简便的造血干细胞的非程控-80℃保存

目的尝试一种新的低温保存方法。方法将７例将行自体外周血干细胞移植患者的外周血干细胞浓集液和１９例小样本骨髓分别与改进后的细胞冷冻保护液混合,不经程控降温而直接将分装后的混悬液保存在－８０℃。在１周、１月、３月时取出,４０℃水浴解冻,检测细胞回收率和锥虫蓝拒染率。结果１周、１月、３月后均有较好的细胞回收率和存活率,且无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。７例患者输注经保存后的干细胞浓集液后也很快获得造血重建。结论改进后的冷冻保护液具有良好的保护作用。该冷冻技术是一种简便而安全的造血干细胞保存方法。     

简便的造血干细胞的非程控—80℃保存

目的 尝试一种新的低温保存方法,方法 将７例将行自体外周血干细胞移植患者的外周血干细胞浓集液和１９例小样本骨髓分别与改进后的细胞冷冻保护液混合,不经程控降温而直接将分装后的混恶液保存在－８０℃,在１周,１月,３月时取出,４０℃水溶解冻,检测细胞回收率和锥虫蓝柜染率,结果 １周,１月,３月后均有较好的细胞回收率和存活率,且无显著性差异（Ｐ〉０．０５）,７例患者输注经保存后的干细胞浓集液后也很快获得检     

-80℃直接冷冻保存造血干细胞移植治疗恶性血液病

:[目的]探讨 -80℃直接冷冻保存自体造血干细胞移植(APBSCT)治疗恶性血液病的疗效。[方法]ABSCT5例 ,移植前采用粒细胞集落刺激因子(G CSF)动员外周血干细胞(PBSC) ,分离后 ,将采集的PBSC分袋直接置于 -80℃冰箱冷冻保存。[结果]PBSC短期冻存后检测回收率和台盼蓝拒染率均在80%以上 ;接受移植的5例患者均获成功 ,并持续缓解(CCR) ,中位CCR时间为18(5～31)个月 ,无复发。[结论] -80℃直接冷冻短期保存PBSC具有良好效果 ;具有简单、方便、费用低等优点 ;ABSCT造血重建快并发症少 ,值得进一步推广     

程控冷冻对造血干细胞及淋巴细胞不同亚群的影响

外周血造血干细胞移植联合大剂量化疗已成为目前某些恶性肿瘤根治性治疗手段,而干细胞体外冷冻技术为其关键之一。目前国内外有关超低温冷冻对造血干细胞及不同淋巴结亚群存活的影响是否相同的报道少见。本研究采用程控降温系统将从外周血采集的单个核细胞(PBMC）逐步降温至－80℃并保存于－196℃液氮中,复苏后对细胞活性进行评价。1 材料与方法34例实体瘤患者中,乳腺癌15例,恶性淋巴瘤14例,卵巢癌3例,生殖细胞肿瘤1例,肺癌1例。年龄30～55岁。使用美国百特公司血细胞分离机(CS－3000Plus）采集PBMC。每份样本的冻存体积为60ml…     

-80℃冷冻保存人体外周造血干细胞技术

骨髓移植已成为治疗恶性血液病及实体瘤等疾病的有效手段，但传统的造血干细胞体外保存方法（程控降温／液氮贮存）昂贵、费时、技术要求高。而采用简化的液态（４℃）保存方法，虽简便易行，但保存时间有限，质量不易控制［１］。我室采用－８０℃冷冻保存外周血造血干细胞效果满意。现介绍如下。材料与方法一、研究对象１．自体干细胞组：７例急性白血病第１次缓解患者。年龄１４～５７岁，中位数３６岁。均为女性。每例冻存体积３００ｍｌ。实体瘤３例。年龄１６～３５岁，中位数２５岁。２男，１女。２例冻存３００ｍｌ，１例冻存２５０…     

