抗人FcεRIα单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备鼠抗人IgE高亲和力受体FceRIa的单克隆抗体并对其进行初步鉴定,为过敏性疾病的相关研究提供条件。方法用人FceRIα重组蛋白作为抗原免疫BALB／C小鼠,常规方法进行融合,经筛选及克隆化建立可稳定分泌抗人FceRIαmAb的杂交瘤细胞株,用ELISA、免疫荧光标记、荧光显微镜和流式细胞仪分析以及Western—Blot方法进行抗体的初步鉴定。结果筛选到2株可稳定分泌抗人FcεRIα单克隆抗体的细胞株,流式细胞术分析此2株抗体与CHO3D10细胞的结合率均大于95％,免疫荧光显示2株抗体均能与FcεRIα发生特异性反应。Western-Blot结果显示抗体轻重链分别约28Kd与50Kd。结论制备的两株FcεRIα的单克隆抗体可特异性与细胞表面FcεRI结合,可用于肥大细胞功能以及变态反应病临床治疗的进一步研究。     

人天冬酰胺合成酶基因克隆和单克隆抗体的制备及鉴定

目的克隆人天冬酰胺合成酶（ASNS）基因，以基因工程技术表达ASNS融合蛋白，免疫动物，制备及鉴定鼠抗人ASNS的单克隆抗体，为深入研究L-天冬酰胺酶治疗中线鼻型自然杀伤细胞（NK）／T细胞淋巴瘤的机制奠定基础。方法用逆转录（RT）-PCR从人肝癌细胞株HepG2扩增目的片段，构建原核表达质粒pMS-ASNS，在大肠杆菌中表达融合蛋白MS2-ASNS。用纯化融合蛋白免疫雌性BALB／C小鼠，以常规杂交瘤技术制备鼠抗人ASNS单克隆抗体（ASNSMcAb）。进行抗体亚类测定和免疫印迹法（WB）分析，然后用免疫化学技术检测ASNS在肿瘤中的表达。结果克隆ASNS读码框的部分基因（NCBI和M27396，179～1420bp），PCR产物为1263bp。融合蛋白MS2-ASNS相对分子质量约为54700。筛选出2株能持续分泌抗ASNS单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分泌抗体亚类均为IgG2a。WB结果显示，抗ASNS单抗可与融合蛋白及细胞内ASNS蛋白特异性结合。免疫组织化学及免疫细胞化学证明，所得抗体能检测到肿瘤细胞中ASNS基因表达。结论成功克隆了ASNS基因，并制备和鉴定了鼠抗人ASNSMcAb，为深入研究L=天冬酰胺酶用于治疗中线鼻型NK／T细胞淋巴瘤的机制提供了工具。     

三株抗人巨细胞病毒pp65蛋白单克隆抗体的鉴定和应用

目的 制备抗HCMVpp65蛋白的单克隆抗体(简称单抗),并对其进行相关研究.方法 以重组表达的HCMVpp65蛋白为抗原,运用杂交瘤技术制备单抗,对获得的单抗进行Ig亚型、特异性、效价和亲和常数的鉴定与测定,并以免疫荧光检测法与进口同类产品进行比较.结果 获得3株针对HCMVpp65蛋白的单抗,即B6、G12、2B12;Ig亚型依次为IgG1κ型、IgG1κ型、IgMκ型;亲和常数依次为3.6×107 L/mol、3.8×107 L/mol、3.1×108 L/mol;免疫印迹试验结果表明,3株单抗都与HCMVpp65蛋白特异性的结合,除2B12外,B6、G12与EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ、HSVⅡ均无交叉反应;与进口单抗平行检测140份临床标本,结果一致(r=1.00,P＞0.05).结论 成功获得3株稳定分泌抗HCMVpp65蛋白的杂交瘤细胞株,所产生的抗体特异性和亲和力较理想,为HCMVpp65蛋白抗原血症检测国产化试剂盒的研制奠定了基础.     

抗人直肠癌单克隆抗体的制备及应用研究

目的:制备鼠抗人直肠癌单克隆抗体.方法:以手术取得的新鲜直肠癌组织免疫Balb/c小鼠,用淋巴细胞杂交瘤技术获得能持续、稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系.结果:制得了1株能稳定分泌高特异和高效价单抗的杂交瘤细胞系,其单抗相应抗原在直肠癌组织高度表达(＞90%),主要分布于细胞膜,胞浆少量分布,并可脱落至腺腔.结论:此单抗的成功研制为直肠癌早期诊断和进一步制备抗直肠癌独特型抗体提供了可能性.     

