细胞中的脂滴被染成橙红色,胞核为蓝色.脂肪对照组多数骨髓基质干细胞诱导为脂肪细胞,转化率为(64.8±4.8)%,茶黄素组仅为(32.0±3.4)%,空白对照组未见明显脂肪细胞形成.结论:茶黄素可明显抑制兔骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向的分化.