胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2促进组织工程软骨构建的体外实验

背景:软骨组织的再生能力差,软骨组织工程能利用较少的细胞、支架材料和细胞因子对缺损进行修复.目的:观察胰岛素样生长因子1 与转化生长因子β2 联合应用对组织工程软骨形成的影响.方法:用酶消化法获取人软骨细胞,将培养的细胞以4×109 L-1 的细胞浓度接种在藻酸钙凝珠支架上,分别加入200 μg/L 胰岛素样生长因子1 和(或)1 μg/L 转化生长因子β2 进行立体培养.于培养的第3,5,7,9,1,13 天,进行细胞计数,观察软骨细胞的增殖情况.培养2 周后,进行大体形态观察和阿尔新蓝-过碘酸雪夫氏染色(AB-PAS)及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色.结果与结论:细胞计数及免疫组织化学染色显示,胰岛素样生长因子1 和转化生长因子β2 均能促进软骨细胞增殖和软骨相关基质黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,其中胰岛素样生长因子1 的作用主要体现在促细胞增殖方面,而转化生长因子β2 的作用主要体现在促进软骨相关基质形成方面,二者联合应用具有促进组织工程软骨形成的协同作用.     

类胰岛素生长因子Ⅰ在人鼻中隔软骨细胞体外培养中的作用

目的：为加速体外培养的人鼻中隔软骨细胞的增殖，观察类胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）对体外培养软骨细胞的影响。方法：体外培养人鼻中隔软骨细胞，MTT法观察IGF-Ⅰ对软髓细胞增殖的影响；流式细胞仪检测IGF-Ⅰ对软骨细胞周期的影响；斑点杂交法了解IGF-Ⅰ对软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的影响。结果：IGF-Ⅰ浓度大于5ng/ml即可促进体外培养软骨细胞的增殖，缩短软骨细胞增殖周期，有助于Ⅱ型胶原mRNA的合成。结论：IGF-Ⅰ促进人鼻中隔软骨细胞增殖与缩短细胞周期有关，并可能通过促进软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的合成使软骨细胞保持表型稳定。     

胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2促进组织工程软骨构建的体外实验

背景：软骨组织的再生能力差,软骨组织工程能利用较少的细胞、支架材料和细胞因子对缺损进行修复。目的：观察胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2联合应用对组织工程软骨形成的影响。方法：用酶消化法获取人软骨细胞,将培养的细胞以4×109L-1的细胞浓度接种在藻酸钙凝珠支架上,分别加入200μg/L胰岛素样生长因子1和（或）1μg/L转化生长因子β2进行立体培养。于培养的第3,5,7,9,11,13天,进行细胞计数,观察软骨细胞的增殖情况。培养2周后,进行大体形态观察和阿尔新蓝-过碘酸雪夫氏染色（AB-PAS）及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。结果与结论：细胞计数及免疫组织化学染色显示,胰岛素样生长因子1和转化生长因子β2均能促进软骨细胞增殖和软骨相关基质黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,其中胰岛素样生长因子1的作用主要体现在促细胞增殖方面,而转化生长因子β2的作用主要体现在促进软骨相关基质形成方面,二者联合应用具有促进组织工程软骨形成的协同作用。     

转化生长因子β1联合骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞的分化

背景:国内外许多学者成功利用转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化报道较多,而对骨形态发生蛋白2作为诱导因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的报道较少.目的:观察验证转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞下向软骨细胞表型转化的可能性及相互作用.方法:取健康Wistar大鼠骨髓,采用贴壁法筛选获得骨髓间充质干细胞.按添加生长因子的不同分为4组:转化生长因子β1+骨形态发生蛋白2组,转化生长因子β1组,骨形态发生蛋白2组,对照组不添加任何生长因子.于诱导14 d后,分别进行阿利新蓝染色和二甲基亚甲蓝比色法定性定量检测糖胺聚糖的分泌表达,免疫组织化学法检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达.结果与结论:3个加入细胞因子的实验组在阿利新蓝染色和软骨特异性Ⅱ型胶原疫组化法检测中均有不同程度的阳性表达,糖胺聚糖的定量检测中,转化生长因子β1+骨形态发生蛋白2联合应用组的糖胺聚糖含量明显高于其他组(P<0.05).结果提示转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2联合作用更能促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化,分泌软骨特异性基质,有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源.     

骨髓间质干细胞体外分化软骨细胞的实验研究

目的：应用转化型生长因子TGF-β1，体外诱导骨髓间质干细胞（MSCs）向成软骨细胞表型分化，探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法：由大鼠骨髓中分离出MSCs，体外传代培养，取第3代细胞通过TGF-β1、地塞米松和维生素C诱导向软骨细胞分化。诱导后14d观察细胞形态变化，进行阿辛蓝染色检测软骨基质的分泌、免疫组化检测细胞Ⅱ型胶原的表达。采用Western-blot和RT-PCR检测诱导前后成软骨相关的SOX9、蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的表达。结果：诱导后阿辛蓝染色示糖胺聚糖均匀分布于基质中，免疫组化染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性。RT-PCR检测示成软骨相关的SOX9、蛋白聚糖、Ⅱ型腔原mRNA表达阳性。Western-blot印迹检测示细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性。结论：MSCs在特定培养液的诱导下可向软骨细胞表型分化．并能分泌软骨细胞特异性基质．可成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。     