外周血干细胞冻存的探讨

目的　对冻存外周血干细胞所用的冻存液配方 ,冻存温度 ,存放时间等作一探讨。方法　用血细胞分离机采集经化疗药物及G CSF联合动员的肿瘤患者外周血干细胞 ,用 10 %DMSO 自体血浆或 5 %DMSO 6%HES 4%人血清白蛋白作冷冻保护剂 ,分别于液氮中和 -80℃低温冰箱中冻存 ,不同时间复苏 ,检测细胞活性 ,CD3 4阳性比率 ,及CFU GM数 ,分析冻存效果。结果　冻存半年 ,液氮和 -80℃对于干细胞的冻存无明显影响 ,用 10 %DMSO 自体血浆作冻存剂 ,于 -80℃低温冰箱保存的细胞 ,活力达 ( 95 .7 /-5 .84) % ,单个核细胞回收率 ( 92 .2 5 /-9.3 2 ) % ,CD3 4阳性细胞回收率 ( 71.73 /-2 7.0 3 ) % ,CFU -GM回收率 ( 77.89 /-12 .3 1) %。 9例患者行自体外周血干细胞移植 ,平均CD3 4阳性细胞回输量为每公斤体重 1.46× 10 7,CFU GM为每公斤体重 3 .85× 10 5,回输后患者平均 17天恢复中性粒细胞 2 .0 g·l-1以上 ,恢复血小板 5 0 g·l-1以上。结论　应用经 -80℃低温冻存的 10 %DMSO 自体血浆冻存外周血干细胞进行自体移植是简单可行的。     

不同冷冻保护剂对外周血干细胞保存的研究

目的:探索冻存外周血干细胞(peripheralbloodstemcell,PBSC)的最佳冷冻保护剂组合和最大细胞浓度。方法:将冷冻保护剂二甲基亚砜(dimethylsulfoxideDMSO)、羟乙基淀粉(hydroxyethylstarchHES)、人血清白蛋白(humanserumalbrinALb)及自体血浆(autoplasma)按不同比例组成3组冷冻保护剂,A组:5%DMSO+6%HES+4%ALb;B组:5%DMSO+6%HES+autoPLASMA;C组:5%DMSO+4%Alb。冻存PBSC的细胞浓度分别为1×108/ml、2×108/ml和4×108/ml3个梯度。比较3组不同冷冻保护剂对不同细胞浓度的PBSC的冻存效果。进行冻存前后粒单系集落形成单位集落形成能力(colonyformingunitGranulocytemacrophage和爆式红系集落形成单位CFUGM;burstformingUniterythroid,BFUE)、CD34+CD38-细胞的测定,及复苏后细胞拒染率测定。数据处理用统计学区组方差分析。结果:3组不同冷冻保护剂组合中以B组的CFUGM,BFUE回收率最高,在细胞浓度为1×108/ml的回收率分别为78.7±9.8%和69.8±14.1%;A组与C组的CFUGM回收率分别为68.3±6.2%和65.8±7.2%,BFUE回收率分别为63.4±9.7%和60.4±10.6%,B组与A组、C组方差分析F=56.7,0.01相似文献   

4 500份脐带血造血干细胞保存研究

目的:制备和保存满足临床造血干细胞移植要求的脐带血造血干细胞.方法:按标准操作规程(sOP)进行脐带血的采集、分离、冷冻保存和检测.结果:在采集的6 232份脐带血中,采集的净血量、TNC、CD34 细胞百分率和CFU-C产率均值分别为90.7±22.2ml,10.5±3.4×108,0.24±0.15%,78.9±44.14/105NC.已保存符合标准的脐带血4 500份;分离后TNC回收率超过80%,而CD34 细胞、CFU-C回收率则超过90%,细胞活率无明显改变;冻存融化后细胞回收率80%～110%,细胞活率＞90%.在接受569例无血缘关系患者查询中,93%患者可查找到≥4个HLA-A,B和DRB1位点相合的脐带血.结论:可为临床造血干细胞移植提供合格的脐带血造血干细胞.     

外周血干细胞冻存夹的改良及临床应用

外周血干细胞移植(peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT)在血液病和实体瘤的治疗中得到了广泛的应用,干细胞移植过程中,干细胞的冻存是保证移植成功的重要环节.直接-80℃冰箱冻存外周血干细胞是一种简便、实用、安全、可靠、成本低的外周血干细胞保存方法,在外周血干细胞移植中已得到广泛应用[1].干细胞放入-80℃冰箱前,需用冻存夹固定干细胞冻存袋,以往选择有机玻璃板作冻存夹,使用中有诸多不便,我们对冻存夹进行了改良,形成了具有经济实惠,方便实用,取材容易,制作简单等优点的改良新型冻存夹,使用后效果满意,现介绍如下.     

