人FoxA1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

【摘要】 目的 构建叉头盒蛋白A1(Forkhead-boxA1,FoxA1)的重组慢病毒表达载体,为探究其功能和作用机制奠定基础。方法〓设计基因引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增出FoxA1的cDNA序列,然后将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经PCR、双酶切反应及DNA测序鉴定,将阳性重组FoxA1表达载体、pCMV-VSV-G 和pCMV-dR8.91包装质粒共转染到HEK-293T细胞进行病毒包装收集病毒浓缩液,然后再感染293T细胞,通过观察绿色荧光蛋白来计算病毒滴度,最后用病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞(HFFs),通过实时荧光定量PCR检测FoxA1 mRNA的表达水平。结果〓重组慢病毒表达载体FoxA1经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液,病毒感染人皮肤成纤维细胞后表达显著增强。结论〓成功构建了人FoxA1重组慢病毒载体,并可在HFFs内高效表达,为后续FoxA1的功能和机理研究奠定了实验基础。     

Lv-shRNA-Hsa-microRNA-691慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建Lv-shRNA-hsa-microRNA-691慢病毒表达载体。方法 PCR扩增pri-miR-691-2前体序列,克隆至plenti-GFP慢病毒表达载体;双酶切及测序鉴定正确后进行慢病毒包装与滴度检测。构建成功后感染人胰腺癌细胞Panc-1,48h后Real-time Q-PCR检测miR-691的表达。结果酶切、测序鉴定证明插入序列正确,测定病毒滴度为1×109TU/m L,病毒感染48h后的Panc-1胰腺癌细胞在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光,Real-time Q-PCR显示被感染细胞的miR-691表达量较未感染细胞显著增高。结论建立了高效稳定表达Lv-shRNA-hsa-miR-691的慢病毒转染系统。     

表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体.方法 根据大鼠Cdh1基因的核苷酸序列,合成目的基因片段并亚克隆到慢病毒表达载体pGC-FU的Age I酶切位点间,命名为pGC-FU-Cdh1.对pGC-FU-Cdh1进行PCR扩增及测序鉴定.将293T细胞按完全随机法分为实验组(每组3只)及对照组(每组3只),分别将pGC-FU-Cdh1及空质粒pGC-FU以脂质体法转染至293T细胞,倒置荧光显微镜观察后,Western blot法检测Cdh1-GFP的表达情况,慢病毒载体LV-Cdh1的包装浓缩及滴度测定. 结果 重组慢病毒表达载体pGC-FU-Cdh1经PCR扩增鉴定及测序鉴定均显示有特异性基因片断,证明大鼠Cdh1基因正向插入慢病毒表达载体pGC-FU中;转染293T细胞后,Western blot法检测到实验组有外源性融合蛋白Cdh1 -GFP的表达(每组3只),对照组无Cdh1-GFP的表达(n=0)(P=0.014);慢病毒载体LV-Cdh1包装浓缩后,Reahime PCR法测定滴度为2E+8 TU/ml. 结论 成功构建表达大鼠Cdh1基因的重组质粒pGC-FU-Cdh1,并包装为慢病毒,为进一步研究Cdh1功能及基因治疗奠定了基础.     

PIAS-NY稳定转染小鼠精母细胞株的构建与鉴定

目的:构建PIAS-NY基因慢病毒质粒,并将包装所得慢病毒感染小鼠精母细胞,获得稳定过表达PIAS-NY的细胞株。方法:应用PCR技术扩增目的基因,并将扩增产物插入慢病毒载体质粒pGC-FU上,对阳性克隆进行PCR筛选及测序鉴定。将重组质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,获得含慢病毒颗粒的细胞上清,用慢病毒感染小鼠精母细胞,并用Western印迹方法检测细胞中PIAS-NY蛋白的表达。结果:成功构建了pGC-FU-PIAS-NY慢病毒表达质粒,获得了稳定过表达PIAS-NY的小鼠精母细胞株。结论:PIAS-NY过表达慢病毒质粒及稳定转染小鼠精母细胞株的构建,为进一步体外研究PIAS-NY基因在精子发生中的功能奠定了基础。     

