钙蛋白酶调节致心肌细胞肥大的信号转导

目的： 探讨钙敏感的calpain对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）介导的致心肌细胞肥大的钙调神经磷酸酶（CaN）信号通路的调节。方法: 原代培养的乳鼠心肌细胞为模型，AngⅡ刺激细胞Ca2+内流和（或）内贮细胞Ca2+释放， ［3H］-Leu掺入法反映心肌细胞蛋白合成速率，Fura-2/AM比率荧光成像分析细胞内钙信号变化，免疫印迹检测心肌细胞μ-calpain、m-calpain、CaN磷酸化及蛋白表达。结果: Ang Ⅱ呈浓度依赖性（10^-8-10^-5 mol·L^-1）促心肌细胞［Ca2+］i增加,各刺激组［Ca2+］i与对照组差异显著(P<0.01或P<0.05)。AngⅡ（10-7 mol·L^-1）剌激心肌细胞15 min后, μ-calpain的磷酸化明显增加，但其蛋白表达量无显著改变（P>0.05）, m-calpain蛋白表达及磷酸化量显著差异，CaN的蛋白表达量无显著改变，但其磷酸化增强, 环孢素A（CsA）抑制CaN的磷酸化。AngⅡ可使无血清培养新生大鼠心肌细胞［3H］-Leu掺入率随时间增加而增加，与对照组差异显著(P<0.01或P<0.05)，且在10^-8-10^-5 mol·L^-1范围内呈量效依赖关系。结论: AngⅡ剌激细胞外Ca2+跨膜内流和（或）内贮Ca2+的释放导致μ-calpain的激活，进一步激活钙敏感的CaN信号通路，在心肌肥厚的病理过程中起重要作用。     

钙调神经磷酸酶参与心衰患者心肌重构的信号转导

目的：探讨血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)介导的钙调神经磷酸酶（CaN）信号通路参与心力衰竭（CHF）患者心肌重塑的机制。方法:选择因瓣膜性心脏病接受二尖瓣置换术的CHF病人39例，正常对照38例(其中8例来自意外伤亡的器官捐献者)。彩色多普勒超声心动图仪检测心脏扩大和心功能参数。放免法检测血浆及心肌组织Ang Ⅱ浓度，免疫沉淀法测心肌组织CaN、活化T细胞核因子(NFAT₃）、锌指转录因子(GATA₄)磷酸化及蛋白表达，RT-PCR检测肌球蛋白重链（β-MHC）mRNA表达。结果:AngⅡ分别与心脏扩大参数呈显著正相关，而与心功能参数呈显著负相关。CHF患者心肌组织CaN蛋白表达、CaN磷酸化、GATA^₄蛋白表达及β-MHC mRNA表达明显高于对照组，随心功能恶化其表达逐渐增加；NFAT₃磷酸化随心功能恶化而减弱。结论：肾素血管紧张素系统（RAS）激活的CaN信号通路在CHF患者心肌重构机制中可能起重要作用。     

高糖激活Ca~(2+)-CaN-NFAT3信号通路致H9c2细胞肥大

目的:利用细胞实验探讨不同高糖浓度培养H9c2细胞是否引起心肌细胞肥大,探讨Ca2+-Ca NNFAT3信号通路是否参与高糖引起H9c2心肌细胞肥厚过程。方法:体外培养H9c2大鼠心肌细胞48 h,分为5mmol/L糖对照组、25mmol/L糖培养组、50 mmol/L糖培养组、25mmol/L糖培养加L型钙通道阻滞剂苯磺酸氨氯地平[商品名络活喜(Norvasc)]组和50 mmol/L糖培养加Norvasc组5组。观察H9c2细胞形态并测量细胞表面积大小;荧光分光光度法检测心肌细胞内钙离子浓度[Ca2+]i;ELISA测细胞内Ca N浓度;real-time PCR法及Western blot检测Ca NAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表达。结果:细胞大小、单细胞平均[Ca2+]i测定荧光值及细胞内Ca N浓度在随糖浓度升高呈阶梯上升,50 mmol/L时达到最高点。加入Norvasc后细胞大小较相同条件不加Norvasc者降低。Ca NAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表达随糖浓度升高逐步升高,50 mmol/L时达最高。加入Norvasc后Ca NAβ、NFAT3和β-MHC的mRNA及蛋白表达均较未加Narvasc组明显降低。结论:高糖通过激活Ca2+-Ca N-NFAT3信号通路引起H9c2心肌细胞肥大。     