—80℃直接冷冻保存造血干细胞移植治疗恶性血液病

「目的」探讨－８０℃直接冷冻保存自体造血干细胞移植（ＡＰＢＳＣＴ）治疗恶性血液病的疗效。「方法」ＡＢＳＣＴ５例，移植前采用粒细胞集落刺激因子９Ｇ－ＣＳＦ）－动员外周血干细胞（ＰＢＳＣ０，分离后，将采集的ＰＢＳＣ分袋直接置于－８０℃冰箱冷冻保存。「结果」ＰＢＳＣ短期冻存后检测回收率和台盼蓝拒染率均在８０％以上；接受移植的５例患者均获成功，并持续缓 位ＣＣＲ时间为１８（５￣３１）个月，无复发。「结论」     

自体外周血造血干细胞(APBSC)动员采集及冻存的研究

目的评价自体外周血造血干细胞(APBSC)的动员、采集及冻存方法。方法18例病例中，恶性淋巴瘤16例(NHL14例，HD2例)，睾丸肿瘤2例。病人行诱导化疗完全缓解后，采用大剂量联合化疗加小剂量粒细胞集落刺激因子(G—CSF)进行外周造血干细胞动员。用CS-3000，Plus血细胞分离机采集外周血造血干细胞，将分离的单个核细胞(MNC)经程序降温仪降至-80℃后，冻存-196℃液氮。冷冻前及解冻后分别行MNC计数和粒单系祖细胞集落(CFU—GM)培养。结果动员后外周血WBC及MNC总数明显增加，与动员前比较，差异有显著性。冷冻前后，MNC计数，CFU—GM集落数无明显差异。结论大剂量联合化疗加小剂量G—CSF动员方案是安全有效的。冷冻保存APBSC及复苏过程对细胞损伤较小，值得推广使用。     

外周血干细胞CD+34/CD-38亚群与集落形成能力的相关性分析

目的探讨外周血干细胞亚群CD34+/CD38-与CFU-GM,BFU-E的相关性及其影响因素.方法应用流式细胞仪测定外周血干细胞冻存前后的CD34+及CD34+/CD38-,对冻存前后的PBSC进行CFU-GM,BFU-E测定.对数据进行对比分析及相关性分析.结果冻存后较冻存前集落产率明显降低(P＜0.05),而冻存1个月与3个月的集落产率差异无显著性(P＞0.05).冻存前后CD34+/CD38-百分率与CFU-GM、BFU-E的数目相关性分析显示二者均存在显著相关性.结论外周血干细胞CD34+/CD38-百分率与CFU-GM,BFU-E集落产率之间存在显著相关性,二者可作为测定PBSC质与量的互补指标.冷冻保存时间对PBSC的膜分子抗原无明显影响.冷冻保存减少了CFU-GM,BFU-E的产率,但冻存1个月与3个月对PBSC的集落产率影响不明显.     

冻存后人脐血DC介导的食管癌细胞瘤苗实验研究

目的：探讨杂交瘤技术制备脐血树突状细胞（DC）和食管癌细胞的融合瘤苗在低温冻存后的生物学特性及特异性CTL活性。方法：分离脐血CD34^＋干细胞诱导扩增为成熟DC，与EC109细胞经聚乙二醇（PEG）法融合；免疫磁珠法筛选EC109-DC；鉴定瘤苗表型；-80℃低温冰箱冻存融合细胞EC109-DC，3周后融冻；观察融冻瘤苗表型及致瘤性；MTT法测定瘤苗诱导淋巴细胞增殖能力及体外特异性免疫应答能力。结果：融冻后疫苗体外半悬浮生长；同时高表达FR和CD80；融冻后瘤苗接种小鼠体内未见肿瘤形成；未冻存和冻存后融合疫苗EC109-DC活化的T淋巴细胞，可产生针对EC109细胞的特异性杀伤作用。结论：冻存未破坏融合疫苗的完整性；融冻后瘤苗无体内致瘤性，安全可靠；-80℃低温冰箱短期冻存对EC109-DC融合疫苗生物学特性及特异的CTL活性无明显影响，可望为DC疫苗提供简单可行的保存方法。     