人肝细胞核因子4α重组慢病毒载体的构建与鉴定

【摘要】〓目的〓构建肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha, HNF4A)的过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究HNF4A的功能和作用机制奠定基础。方法〓利用PCR法扩增人类基因组DNA中HNF4A的cDNA序列,并将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro表达载体、pCMV-VSV-G 和pCMV-dR8.91三质粒共转染到HEK-293T细胞,收集上清,将获得的病毒悬液浓缩后梯度稀释后感染HEK-293T细胞,并利用绿色荧光蛋白检测病毒滴度。将重组慢病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞HFFs,并利用荧光定量PCR检测HNF-4A的表达。结果〓重组慢病毒表达载体PCDH-CMV-HNF4A-EF1a-GFP-puro酶切及测序鉴定证明载体构建成功,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液。病毒感染人皮肤成纤维细胞后HNF4A表达显著增强。结论〓通过优化载体构建方法成功构建人HNF4A的重组慢病毒载体并可在HFFs内显著过表达HNF4A,为HNF4A的研究提供更高效稳定的基因载体。     

ELL慢病毒表达载体的构建及其感染前列腺癌PC3细胞的研究

目的构建ELL基因的慢病毒表达质粒,探讨其感染人前列腺癌PC3细胞的可行性。方法将含有全长ELL的质粒和慢病毒表达载体经双酶切后连接,构建成重组慢病毒载体质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-ELL。对慢病毒载体质粒进行双酶切和测序鉴定后,制备包装病毒并转染人前列腺癌细胞系PC3。结果慢病毒载体质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-ELL的酶切和测序结果与预计的序列一致。慢病毒感染人前列腺癌PC3细胞后能稳定高表达ELL。结论成功构建了ELL的慢病毒表达载体,ELL可被成功转染入人前列腺癌细胞。     

慢病毒介导的KLF5转染对RKO细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建Kruppel-like factor 5(KLF5)慢病毒载体并转染人结肠癌RKO细胞中,观察KLF5对结肠癌细胞RKO生物学行为的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人小肠黏膜中扩增出KLF5基因编码区1374 bp的片段,随后将扩增KLF5片段插入慢病毒转移载体pCDH-CMV-KLF5 -Efl -copGFP,构建KLF5-pCDH-CMV-KLF5-EF1-copGFP.在脂质体介导下将构建成功的重组慢病毒转染人胚肾细胞株(293T)包装生产慢病毒,测定病毒滴度,感染结肠癌RKO细胞.RT-PCR和Western blot法分别检测KLF5 mRNA和蛋白的表达.随后将实验分为空白对照组和实验转染组进行实验.细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测转染前后RKO细胞增殖的变化以及Transwell实验检测转染前后细胞增殖和侵袭能力的变化.结果 成功合成KLF5-pCDH-CMV-KLF5-EF1 -copGFP并转染入RKO细胞中.RT-PCR以及Western blot结果提示与对照组比较,KLF5-pCDH-CMV-KLF5-EF1 -copGFP成功在RKO细胞中得到合成和表达.同时高表达的KLF5可以明显抑制RKO细胞的增殖(P＜0.05).另外KLF5可以明显抑制RKO细胞的迁移能力(50.26±2.17比25.12 ±2.27,t=17.66,P＜0.05)和侵袭能力(45.48±1.53比22.13 ±2.25,t=3.37,P＜0.05).结论 KLF5可以有效抑制结肠癌RKO细胞的增殖、迁移和侵袭.     

脂肪特异性蛋白27基因的慢病毒载体的构建及其在星状细胞中的表达

我们通过构建脂肪特异性蛋白27( Fsp27)基因的慢病毒载体,并感染活化态肝星状细胞(HSCs),为探讨该基因的抗纤维化作用奠定基础. 一、材料与方法 1.材料:293T及HSCs由温州医学院实验动物中心提供;病毒构建所需试剂分别购自Genechem公司、Promega公司及TaKaRa公司. 2.Fsp27重组表达载体的构建:设计Fsp27基因引物序列,以大鼠cDNA为模板进行聚合酶链反应( PCR)扩增.将PCR产物和载体连接后转化感受态大肠杆菌,对长出的克隆菌落进行PCR鉴定及测序分析. 3.慢病毒颗粒的包装和生产:将Fsp27慢病毒与293T细胞的混合培养.收集细胞上清进行病毒滴度测定.收集感染3d后的293T细胞.提取蛋白电泳鉴定.     

