Ultrastructural observations and preparation of cultured human epidermal melanocytes' samples

目的 探讨体外培养正常人表皮黑素细胞(melanocytes,MC)透射电镜制样方法及超微结构观察的作用.方法 采用M254 MC培养基及添加剂HMGS培养和纯化人表皮MC;分别采用常规制样方法和以PET聚酯薄膜为培养细胞的支持物制备透射电镜样本.结果 人表皮MC透射电镜观察发现,常规制样标本可观察人表皮MC及其树状突起横切面的超微结构.PET聚酯薄膜作为培养MC支持物的样本可观察人表皮MC和树状突起的完整超微结构及树状突起的纵切面超微结构.结论 PET聚酯薄膜可作为人表皮MC体外培养良好的支持材料.应用不同样本制备方法可以观察MC的超微结构,使用PET聚酯薄膜作为细胞支持物制备的标本更利于MC黑素体代谢和转移的观察.     

人体各部位皮肤黑素细胞的分布及超微结构观察

对３６个不同部位正常皮肤表皮中黑素细胞的数量、形态及其超微结构进行了观察分析。结果表明：黑素细胞数量存在较大的个体差异，且部位不同，其分布数量也显著不同，即面颈部及上肢等暴露部位皮肤中黑素细胞数量显著高于躯干及十肢等暴露较少部位皮肤中的含量，部位不同，其黑素细胞的形态结构也略有差异。     

异欧前胡素抑制人表皮黑素细胞c-Kit蛋白的表达

目的探索异欧前胡素对体外人表皮黑素细胞c-kit蛋白表达的作用。方法体外分离、纯化培养人表皮黑素细胞,随机分为1组(对照组)、2组(10 nmol/L SCF组)、3组(25μmol/L异欧前胡素组)和4组(25μmol/L异欧前胡素+10nmol/L SCF组),各组黑素细胞按设定条件培养48 h,倒置显微镜观察黑素细胞的形态,免疫荧光显微镜观察黑素细胞的干细胞因子受体c-Kit蛋白表达和分布,NaOH裂解法测定黑素细胞黑素的含量。结果与1组比较,2组黑素细胞胞体增大,3组黑素细胞胞体变小,树状突起变长,4组黑素细胞胞体小于2组。免疫荧光显微镜观察可见1组黑素细胞c-kit蛋白表达呈红色荧光,分布于胞膜,2组黑素细胞c-Kit蛋白由于SCF诱导而表达增强,3组、4组黑素细胞c-Kit蛋白因异欧前胡素的抑制而表达减弱,各组黑素细胞c-Kit蛋白表达的结果与1组比较,差异有统计学意义(P0.01)。黑素含量检测结果表明,异欧前胡素对SCF诱导的黑素细胞黑素的合成有抑制作用,2组、3组、4组与1组之间黑素含量的差异、4组与2组之间黑素含量的差异均具有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论 25μmol/L异欧前胡素可抑制体外培养人表皮黑素细胞c-Kit蛋白的表达,调节SCF/c-Kit信号传导而降低黑素细胞的黑素含量。     

表皮细胞体外培养及临床应用

用手术切除阴茎包皮，制成单细胞悬液，经体外培养和传代培养，达到扩大增殖面积目的。将培养的单层表皮细胞薄膜，移植１００例深二度烧伤创面及肉芽创面，（最大移植面积３００ｃｍ２，最小面积２８ｃｍ２）均获得满意效果。因此，用阴茎包皮作为培养皮肤的细胞来源，具有实用价值和发展前景。     

人胚胎肝细胞的体外培养及表型观察

目的观察体外培养的人胚胎肝细胞的特性。方法采用胰酶分步消化法体外分离人胚胎肝细胞,在培养的不同代数,收集培养上清液测定甲胎蛋白、白蛋白及5种特异性酶(ALT、AST、GGT、ALP、LDH)的分泌量,用免疫组化法测定细胞内细胞色素C的表达情况。观察诱导分化剂丁酸钠对该细胞的作用效果。结果体外分离培养的肝细胞在DMEM培养基中呈单层多边形上皮样生长,常规传代可维持约5个半月(30代),在传代过程中具有分泌白蛋白及5种特异性酶的生理功能。结论建立的人胚胎肝细胞系,保持了肝细胞的表型及分泌多种特异性酶。     

大鼠牙髓细胞的分离培养及超微结构观察

目的 探讨牙髓细胞的培养方法和生长状况,观察其形态结构特征,为进一步研究牙齿的发育提供实验基础.方法 采用胶原酶消化分离的方法分离大鼠的牙髓细胞并在DMEM培养液中培养,运用透射和扫描电镜技术观察细胞的形态结构特征.结果 培养的牙髓细胞呈梭形,细胞生长状况良好,细胞器发育正常,并且有细胞增殖和分裂能力.结论 利用酶消化分离的方法分离培养的牙髓细胞,能够保持其生活状态及增殖分裂能力.     