ERCC1在鼻咽癌组织中的表达及其与顺铂化疗敏感性的关系

目的: 用自制的改良细胞冻存液冻存树突状细胞（dendritic cells,DCs）,观察冻存复苏后DCs的细胞存活率及体外诱导CIK(cytokine induced killer cell)对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：从外周血分离、培养获得DCs,分别用3种冻存液冻存:（1）含10%二甲基亚砜(DMSO)、20%牛血清的RPMI 1640培养液;（2）日本ZENOAQ公司的Cellbanker细胞冻存液;（3）自制细胞冻存液（含DMSO、羟乙基淀粉及细胞稳定剂）。每组DCs分6管,于-80 ℃和-196 ℃各冻存3管,分别于冻存后第30、60和180 d复苏,用锥虫蓝染色法测定细胞存活率,用MTT法检测冻存复苏后DCs活化的CIK对K562细胞的杀伤活性。结果：每组3种冻存液冻存的DCs随着冻存时间的延长,冻存复苏DCs的存活率和活性均有轻度下降,但经统计学分析3种冻存液的冻存效果无明显差别。结论：自制的改良细胞冻存液能够替代传统冻存液和进口冻存液用于DCs的冻存,有良好的推广前景     

一种冻存细胞新方法的建立

目的为寻找一个对贴壁生长细胞的短时间冻存方法,便于工作中以十分便捷的方式随时冻存和复苏该细胞.方法应用含有二甲基亚砜的常规冻存液平铺于贴壁细胞的表层,4℃降温使二甲基亚砜充分进入细胞内,之后-80℃冻存的方法对AZGY、Anip-973、SPC-A1、MKN-45、HePG2、和BGC-823六株人腺癌细胞进行了一个月和六个月的冻存与复苏的尝试.结果六株人腺癌细胞在一个月和六个月冻存、复苏后其细胞能正常生长、增殖.结论能用此方法对贴壁生长细胞进行短期冷冻保存.     

超低温冷冻对人PBMC中不同淋巴细胞亚群的影响

随着超低温技术的日趋成熟,其应用领域不断拓展,特别是在造血干细胞移植过程中,该技术起着非常关键的作用,而冷冻对免疫细胞影响的大小关系到机体免疫状况.为了探讨超低温冷冻对人单个核细胞(PBMC)中不同淋巴细胞亚群活率的影响是否相同,本研究对23例行自体外周血干细胞移植治疗的实体瘤患者PBMC中各淋巴细胞亚群(CL4~ ,CD8~ ,CD45~ ,CD56~ )冻存前及复苏后的活率进行了检测.我们用23例实体瘤患者中,乳腺癌7例,恶性淋巴瘤10例,卵巢癌2例,生殖细胞肿瘤1例,肺癌1例,多发性骨髓瘤1例.年龄30～55岁.使用美国百特公司血细胞分离机(CS-3000Plus)采集PBMC.每份样本的冻存体积为60ml.冷冻保护液为70%Tc-199,20%DMSO,10?血清.应用程控降温系统(美国Froma公司)使样本温度降至-     

冻存对CIK细胞活性的影响

目的寻求一种CIK细胞的保存方法。方法将诱导成功的CIK细胞于14天时冻存,两个月之后复苏。观察细胞状态,复苏细胞从第一天起绘制细胞生长曲线,没有冻存的细胞从培养14天起绘制生长曲线,比较两者增殖率有无差别。复苏3天后做MTT,检测两组CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性差异。复苏后第三天用流式细胞仪测定细胞表型,与没有冻存的细胞进行比较。结果复苏后细胞状态良好,与未冻存细胞相比增殖率有差异（P〈0．05）。未冻存细胞在效靶比为40：1、20：1、10：1时杀伤率分别为（51．1±2．0）％、（50．9±3．3）％、（36．4±3．2）％,冻存细胞在效靶比为40：1、20：1、10：1时杀伤率分别为（49．7±1．5）％、（34．7±1．3）％、（29．5±7．6）％,两者在效靶比不同时杀伤活性没有明显差异。细胞表型尤其是起主要杀伤作用的细胞群CD3^＋CD56^＋分别为（19．1±0．4）％、（19．5±0．8）％,两者没有明显差异。结论冻存后复苏对CIK细胞的增殖率有一定影响,但并不影响临床上的应用。对杀伤活性和细胞表型没有影响。CIK细胞冻存后复苏方便了临床的应用。     