人碱性成纤维生长因子基因重组慢病毒载体的构建

目的 构建携带人碱性成纤维生长因子(bFGF)基因的重组慢病毒表达载体.方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法钓取人源性的bFGF和FGF4两个目的 基因片段,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU[含绿色荧光蛋白(GFP)]中,得到pGC FU-FGF4-bFGF,通过PCR、酶切、测序和对比验证bFGF后,通过Lipofectamine 2000的介导把pGC FU-FGF4-bFGF质粒和包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染至包装细胞293T,经同源重组产生重组慢病毒pGC FU-FGF4-bFGF,pGC FU-FGF4-bFGF在293T细胞内大量扩增,应用实时定量PCR法鉴定和测定滴度.结果 克隆得到500bp目的 bFGF全长基因,经过PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,bFGF基因成功克隆到慢病毒载体中,可实现bFGF基因的表达,且病毒滴度为2.0×109 TU/ml.结论 成功构建表达人bFGF基因的慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够高的病毒滴度,可作为后续基因治疗研究工作的基因转染工具.     

视黄醇类核内受体α基因慢病毒表达载体构建

目的 通过构建大鼠视黄醇类核内受体-α(RXR-α)基因慢病毒表达载体,获得可供转染的滴度.方法 大鼠RXR-α基因序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增,与经AgeI酶切后的pCC-FU-3FLAG载体连接产生慢病毒载体表达质粒pGC-fu-3flag-Rxra,转化DH5α,PCR筛选阳性克隆,片段长为411bp.测序并转入293T细胞Western blot鉴定,90 KDr处有特征条带.将pGC-fu-3flag-Rxra、pHelper 1.0、pHelper 2.0三质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,测病毒滴度,1.00E-04μl组和Control组的Ct值存在差异(2.775).结果 DNA测序及Western blot鉴定证实构建的大鼠RXR-α基因慢病毒表达载体pGC-fu-3flag-Rxra正确,浓缩慢病毒悬液滴度为2×108TU/ml.结论 成功构建携带大鼠RXR-α基因的重组慢病毒表达载体.     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的 构建人Wip1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响.方法 设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒pFU-GW-iRNA载体中.慢病毒包装转染HEK293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度;感染U251细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞,CCK-8法检测细胞的增殖,Western blot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达.结果 PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体,病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10~8～8×10~8 TU/ml.可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达,构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36.3%、32.9%、23.8%.稳定Wip1 RNA干扰后的U251细胞4 d后细胞增殖能力下降35.1%.结论 慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达,Wip1基因促进了U251细胞的增殖.     

PKCγ基因RNAi慢病毒载体的构建

目的 构建蛋白激酶Cγ(PKCγ)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的PKCT基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸序列(Oligo)DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCSIL-GFP载体[含U_6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接,转化DH5a大肠杆菌,挑选重组阳性克隆行PCR鉴定和DNA测序.用pGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,逐孔稀释滴度法测定病毒滴度.结果 PCR鉴定结果显示,以经双酶切后未插入片断的pGCSIL-GFP空载体(PCR产物为306 bp)为对照,重组细菌克隆的PCR产物为343 bp(插入片段为37 bp),鉴定结果与预期相符.测序结果显示,合成的PKCT基因shRNA寡核苷酸链序列插入正确.包装慢病毒,浓缩慢病毒悬液的滴度为1×10~9 TU/ml.结论 成功构建了PKCT基因shRNA慢病毒载体.     

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统.     

人膀胱癌bcl-2-siRNA慢病毒载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的 构建表达人膀胱癌bcl-2基因的小分子RNA(siRNA)的慢病毒载体并建立稳定转染细胞株.方法 根据GenBank提供的bcl-2 cDNA序列,设计3条针对bcl-2 siRNA序列,分别构建pSIH1-H1-copGFP重组质粒.筛选出最有效沉默靶基因的siRNA后,将携带目的 序列的慢病毒载体转染到293T细胞中,感染膀胱癌细胞株T24,建立稳定转染细胞株.结果 设计的针对bcl-2的序列中第3条的抑制效果最好,下调59.0%.以此目的 序列构建稳定转染细胞株,对bcl-2 mRNA抑制率达65.6%,对bcl-2蛋白的抑制率高达74.5%.结论 成功构建表达人膀胱癌bcl-2-siRNA的慢病毒载体,它能有效沉默bcl-2基因在膀胱癌细胞株T24中的表达并建立了稳定转染细胞株.