人泪腺上皮细胞的体外培养及鉴定

目的　探讨人泪腺上皮细胞原代体外培养、鉴定、冻存和复苏的方法。方法　应用组织块培养法和混合消化液培养法对健康猝死成年人泪腺上皮细胞进行体外原代培养 ,应用免疫组织化学染色方法对培养有第 2代上皮细胞进行Pan keratin蛋白染色 ,以进行鉴定 ,取第 2、4代细胞进行冻存 ,1个月后取出复苏。结果　组织块培养法和混合消化液培养法均可获得较纯的泪腺上皮细胞 ,以组织块培养法接种的细胞早期生长较快 ,但第一代以后两种方法所获得的细胞生长无明显差别。两种方法所获取的泪腺上皮均为贴壁生长 ,未能形成生理状态下泪腺的囊腔结构 ,亦未见分泌小泡的形成。培养的泪腺上皮免疫组化染色Pan keratin蛋白染色阳性。经冻存和复苏 ,细胞保持良好活性。结论　组织块培养法和混合消化液培养法均可获得较纯的泪腺上皮细胞 ,但不能保持其泪腺束腔结构     

体外培养人睾丸组织睾酮分泌观察

睾丸各种细胞体外培养已成为研究睾丸功能活动的重要手段，目前已有大量报道。但单一细胞培养不足以反映多种细胞相互作用的整体功能变化，而皋丸组织体外培养则更接近睾丸生理状态，国外在这方面的文献寥寥无几，国内则尚来见类似研究报告。我们用4例取自人体的睾丸组织进行了为期2周的培养观察，并对其分泌的睾酮进行检测，现报告如下。     

人胎脑神经干细胞的体外培养

目的从人胎脑纹状体中分离培养并鉴定神经干细胞。方法采用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养和单细胞克隆技术,从36周自愿水囊引产人胎脑纹状体中分离出神经干细胞,并观察神经干细胞体外培养、传代、分化潜能。结果从36周人胎脑纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,呈Nestin免疫反应阳性细胞;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用;36周人胎脑纹状体仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

体外培养不同代次人皮肤成纤维细胞超微结构的研究

目的观察正常人皮肤成纤维细胞体外培养过程中超微结构的改变。方法将下2人二倍体成纤维细胞进行连续传代培养,以不同代次的细胞为实验对象,通过倒置相差普微镜与透射电镜对各代细胞进行观察。结果45代以内的细胞生长较迅速,45代后的细胞生长逐渐缓慢,65代细胞几乎无增殖趋势。40代以内细胞的超微结构基本正常,41~65代细胞出现核膜内折,细胞核/浆比例减小,细胞表面突起和微绒毛减少。结论40代以内成纤维细胞适合做组织工程的种子细胞。     

人羊膜上皮细胞的体外培养及标志分子的检测分析

目的进行人羊膜上皮细胞(HAEC)的体外培养,观察其生物学特性,检测其分子特征。方法取剖宫产术后人羊膜,应用酶消化法获得HAEC,倒置显微镜下观察细胞生长变化;CCK-8法检测HAEC的生长曲线;Giemsa染色观察HAEC的克隆形成率;流式细胞术检测HAEC的细胞周期;取第2代HAEC,流式细胞术检测其CD29、CD31、CD44、CD59、CD105、CD117、CD133、HLA-DR的表达。免疫荧光法检测其CD9、上皮性钙黏素(E-cadherin)、足糖萼素样蛋白(PODXL)、阶段特异性胚胎表面抗原4(SSEA-4)、性别决定区Y相关因子2蛋白(SOX2)、SSEA-1、Nanog蛋白、八聚体结合蛋白3/4(Oct-3/4)的表达情况。结果酶消化法可以获得较纯的HAEC,细胞呈贴壁生长,呈多角形,核呈圆形。细胞在贴壁后第3天进入指数生长期。细胞周期分析显示66%处于G0/G1期,S期细胞占31.69%,G2/M期细胞占2.31%。HAEC的克隆形成率为(9.33±2.00)%。流式细胞仪检测显示HAEC阳性表达CD44、CD29、CD105、CD59,不表达CD31、CD117、CD133、HLA-DR。免疫荧光法检测显示HAEC表达胚胎干细胞相关分子CD9、E-cadherin、PODXL、SSEA-4、SOX2、SSEA-1、Nanog、Oct-3/4。结论HAEC可以在体外培养生长并在一定时期内保持其增殖活性;HAEC表达胚胎干细胞相关的表面标志分子。     