冻存对脐血树突状细胞介导的食管癌疫苗的影响

目的:观察低温冻存对人脐血DC与EC109食管癌细胞融合疫苗生物学特性及CTL活性的影响。方法:应用免疫磁珠标记法分选人脐血CD34 干细胞,细胞因子扩增培养为成熟DC,聚二乙醇(PEG)融合法制备EC109-DC融合疫苗,-80℃低温冰箱冻存,3周后复苏,计算疫苗回收率及存活率。倒置相差显微镜观察冻存后疫苗的细胞形态,流式细胞术分析疫苗及疫苗活化后T淋巴细胞的表型,MTT法检测疫苗特异的CTL活性。结果:冻存后疫苗存活率及回收率分别为(77·2±1·8)%、(61·8±1·4)%。冻存对疫苗细胞形态及表型无明显影响。冻存疫苗和未冻存疫苗活化后T淋巴细胞,CD3 T/CD4 T及CD3 T/CD8 T均较活化前明显增加,P=0·002;CD4 T/CD8 T由活化前的0·85分别增加至1·25和1·29,疫苗冻存与否对T细胞活化能力无明显差别,P=0·052。疫苗特异的CTL活性未受冻存明显影响,其杀伤率与未冻存疫苗组相比差异无统计学意义,P=0·667。结论:-80℃低温冰箱短期冻存对EC109-DC融合疫苗生物学特性及特异的CTL活性无明显影响,可望为EC109-DC疫苗的开发应用提供简单可行的保存方法。     

人尿源性干细胞的原代培养

目的：建立一种人尿源性干细胞（hUSCs）的原代分离培养及保存方法,为hUSCs的应用奠定基础。方法：取10例成人健康志愿者的尿液分别进行hUSCs原代培养,台盼蓝染色法比较不同冻存液配方复苏后的细胞存活率,进而确定hUSCs的最佳冻存液配方;采用四甲基噻唑蓝（MTT）法检测hUSCs细胞的增殖活性;流式细胞术测定间充质干细胞表面抗原CD44和CD90的表达情况。结果：10例健康成人志愿者中6例成功提取了hUSCs并体外培养形成集落;台盼蓝染色法确定配比为DMSO∶FBS∶hUSCs培养基=1∶4∶5的冻存液细胞存活率最高,与其他组比较差异具有统计学意义（P < 0.05）;MTT法检测显示hUSCs生长曲线呈S形且具有良好的增殖活性;流式细胞术鉴定干细胞表面抗原CD44和CD90呈阳性表达。结论：成功建立了一种人尿源性干细胞的原代分离培养及保存方法。     

自体外周血造血干细胞的采集和衡量

自体外周血造血干细胞（ＰＢＳＣ）移植后血液系统的重建与采集和保存的ＰＢＳＣ的质量和数量有密切关系。在１５名病人的７６次ＰＢＳＣ的采集和保存中，发现ＰＢＳＣ的质量和数量有明显的个体差异，与疾病的类型和化疗方案有密切关系。ＮＨＬ中ＣＤ＋３４细胞与ＣＦＵ－ＧＭ的比例平均为２５％，ＣＭＬ为６７％，ＭＭ最低为１３９％，这可能是因为ＭＭ病人的血清中存在白细胞分化的抑制因子。ＣＭＬ病人中ＣＤ＋３４／ＣＤ－３３细胞在总的ＣＤ＋３４细胞中的比例很低，提示此类病人的早期造血干细胞很少。ＮＩＣＯＯＬ程控降温仪与－８０℃冰箱在细胞的冷冻保存中没有明显的差异。认为单一项目的检测不能全面评价ＢＰＳＣ的质量和数量，应该同时进行单个核细胞计数、ＣＦＵ－ＧＭ数和ＣＤ＋３４细胞数的评估。