Abstract：

Objective To obtain small interfering RNA (siRNA) sequences that can stably block the expression of bcl-2 in the bladder cancer cells, construct the bcl-2-siRNA lentiviral vector and establish a stably transfected cell line. Methods According to genetic information, 3 siRNA targeting bcl-2 were designed. The corresponding pSIH1-H1-copGFP recombinant plasmids were constructed. After the most effective siRNA was achieved, the shuttle plasmid pSIH-bcl-2-siRNA with lentiviral packaging plasmid was mixed, and 293T cells were transfected. Virus solution was collected to infect T24 cells and a stably transfected cell line was established. Results The third siRNA sequence, located in bcl-2 1210-1228, showed the best gene silencing effect as 59. 0%. The lentiviral vector was constructed successfully and the inhibition ratio was 65. 6% for bcl-2 mRNA and 74. 5% for bcl-2 protein. Conclusion It is successful to obtain bcl-2-siRNA lentiviral vector that can stably block the expression of bcl-2 in the bladder cancer cell line T24 and establish a stably transfected cell line which provides foundation for further experimental studies on the function of bcl-2.     

microRNA-210基因修饰人脐静脉内皮细胞诱导血管形成

目的构建人microRNA-210(miR-210)慢病毒重组载体并转染人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells 12,HUVE-12),探讨其过表达对HUVE-12成血管的影响,为研究血管再生机制提供实验模型。方法构建pGCSIL-GFP-pre-miR-210重组质粒表达载体并转染HUVE-12,荧光显微镜观察GFP阳性表达细胞数及实时荧光定量PCR法检测miR-210表达变化;细胞分为空病毒对照组(LV-GFP对照组)和miR-210转染组(LV-miR-210-GFP组),流式细胞仪检测各组细胞ephrinA3表达变化;ELISA检测细胞培养上清中VEGF含量;将两组细胞分别接种于Matrigel观察血管形成能力。结果重组载体经酶切、测序鉴定正确,GFP表达强度在转染后48～72 h达峰值;实时荧光定量PCR检测结果显示:LV-miR-210-GFP组miR-210表达水平较LV-GFP对照组增加9.72倍(t=—11.10,P=0.00)。流式细胞仪检测结果显示LV-miR-210-GFP组ephrinA3阳性细胞率为12.52%±0.67%,明显较LV-GFP对照组(73.22%±1.45%)降低(t=—66.12,P=0.00);ELISA检测结果显示LV-miR-210-GFP组细胞上清中VEGF含量显著高于LV-GFP对照组([305.29±16.52)pg/mL vs.(42.52±3.11)pg/mL](t=—27.06,P=0.00);血管形成能力实验显示LV-miR-210-GFP组毛细血管管腔数为17.33±6.33,较LV-GFP对照组(6.33±2.33)显著增加(t=—2.83,P=0.04)。结论成功构建miR-210慢病毒重组载体,并能在HUVE-12中稳定表达,过表达miR-210能明显增强HUVE-12血管形成能力,为进一步研究miR-210调控血管新生的分子机制奠定了实验基础。     

c-myc基因慢病毒载体的构建及其意义

目的 构建携带c-myc基因野生型及T58A突变型的慢病毒载体.方法 应用聚合酶链反应(PCR)方法 扩增c-myc野生型及T58A突变型基因,利用Gateway技术构建携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体,经PCR及基因测序鉴定后,转染293FT包装细胞,产生相应慢病毒,测定其滴度.结果 PCR和测序证实,构建分别携带c-myc野生型及T58A突变型基因的慢病毒载体,并包装慢病毒,病毒滴度测定结果　分别为6.10 × 107、5.65×107 TU/ml.结论　成功构建含有c-myc野生型及T58A突变型基因的慢病毒载体并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒.

Abstract：

Objective To construct a lentiviral vector with c-myc gene, including wild type and mutation type. Methods The lentiviral vector with green fluorescent protein (GFP) was constructed by polymerase chain reaction (PCR) and gateway technology and identified by PCR and gene sequencing,then transfecte dinto the package cells 293FT by lipofectin to produce mature lentivirus. The virus titer was measured. Results According to PCR and gene sequencing, the myc-lentiviral vectors were successfully constructed with the virus titer being 6. 10 × 107 ( wild type) and 5.65 × 107 ( mutation type) TU/ml, respectively. Conclusion The myc-lentiviral vector was successfully constructed and efficient lentivirus particles were packaged.