神经肽Y活化大鼠心肌细胞内Ca^2＋及钙调素依赖的钙调神经磷酸酶途径

目的 观察神经肽 Y （NPY）对心肌细胞内Ca^2＋及钙调素（CaM）依赖的钙调神经磷酸酶（CaN）信号传导途径的影响.方法 以NPY刺激心肌细胞.用环胞素A（CsA）特异性抑制CaN活性.应用Western印迹测细胞内CaN-α蛋白表达.采用组织化学法测CaN酶活性.用Fluo3-AM荧光标记法观察心肌细胞胞质及核内钙离子浓度变化.结果 加入100 nmol/L NPY刺激后,心肌细胞CaN酶活力较对照组明显增高（P＜0.05）,10 nmol/L NPY组和CsA 组（100 nmol/L NPY ＋ 5 μg/ml CsA） CaN酶活性与对照组相比,差异无统计学意义.100 nmol/L NPY组心肌细胞内CaN-α蛋白表达较对照组显著增高（P＜0.05）. 加入100 nmol/L NPY在10 min内,心肌细胞胞浆及核内钙含量与对照组相比,差异无统计学意义.经100 nmol/L NPY刺激24 h后,心肌细胞胞浆及核内钙含量明显高于对照组（P均＜0.01）.结论 NPY可活化心肌细胞内Ca^2＋及CaM-CaN途径.NPY刺激下产生的细胞内钙增加,可能是其活化CaN途径的始动环节.     

神经肽Y活化大鼠心肌细胞内Ca2+及钙调素依赖的钙调神经磷酸酶途径

目的 观察神经肽 Y (NPY)对心肌细胞内Ca2+及钙调素(CaM)依赖的钙调神经磷酸酶(CaN)信号传导途径的影响.方法 以NPY刺激心肌细胞.用环胞素A(CsA)特异性抑制CaN活性.应用Western印迹测细胞内CaN-α蛋白表达.采用组织化学法测CaN酶活性.用Fluo3-AM荧光标记法观察心肌细胞胞质及核内钙离子浓度变化.结果 加入100 nmol/L NPY刺激后,心肌细胞CaN酶活力较对照组明显增高(P＜0.05),10 nmol/L NPY组和CsA 组(100 nmol/L NPY + 5 μg/ml CsA) CaN酶活性与对照组相比,差异无统计学意义.100 nmol/L NPY组心肌细胞内CaN-α蛋白表达较对照组显著增高(P＜0.05). 加入100 nmol/L NPY在10 min内,心肌细胞胞浆及核内钙含量与对照组相比,差异无统计学意义.经100 nmol/L NPY刺激24 h后,心肌细胞胞浆及核内钙含量明显高于对照组(P均＜0.01).结论 NPY可活化心肌细胞内Ca2+及CaM-CaN途径.NPY刺激下产生的细胞内钙增加,可能是其活化CaN途径的始动环节.     

激活TGR5通过CaN/NFAT3途径减轻高糖诱导的心肌细胞肥大

目的:观察激活G蛋白偶联胆汁酸受体1(GPBAR1,又称TGR5)对高糖诱导的小鼠心肌肥大的影响,并探讨钙调神经磷酸酶(CaN)/活化T细胞核因子3(NFAT3)信号途径在其中的作用。方法:原代培养小鼠心肌细胞,采用图像分析系统测定细胞表面积,BCA法测定细胞蛋白含量,通过RT-PCR及Western blot方法检测TGR5、CaN及NFAT3的mRNA及蛋白表达变化。结果:成功培养小鼠心肌细胞。高糖明显诱导心肌细胞表面积及细胞蛋白含量的增加(P0.05)同时CaN及NFAT3的表达也增加(P0.05)。激活TGR5或给予CaN抑制剂环孢素A均能抑制高糖引起的心肌细胞肥大及NFAT3表达增加(P0.05)。给予TGR5干扰慢病毒可阻断TGR5对心肌细胞肥大的上述改善作用(P0.05)。结论:激活TGR5能减轻高糖诱导的心肌细胞肥大,其机制可能与抑制CaN/NFAT3信号通路有关。     