兔抗B16黑素细胞多克隆抗体的制备及对黑素细胞增殖的影响

目的:制备兔抗B16黑素细胞多克隆抗体,研究其对黑素细胞增殖的影响。方法:①用B16黑素细胞颗粒抗原免疫家兔得到兔抗B16黑素细胞多克隆抗体;试管凝集法检测抗血清效价;G蛋白亲和层析纯化抗血清;②SDS-PAGE检测纯化抗体分子量大小;MTT法检测纯化抗体IgG对B16黑素细胞增殖的影响。结果:兔抗B16黑素细胞抗血清效价高达1:1280;亲和层析纯化抗血清获得的免疫球蛋白IgG,经SDS-PAGE电泳显示重链分子量大小约为66.2kD;MTT比色法显示IgG对黑素细胞增殖有抑制作用,与非IgG和未纯化血清差异显著。结论:成功制备并鉴定了高效价的兔抗B16黑素细胞多克隆抗体,纯化后所获得的高纯度IgG,对B16黑素细胞增殖具有抑制作用,为进一步研究此抗体对黑素细胞生长及色素代谢的影响,以及色素减退性疾病白癜风的发病机制奠定了基础。     

腺苷预处理培养大鼠心肌细胞后酶活性变化和超微结构观察

目的 :应用组化方法和透射电镜 ,观察腺苷预处理培养大鼠心肌细胞琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶及Ca2 +,Mg2 +依赖性ATP酶活性细胞超微结构的变化。方法 :取SD大鼠乳鼠心室肌细胞在无菌状态下 ,用DMEM常规培养 5天后分四组 :正常对照组、拟缺血再灌注组、拟缺血预处理组、腺苷预处理组 ,用组化方法检测心肌酶活性 ;以透射电镜观察细胞形态结构变化。结果 :在缺血预处理组和腺苷预处理组琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、Ca2 +,Mg2 +依赖性ATP酶活性均高于拟缺血再灌注组 ,且细胞结构保存良好 ;缺血预处理组、腺苷预处理组与正常对照组无显著性差异。结论 :腺苷预处理对缺血再灌注心肌细胞具有类似缺血预处理的保护作用     

表皮干细胞的分离、培养及生物学特性

为了分离、鉴定表皮干细胞 ,先后研究了integrinβ1 ,integrinα6 ,P6 3,角蛋白K19,cateninγ等干细胞的特异性分子标志 ,但尚无完全统一的结论。目前认为KSC主要分布于毛囊的膨大部分及真皮乳头尖上或位于网状嵴的顶部。为了使KSC在体外仍保持干细胞特性 ,常用的培养条件为J2 3T3加FAD加HICE加FCS。表皮干细胞在细胞形态、动力学特征、对细胞外基质的粘附特性、分化潜能、克隆形成能力等方面都有其独特的生物学特性。表皮干细胞在烧伤、创伤等大面积皮肤缺损的治疗以及皮肤疾病的细胞疗法、基因治疗等方面有很好的应用前景     

人脐血间充质干细胞体外分离培养及基因载体特性研究

目的证实脐血中含有间充质干细胞,探讨其体外分离、培养条件,并进行生物学特性和表面抗原的鉴定,初步探索间充质干细胞作为基因治疗的载体携带目的基因的可能性及方法。方法无菌条件下取正常足月剖宫产的脐血分离、培养和纯化,获得间充质干细胞;对获得的间充质干细胞进行形态学观察;绘制生长曲线,分析间充质干细胞的增殖情况;用流式细胞仪检测间充质干细胞表面抗原的表达情况。采用脂质体转染法将pDNA316-IRES-EGFP质粒转入间充质干细胞中,观察绿色荧光的表达以及转染后细胞生长情况。结果自脐血中成功分离获得间充质干细胞,可传代培养,经表面标志检测,表达CD29、CD44、CD105,不表达CD45和HLA-DR。质粒pDNA316-IRES-EGFP通过脂质体介导转染间充质干细胞后,荧光显微镜下观察到报告基因EGFP的表达。转染后的细胞生长受到一定影响。结论人脐血来源的间充质干细胞能在体外分离、培养、扩增,并且具有和骨髓源间充质干细胞类似的生物形态和抗原表型。EGFP基因可被成功转入间充质干细胞中并获表达。转基因间充质干细胞用于基因治疗的持久性和有效性仍需进一步研究。     