人survivin蛋白的表达、纯化与单克隆抗体制备

目的:表达人survivin重组蛋白并制备单克隆抗体.方法:表达含有survivin基因的重组质粒pRSETB-survivin,表达人survivin重组蛋白,以此为抗原,常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS21细胞融合,得稳定分泌survivin mAb的杂交瘤细胞株,ELISA检测mAb的相对亲和力,Western blot检测mAb的特异性.间接免疫荧光观察骨肉瘤细胞中survivin的表达情况.结果:重组载体pRSETB-survivin转化入大肠杆菌BL21中表达所得蛋白经Western blot验证为目的蛋白.筛选出2株能稳定分泌特异性抗人survivin的mAb杂交瘤细胞株,免疫球蛋白亚类均为IgG类;单克隆抗体的亲和常数为S1 1.52×10-9mol/L,S2 2.31×10-9mol/L.Western blot结果显示,2株单抗识别相对分子质量为20 000的survivin单一条带,并发现在骨肉瘤细胞中survivin主要表达在胞浆内.结论:成功地表达出人survivin重组蛋白,制备出抗人survivin mAb,为进一步用于survivin的免疫学检测及骨肉瘤生物学治疗奠定了基础.     

人心肌肌钙蛋白I的重组表达及其单克隆抗体的制备

目的构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的表达载体,表达cTnI重组蛋白,并制备其单克隆抗体(mAb)。方法以化学方法合成cTnI基因并插入融合表达载体pBV220的多克隆位点,构建重组表达质粒pBV220/cTnI。以重组质粒转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子,经热激诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Westernblot进行鉴定。以基因重组的cTnI蛋白为抗原,常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS1细胞融合,获得稳定分泌cTnImAb的杂交瘤细胞株,ELISA检测mAb的相对亲和力;Westernblot检测mAb的特异性。结果酶切鉴定和DNA测序显示cTnI重组表达载体中含有人cTnI全长编码序列。将该重组载体转化入大肠杆菌DH5α中表达所得蛋白经WesternBlot验证为目的蛋白。筛选出2株能稳定分泌特异性抗cTnI的mAb杂交瘤细胞株,免疫球蛋白亚类均为IgG类;Westernblot结果显示,两株单抗识别相对分子量为24000的cTnI单一条带;中和抑制试验表明培养上清中的抗体能明显被cTnI中和;cTnI单克隆抗体的亲和常数为Kaff=1.62×109(mol/L)-1。结论成功地构建了cTnI表达载体、表达出cTnI重组蛋白,制备出抗cTnImAb,为进一步用于cTnI的体外免疫学检测奠定了基础。     

抗解脲脲原体单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高特异性的抗解脲脲原体（Uu）单克隆抗体并进行鉴定。方法用灭活的抗解脲脲原体免疫BalB／C小鼠，取其脾细胞与Sp2／O细胞融合，制备单克隆抗体，对其鉴定和分析。结果共获得5株能稳定分泌抗uu单抗的杂交瘤细胞条，5株细胞的抗体类别都为IgG2b；其中4株只与Uu产生反应而不与肺炎支原体反应，另外一株与肺炎支原体具有交叉反应。结论制备了4株具有较高特异性的抗Uu单抗。     

抗人胰腺癌单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：制备抗人胰腺癌单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法：以人分化胰腺癌细胞株8988为抗原,免疫BALB/c小鼠,常规融合,运用ELISA方法筛选;流式细胞仪及免疫组化鉴定其组织特异性,West blot检测其特异性结合抗原的相对分子量。结果：得到一株高效价的稳定分泌IgG1抗人胰腺癌的单克隆抗体的细胞株,命名为SZ121,腹水效价为2×10^-5。运用ELISA方法及流式细胞仪方法检测证实SZ121特异地识别胰腺癌细胞。West blot检测显示SZ121特异性结合的抗原相对分子量为66 000左右。结论：实验证实SZ121是特异结合胰腺癌细胞的单克隆抗体。     

人纤溶酶原激活物抑制物1基因克隆表达和单克隆抗体的制备及其初步应用

目的克隆人纤溶酶原激活物抑制物1（PAI1）基因，制备和鉴定针对人PAI1的单克隆抗体，以检测PAI1在乳腺癌中的表达。方法利用逆转录（RT）-PCR方法从人乳腺癌细胞株MDA231总RNA中扩增克隆PAI1基因，构建其原核表达质粒，并表达MS2-PAI1融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫BALB／C小鼠，常规细胞融合和选择性培养，亚克隆筛选出单克隆细胞株，纯化单克隆抗体。利用蛋白印迹（Wb）、免疫组织化学法检测分析PAI1在乳腺癌中的表达水平。结果克隆了1209bp的PAI1基因全长片段。经ELISA双筛，获得2株能稳定分泌抗PAI1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌抗体亚类均为IgG1，且均能特异识别PAI1，并与其他蛋白无交叉反应。Wb结果显示，该抗PAI1单抗与MS2-PAI1融合蛋白以及细胞中的天然蛋白均能结合。免疫组织化学染色结果显示，该单抗与人乳腺癌细胞株MDA231和乳腺癌组织结合后，呈阳性反应。结论克隆了人PAI1基因，通过原核表达产物制备并纯化了针对PAI1的单克隆抗体。初步检测PAI1能在乳腺癌细胞和乳腺癌组织中表达，这为深入研究PAI1基因功能和检测临床肿瘤组织及体液中的PAI1奠定了可靠基础。     