钙调神经磷酸酶在cTnI基因Asp128Tyr突变致心肌肥大中的作用*

 目的：探讨钙调神经磷酸酶（CaN）在心肌钙蛋白I（cTnI）基因第128位天冬氨酸→酪氨酸（Asp128Tyr）突变致心肌肥大中的作用。方法：乳鼠心肌细胞,以心钠素（ANF）、脑钠肽(BNP) mRNA表达作为心肌肥大指标,观察含cTnI Asp128Tyr突变基因的腺病毒转染对心肌细胞的作用,并观察CaN抑制剂环孢菌素A（CsA）或FK506对突变基因转染的影响。Real-time PCR检测ANF、BNP和CaN mRNA表达变化, 同时行CaN活性测定。结果：转染含cTnI Asp128Tyr突变基因腺病毒的心肌细胞增大,胞内ANF和BNP 的mRNA表达较空白对照组、不含任何目的基因的阴性对照腺病毒转染组和转染含野生型cTnI基因的腺病毒组增高（P<0.05）。与含野生型cTnI基因的腺病毒组相比,转染含cTnI Asp128Tyr突变基因的腺病毒组在ANF和BNP mRNA表达升高的同时存在CaN活性升高和CaN mRNA表达上调（P<0.05）。转染含cTnI Asp128Tyr突变基因的腺病毒并用CsA或FK506干预后,心肌细胞缩小,胞内ANF和BNP mRNA表达量较单纯转染含cTnI Asp128Tyr突变基因的腺病毒组降低（P<0.05）,同时心肌细胞内CaN活性显著下降（P<0.05）,CaN mRNA表达下调（P<0.05）。结论：cTnI Asp128Tyr突变可引起心肌细胞肥大;CaN信号通路参与了cTnI Asp128Tyr突变致心肌肥大过程的调控。     

钙调神经磷酸酶信号通路参与PGF2α诱导的心肌细胞肥大

目的： 研究前列腺素F₂α（PGF₂α）诱导心肌细胞肥大的作用及其细胞内信号转导通路。方法：利用乳鼠心肌细胞培养，以细胞直径、蛋白质含量和心房利钠因子（ANF）mRNA表达为心肌肥大反应指标，观察PGF₂α致心肌肥大效应。采用Fura-2/AM为荧光指示剂测定心肌细胞内钙浓度（［Ca²⁺］_i）；RT-PCR法半定量测定mRNA表达；Western blotting方法检测蛋白表达。结果：随着PGF₂α 浓度升高（10^-10-10^-5 mol/L），心肌细胞直径、蛋白含量和［Ca²⁺］_i均明显高于溶剂对照组（P﹤0.01）；PGF₂α 10^-7 mol/L使ANF mRNA表达明显高于对照组（P﹤0.01）；钙调神经磷酸酶（CaN）mRNA及CaN信号通路（含CaN及其下游因子NFAT₃和GATA₄）蛋白的表达亦明显高于对照组（P﹤0.05）。加入CsA（CaN阻断剂）后，PGF₂α诱导的心肌细胞肥大和［Ca²⁺］_i升高的作用明显降低（P﹤0.01），CaN mRNA和CaN信号通路蛋白的表达亦明显减少（P﹤0.05）。结论： PGF₂α诱导的心肌细胞肥大至少部分与其升高［Ca²⁺］_i从而激活CaN信号转导通路有关。     

伊贝沙坦对血管紧张素Ⅱ所致心肌细胞蛋白质合成和肌球蛋白重链表达的影响

目的 观察伊贝沙坦对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）所致心肌细胞中蛋白质合成速率及肌球蛋白重链（MHC）基因表达改变的影响.方法 以AngⅡ及伊贝沙坦分别或同时作用于培养的细胞.采用放射性同位素[^3H]-leu掺入法检测培养心肌细胞蛋白质合成速率.应用荧光定量PCR方法检测心肌细胞心房利钠肽因子（ANF）以及α-MHC、β-MHC的表达.结果 AngⅡ处理使心肌细胞中[^3H]-Leu掺人增加（P＜0.05）,同时ANF mRNA的表达明显高于正常（P＜0.05）;α-MHC mRNA的表达显著低于正常（P＜0.05）,而β-MHC mRNA的表达显著高于正常（P＜0.05）,α-MHC/β-MHC的比值下降（P＜0.05）.当伊贝沙坦与AngⅡ共同作用于培养的心肌细胞时,与AngⅡ组比较,[^3H]-Leu的掺入明显下降（P＜0.05）,与正常组比无统计学意义（P＞0.05）;同时ANF的表达下降,与正常组比无统计学意义（P＞0.05）;心肌细胞中α-MHC的表达明显增高（P＜0.05）,而β-MHCmRNA的表达显著降低（P＜0.05）,α-MHC/β-MHC的比值上升（P＜0.05）.结论 伊贝沙坦能抑制AngⅡ所致的心肌细胞肥大和细胞中α-MHC向β-MHC表达的转换.     