人前软骨干细胞体外分离培养及鉴定的实验研究

目的探讨体外分离、培养人前软骨干细胞（PSCs）的可行性，分析其表型特点，为相关的实验研究奠定基础。方法采用酶消化法从流产胎儿干骺端中收集细胞，用免疫磁性分选技术分离出前软骨干细胞，体外扩增培养，用流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、RT-PCR等方法鉴定纯化后的PSCs。结果从流产胎儿干骺端中成功培养出人前软骨干细胞，细胞表面表达成纤维生长因子受体-3（FGFR-3）标记物，细胞生长迅速。结论在体外培养条件下可以从流产胎儿干骺端中分离培养出较高丰度的前软骨干细胞。     

体外培养人视网膜微血管内皮细胞屏障功能的研究

目的： 研究原代培养的人视网膜微血管内皮细胞屏障功能。方法: 对人视网膜微血管内皮细胞进行原代培养并鉴定,第4代细胞接种于Polyester(PET)膜上,不同时点对滤膜表面行显微镜观察,通过紧密连接相关蛋白occludin的表达,间接反映细胞之间紧密连接的形成,应用共聚焦免疫显微镜观察2、3、4周occludin表达的变化;跨膜电阻（TER）检测屏障的稳定性,并通过测量正常培养条件和5 μg/L的血管内皮生长因子（VEGF）干预下辣根过氧化物酶(HRP)通透性的改变反映屏障特性。结果: 成功培养了人视网膜微血管内皮细胞,纯度可达95.8%。细胞接种1周后融合为单层,接种后2、3、4周细胞密度无明显变化,细胞接触紧密,呈单层生长,可见occludin在细胞相邻边界规则的表达;occludin在2、3、4周,在细胞内的分布逐渐移向相邻细胞交界处;2周时视网膜微血管内皮细胞跨上皮细胞电阻达（120.62±3.97）Ω/cm2,2、3、4周差异无显著（P>0.05）;单层细胞的通透性检测结果显示,HRP从滤膜上方到达下方随时间延长呈线性增加,且在VEGF的干预下,各时点通透率明显增加（P<0.05）。结论: 利用体外培养的人原代视网膜微血管内皮细胞建立单层细胞具有典型的屏障功能特性,可作为体外研究血视网膜内屏障的有用模型。     

体外培养小鼠骨髓树突状细胞的扩增、鉴定及形态学观察

目的建立体外培养和扩增树突状细胞(dendritic cell-DC)的方法,并进行形态学观察。方法在无菌条件下提取BALB/c小鼠骨髓细胞,分离单个核细胞,以小鼠重组粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL-4)协同诱导下培养,免疫组织化学染色、光镜和电镜下观察树突状细胞的形态。结果体外培养2周后小鼠树突状细胞可达70%~80%,光镜下可见典型的树突状细胞形态,S-100蛋白染色均呈阳性。电镜下,培养的细胞具有典型树突状细胞的形态特征,细胞功能活跃。结论体外大量培养和扩增小鼠骨髓树突状细胞,具有典型的树突状细胞的形态,为研究树突状细胞的功能和表型以及抗肿瘤作用提供体外实验材料。     

培养的人胚心肌细胞超微结构观察

本文报告5例4个月人胚心肌细胞在培养前、胰蛋白酶消化后、培养1、2、3、4和5日的超微结构变化。(1)未培养前的4个月人胚心肌细胞浆较疏松,富含糖原和核糖核蛋白体。细胞核位在中央。肌原纤维较少,一般出现胞浆周围,可见Z线等。线粒体数量较少,嵴发育差。可见到由桥粒、缝隙连接和中间连接组成的闰盘。(2)胰蛋白酶消化对心肌细胞的损伤是可逆的,24小时后恢复。(3)培养1、2、和3日的人胚心肌细胞和培养前的心肌细胞类似,未见反分化情况。(4)培养4和5日的人胚心肌细胞有的出现肌节崩坏、Z线变粗、线粒体肿胀等变化。有的心肌细胞结构基本正常。(5)据我们观察,胞浆内丰富的糖原和核糖核蛋白体,不仅仅是培养心肌细胞的特点,乃胚胎心肌细胞的特点。