载脂蛋白M单克隆抗体的制备及其初步应用

目的 制备亲和力高、纯度好的载脂蛋白M(apoM)单克隆抗体,并用以检测apoM在组织细胞及不同人群中的分布.方法 用重组apoM蛋白免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、筛选及克隆化,得到生长良好、分泌稳定的杂交瘤细胞株;注射Balb/c小鼠腹腔,收取腹腔积液,纯化后得到apoM单克隆抗体,并用本实验制备的单克隆抗体检测健康对照组及冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)患者稳定型心绞痛(sA)组和急性冠状动脉综合征(ACS)组血清中的apoM蛋白浓度.结果 得到了3株单克隆抗体,经亚型鉴定、阻断试验和WB确定为apoM单克隆抗体;并通过该抗体在人细胞和组织中检测到了apoM蛋白.冠心病SA组的apoM浓度为(11.02±1.96)×10-3 g/L,ACS组apoM浓度为(10.76±1.32)×10-3g /L,对照组为(12.83±2.28)×10-3 g/L,3组间差异有统计学意义(F=11.544,P＜0.05).比较冠心病sA组和ACS组与健康对照组血浆apoM浓度,显示两组冠心病患者血浆apoM浓度均低于健康对照组(t=2.962、3.967,P＜0.05),两组冠心病组之间血浆apoM浓度差异无统计学意义(t=1.033,P＞0.05).结论 成功制备了3株apoM的单克隆抗体,可与人组织细胞中的apoM蛋白特异结合,为进一步研究apoM在脂代谢中的作用打下了基础.     

抗体偶联白蛋白超声造影剂的制备及体外靶向性研究

目的制备单克隆抗体修饰的白蛋白微气泡，并探讨其体外靶向性作用。方法采用N琥珀酰亚胺基-3-（2吡啶二硫）-丙酸酯（SPDP）交联法将鼠抗人血管细胞粘附分子（VCAM-1）单克隆抗体与白蛋白微气泡进行共价偶联，采用玻片凝集法检验抗体是否与白蛋白微气泡交联；体外培养高表达VCAM-1抗原的损伤血管内皮细胞，通过抗体修饰微气泡与该细胞的特异性结合作用检验该微气泡的靶向性作用。结果SPDP交联法制备的免疫微气泡的玻片凝集反应呈阳性；损伤内皮细胞（细胞膜表面高表达VCAM-1抗原）周围可见大量免疫微气泡聚集，而正常内皮细胞（细胞膜表面无VCAM-1抗原表达）表面未见明显免疫微气泡附着。结论应用SPDP交联法能够将抗体有效地偶联到白蛋白微气泡表面，体外实验证实了其与靶细胞的特异性结合作用。     

188-Re直接法标记CD45单抗及其体内生物分布研究

目的：利用188Re直接法标记CD45单抗,探讨其在正常小鼠体内的生物学分布特性。方法应用2-巯基乙醇（2-ME）还原CD45单抗分子中的二硫键形成巯基;以氯化亚锡作为188Re的还原剂,葡庚糖酸钠为中间弱配体,188Re直接标记CD45单抗;PD-10层析柱分离纯化,纸层析法测定标记率与放化纯;鉴定188Re-CD45单抗的体外稳定性;研究188Re-CD45单抗在正常小鼠体内的生物分布特性。结果188Re-CD45单抗的标记率平均为（85.25±2.63）%,PD-10柱纯化后的放化纯为（92.54±3.56）%,比活度平均为（2.06±0.07）TBq/mmol;室温下放置24 h,188Re-CD45单抗放化纯为（64.33±1.53）%;在鼠血清和生理盐水中37℃下孵育24 h后,其放化纯仍有（64.2±3.77）%和（56.7±4.16）%。小鼠体内生物分布显示,188Re-CD45单抗主要分布于肾脏和肝脏,其次是肺脏、骨骼和血液。结论188Re直接法标记CD45单抗的方法简单易行,标记率较高,具有良好的体外稳定性;188Re-CD45单抗静脉注射后,体内放射性主要经肾脏排泄,并在肝脏有较高的浓聚,符合标记抗体的体内分布规律。     

抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗胰蛋白酶原激活肽（TAP）单克隆抗体（TAP McAb），并进行初步鉴定。方法 将人工合成的TAP与血蓝蛋白（KLH）交联作为免疫原，免疫Balb／c小鼠，经细胞融合，有限稀释法筛选出能稳定分泌TAP McAb的杂交瘤细胞株，并对单克隆抗体进行鉴定。结果 细胞融合率85．03％，经4次克隆化后获得10株能稳定分泌TAP McAb的杂交瘤细胞株，经免疫球蛋白亚类鉴定，除1株为IgG1外，其余9株均为IgM类；染色体数目为92～101条；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测杂交瘤细胞培养上清效价为1：20～1：160，腹水效价为1：3200～1：25600；特异性试验表明，抗TAP单克隆抗体与牛血清白蛋白（BSA）、人白蛋白、胰蛋白酶、淀粉酶均无交叉反应；中和抑制试验表明，培养上清及腹水中的抗体能明显被合成多肽TAP及为急性胰腺炎患者尿液所中和；对其中5株细胞株进行相对亲和力分析结果表明，2C3〉8C6〉6H7〉6F7〉8810。结论 成功制备了抗TAP单克隆抗体，为建立敏感、特异的TAP免疫检测方法奠定了基础。     

应用特异性单克隆抗体测定血清酸性铁蛋白

在纯化人胎盘铁蛋白的基础上，应用聚焦层析技术，分离出该蛋白的酸、碱性部分。制备出对人胎盘酸性铁蛋白（ＰＡＦ）具有高度特异性的单克隆抗体，并建立了稳定的酶联免疫吸附试验双抗体夹心法。经测定，健康献血员（３０例）、原发性肝癌（ＰＨＣ，１５例）、原发性胆汁性肝硬化（１８例）、酒精性肝硬化（１４例）及慢性肝炎（２２例）患者的血清ＰＡＦ分别为１０．９±２．１、１６７±１．６、１７．９±１．５、１８．２±２．１和７９．９±１．５μｇ／Ｌ。ＰＨＣ患者血清ＰＡＦ＞１５０μｇ／Ｌ的有１１例，其他肝病患者５４例中仅５例＞１５０μｇ／Ｌ。提示：若配合血清转氨酶测定，血清ＰＡＦ可望成为在鉴别ＰＨＣ与其他肝病上有较大价值的诊断指标。     

单克隆抗体16 D3抑制肺癌的功能研究

目的分析抗肺癌单克隆抗体16 D3靶抗原蛋白在人肺癌细胞及组织中的表达,鉴定16 D3对肺癌的体内外抑制功能,为肺癌靶向治疗提供候选抗体药物。方法采用免疫组化分析16 D3靶蛋白在人肺癌组织中的表达;采用细胞免疫荧光检测单克隆抗体16 D3识别的抗原在肺癌细胞中的表达及亚细胞定位;共接种移植瘤模型评估16D3对肺癌生长的抑制作用,Transwell法和CCK-8法检测单抗16D3对人肺癌细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响;采用流式细胞术检测16 D3靶蛋白分别在亲本和sphere培养的人肺癌细胞中的表达。结果单克隆抗体16 D3的靶蛋白在7种人肺癌细胞的胞内及胞膜上均有表达,在76.9％人肺癌患者组织中特异上调表达。该单抗在体内能较显著地抑制人肺腺癌GLC-82的生长,抑制率为58.23％（ P＜0.05）。在体外对该细胞的增殖、迁移和侵袭具有一定的抑制作用,抑制率分别为26.91％、24.23％和23.67％。该单抗的靶蛋白膜表达阳性细胞比例经sphere培养后显著上升。结论单抗16D3靶抗原在人肺癌中特异表达,并可被sphere培养富集。单抗16D3在体外具有多种抑制功能,在体内能显著抑制人肺腺癌生长,可能是一个肺癌靶向治疗的潜在新药。     

重组人Flt3配体在大肠杆菌中的表达、纯化与功能鉴定

目的：建立重组人Flt3配体（rhFL)的原核高效表达系统及目标蛋白的纯化途径,为大规模获得rhFL产品,促进干细胞体外扩增,移植等新技术在临床的应用创造条件,方法：将FL细胞段cDNA与pProEXFT载体连接,重组体引入大肠菌菌并在异丙基－β－D－硫化半乳糖苷诱导下表达,提取包涵体,经变性,复性等处理,用金属离子螯合层析纯化表达产物,观察纯化所得rhFL刺激CD^ 34细胞的增殖情况,结果：rhFL的表达约占菌体蛋白总量的15％,经亲和纯化纯度达90％以上,rhFL CG-CSF＋Fpo刺激CD34^ 细胞增殖约400倍,结论：获得了rhFL在大肠肝菌中的高效表达,并初步建立了产物纯化途径,纯化后的rhFL具有产强的刺激造血干／祖细胞增殖的能力。