过表达脑源性神经生长因子(BDNF)抑制血管紧张素Ⅱ诱导的SD大鼠心肌细胞凋亡

目的研究脑源性神经生长因子(BDNF)在抗心肌细胞肥大凋亡病理过程中的作用及分子机制。方法运用腹主动脉不完全结扎法构建心肌肥大动物模型,分离培养SD大鼠原代心肌细胞经血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导构建心肌细胞肥大的细胞模型;运用脂质体将BDNF过表达重组体(pcD NA5-BDNF)转染心肌细胞,免疫荧光染色检测BDNF转染后对心肌细胞表面积的影响;流式细胞术检测BDNF转染后对心肌细胞凋亡的影响;实时荧光定量PCR检测过表达BDNF对心肌细胞中心房钠尿肽(ANP)和脑钠肽(BNP)mRNA水平的影响;Western blot法检测心肌组织和细胞中BDNF蛋白水平变化及BDNF过表达后心肌细胞ANP和BNP、钙调蛋白激酶2(CaM K2)、钙调神经磷酸酶(CaN)和磷酸化钙调神经磷酸酶(p-CaN)、活化T细胞核因子3(NFATC3)和磷酸化的活化T细胞核因子3(p-NFATC3)蛋白水平的变化。结果 BDNF蛋白在心肌肥大动物模型和AngⅡ处理的心肌细胞中显著升高并具有时间效应;与未转染对照组相比,BDNF过表达组心肌细胞的表面积、细胞凋亡率、ANP和BNP基因及蛋白表达水平、p-CaM K2和CaN蛋白水平显著降低,而p-NFATC3蛋白水平显著增加。结论 BDNF能够抑制AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡,通过抑制CaM K2和CaN信号通路起作用。     

血管紧张素(1-7)通过抑制中电导钙激活钾离子通道蛋白表达参与肾脏纤维化

目的 探讨血管紧张素（Ang）（1-7）在肾纤维化过程中的保护作用与中电导钙激活钾离子通道（KCa3.1）的关系。 方法 60只雄性小鼠随机分为5组：对照组 (WT)；血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）组：皮下注射 Ang Ⅱ ［1.4 mg/(kg.d)］；注射Ang Ⅱ 的同时给予以下药物干预： Ang Ⅱ阻断剂 洛沙坦（Losartan）组：皮下注射 Losartan［40 mg/(kg.d)］； Ang（1-7）组：皮下注射 Ang（1-7）［0.14 mg/(kg.d)］；血管紧张素转化酶2（ACE2）激动剂重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐（DIZE）组：皮下注射DIZE［10 mg/(kg.d)］。连续给药4周后对相关指标进行检测。Masson染色法检测肾组织胶原沉积变化；Western blotting法检测肾组织 Ⅰ 型胶原、Ⅲ 型胶原和 KCa3.1通道蛋白表达的变化。 结果 与对照组相比，Ang Ⅱ组小鼠肾组织内胶原沉积量明显增加（n=12，P<0.01），表明肾纤维化模型复制成功。Ang Ⅱ使肾组织Ⅰ、Ⅲ型胶原合成显著增多（n=6，P<0.01），同时促进了肾组织KCa3.1通道蛋白的表达（P<0.01），而Ang （1-7）及ACE2激活剂 DIZE 的应用抑制了肾组织内胶原沉积量、Ⅰ/Ⅲ型胶原合成及KCa3.1通道蛋白的表达（n=12或6，P<0.01）。结论 Ang （1-7）在肾纤维化过程中发挥保护作用，这一作用可能与其下调肾组织中KCa3.1通道蛋白表达有关。     

钙调神经磷酸酶在血管紧张素Ⅱ刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节

目的:观察钙调神经磷酸酶(CaN)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激的大鼠心肌细胞肥大中的作用及其活性调节。方法:建立AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大模型,观察CaN抑制剂对AngⅡ刺激的心肌细胞 [³H]-亮氨酸掺入的影响,以及各种因素对心肌细胞CaN酶活性的影响。结果:10、 100、 1000 nmol·L^-1的AngⅡ作用12 h分别使心肌细胞的CaN活性增加了13%、 57%(P＜0.05)、 228%(P＜0.01)。AngⅡ(10 nmol·L^-1)刺激心肌细胞2 h内,CaN活性与对照组无明显差异(P＜0.05);AngⅡ刺激心肌细胞12 h以上,CaN活性才明显增高(P＜0.05)。Losartan(50 μmol·L^-1)、H₇(50 μmol·L^-1)及Fura-2/AM(4 μmol·L^-1)可明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性;而PD98059(50 μmol·L^-1)对AngⅡ刺激的心肌细胞CaN活性无明显影响。AngⅡ(10^-7mol/L)刺激的大鼠心肌细胞 [³H]-亮氨酸掺入明显高于对照组(P＜0.01),而CaN特异性抑制剂-环孢素A(0.5~5 μg/mL)可以明显抑制AngⅡ刺激的心肌细胞 [³H]-亮氨酸掺入。结论:依赖Ca²⁺/CaM活化的CaN可能在AngⅡ刺激的心肌细胞肥大中起重要作用;CaN的活化可能有赖于胞内Ca²⁺水平的持续升高,另外,CaN的活性还可能受到蛋白激酶C等信号分子的磷酸化调节。     

羧胺三唑通过抑制NFAT2核转运降低小鼠CD8^+T细胞中程序性死亡受体1的表达

目的研究羧胺三唑(CAI)对CD8+T细胞的作用,并探索其增强活化的T细胞杀伤作用的关键机制。方法用免疫磁珠分选出小鼠CD8+T细胞,分为对照组、CAI组、ZK756326(Ca2+激活剂)组以及CAI+ZK756326组。流式细胞计量术检测细胞内游离钙离子水平;酶联免疫吸附法检测细胞内钙调磷酸酶(CaN)的表达;免疫荧光染色检测细胞活化T细胞核因子2(NFAT2)核转运;染色质免疫共沉淀-qPCR检测细胞中NFAT2调控程序性死亡受体1(PD-1)表达。分离小鼠脾脏细胞毒性T淋巴细胞(CTLs),流式细胞计量术检测其中CD8+T细胞PD-1的表达。结果CAI组显著降低CD8+T细胞内Ca2+浓度(P<0.001),CAI+ZK756326组胞内Ca2+浓度有所升高(P<0.01);CAI显著降低CD8+T细胞中钙调磷酸酶的含量(P<0.001);CAI可显著抑制NFAT2核转运(P<0.001),并使NFAT2依赖的PD-1转录进程显著降低(P<0.001);CAI使小鼠脾脏CTLs细胞中PD-1+CD8+T细胞比例显著减少(P<0.001)。结论CAI通过抑制CD8+T细胞内钙离子水平以及钙调磷酸酶的表达抑制NFAT2核转运,从而降低CD8+T细胞PD-1的表达,进一步产生免疫治疗干预作用。     

Ang-Ⅱ对大鼠胚心成纤维细胞的影响

目的：探讨血管紧张素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)对大鼠胚心成纤维细胞(FB)的促增殖作用和促胶原蛋白合成作用及其机制。方法： 应用同位素掺入技术，检测Ang-Ⅱ对体外大鼠胚心FB的促增殖和促胶原蛋白合成作用，并应用放射自显影和荧光法，检测FB上的Ang-Ⅱ受体分布和细胞内游离Ca2+浓度。结果： Ang-Ⅱ使FB ［3H］TdR和［3H］脯氨酸的掺入率明显增加，放射自显影显示在细胞表面有大量银颗粒出现，图像分析显示膜上受体银颗粒在竞争抑制组明显少。细胞内游离Ca2+浓度较高。结论： Ang-Ⅱ有刺激大鼠胚心FB增殖和胶原蛋白合成作用， 大鼠心肌FB膜上有Ang-Ⅱ受体，受体磷酸化后 ，通过细胞内游离Ca2+浓度增加等一系列细胞内信号系统的活化，出现FB的增殖和胶原蛋白合成。     

丙戊酸抑制血管紧张素Ⅱ致大鼠心肌细胞肥大

目的 探讨丙戊酸在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）致心肌细胞肥大过程中的抑制作用。方法 常规方法培养大鼠原代心肌细胞,分为3组：对照组、肥大组、丙戊酸组。利用AngⅡ刺激心肌细胞造成肥大模型,并给予丙戊酸进行干预。反转录聚合酶链反应观察β-肌球蛋白重链（β-MHC）mRNA表达;相差显微镜和电镜观察心肌细胞的表面积和超微结构变化;免疫组织化学法检测c-fos蛋白的表达。结果 原代心肌细胞在AngⅡ作用下表面积增加,超微结构发生改变;β-MHC mRNA和c-fos蛋白表达增加（P < 0.05）。给予丙戊酸干预后,上述变化显著缓解（P < 0.05）。结论 丙戊酸抑制AngⅡ刺激引起的心肌细胞肥大,为临床上治疗心肌肥厚提供一条新的思路。