醛固酮与转化生长因子-β1在心肌纤维化中的作用机制

目的探讨醛固酮与转化生长因子-β1（TGF-β1）在心肌纤维化的作用机制。方法将体外培养的心肌成纤维细胞（CFs）分为对照组、醛固酮组、醛固酮＋依普利酮组、依普利酮组及SB431542预处理组。给予相应处理后,ELISA检测TGF-β1水平,RT-PCR检测Smad2、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达。结果与对照组比较,醛固酮处理后,能显著促进TGF-β1分泌,促进Smad2、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达（P〈0.01）;与醛固酮组比较,醛固酮＋依普利酮组TGF-β1分泌、Smad2、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达均明显下降（P〈0.01）;与醛固酮组比较,SB43l542预处理组抑制Smad2、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的差异有统计学意义（P〈0.01）。结论醛固酮通过激活MR促进CFs细胞TGF-β1分泌,激活Smad2,使Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达增加,诱导心肌纤维化。     

Ⅰ型胶原三维立体支架高密度培养软骨细胞的增殖及其分泌功能

目的:观察体外Ⅰ型胶原三维立体支架培养软骨细胞形态、增殖能力及Ⅱ型胶原表达的变化,并与单层培养结果相比较。方法:实验于2004-09/12在中山大学附属第三医院中心实验室完成。选择2周龄健康雄性一级新西兰大白兔1只,体质量0.5kg。体外分离兔双侧股骨髁关节软骨细胞后行单层贴壁培养,细胞铺满单层后,分别将细胞悬液按2×106/L,2×107/L,2×108/L密度传代培养。选择生长状态良好的第2,3代细胞置于Ⅰ型胶原三维立体支架培养。分别通过相差倒置显微镜、流式细胞仪、电镜检查以及组织学染色及免疫组织化学染色,分析软骨细胞的表型、增殖速度等生物学性状变化情况。结果:①单层培养随着时间的延长,增殖速度逐渐减慢,第6代细胞增殖能力较第2代明显下降,出现树突状的细胞突起,表现出细胞老化的趋势。分泌Ⅱ型胶原的能力也逐渐减低,第2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色胞浆内呈阳性反应,至第6代呈阴性。在以低密度传代培养时上述过程出现较快,而以高密度传代培养时软骨细胞形态改变延迟。②在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养时,软骨细胞大量增殖,能维持其细胞表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。扫描电镜观察到软骨细胞成团吸附于支架孔隙网壁,说明支架吸附性良好,与软骨细胞相容性好。结论:软骨细胞在体外单层培养会失去细胞表型,不能分泌Ⅱ型胶原,高密度培养能减缓该过程。而在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养,有利于维持软骨细胞的表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。因此,建议采用在三维立体支架内高密度培养软骨细胞,构建有功能的组织工程软骨。     

Ⅰ型胶原三维立体支架高密度培养软骨细胞的增殖及其分泌功能

目的：观察体外Ⅰ型胶原三维立体支架培养软骨细胞形态、增殖能力及Ⅱ型胶原表达的变化，并与单层培养结果相比较。方法：实验于2004—09／12在中山大学附属第三医院中心实验室完成。选择2周龄健康雄性一级新西兰大白兔1只，体质量0．5kg。体外分离兔双侧股骨髁关节软骨细胞后行单层贴壁培养，细胞铺满单层后，分别将细胞悬液按2&;#215;10^6／L，2&;#215;10^7／L，2&;#215;10^8／L密度传代培养。选择生长状态良好的第2，3代细胞置于Ⅰ型胶原三维立体支架培养。分别通过相差倒置显微镜、流式细胞仪、电镜检查以及组织学染色及免疫组织化学染色，分析软骨细胞的表型、增殖速度等生物学性状变化情况。结果：①单层培养随着时间的延长，增殖速度逐渐减慢，第6代细胞增殖能力较第2代明显下降，出现树突状的细胞突起，表现出细胞老化的趋势。分泌Ⅱ型胶原的能力也逐渐减低，第2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色胞浆内呈阳性反应，至第6代呈阴性。在以低密度传代培养时上述过程出现较快，而以高密度传代培养时软骨细胞形态改变延迟。②在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养时，软骨细胞大量增殖，能维持其细胞表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。扫描电镜观察到软骨细胞成团吸附于支架孔隙网壁，说明支架吸附性良好，与软骨细胞相容性好。结论：软骨细胞在体外单层培养会失去细胞表型，不能分泌Ⅱ型胶原，高密度培养能减缓该过程。而在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养，有利于维持软骨细胞的表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。因此，建议采用在三维立体支架内高密度培养软骨细胞，构建有功能的组织工程软骨。     

基因转染技术提高体内构建组织工程化软骨质量的实验研究

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)cDNA基因转染对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的调控作用,为基因转染技术在软骨组织工程中的应用提供理论依据。方法:利用脂质体Fugene6将含TGF-β1基因的真核表达载体及空白载体分别转染至软骨细胞(基因转染组和对照组),RT-PCR、Northern-Blots、原位杂交及免疫组化检测TGF-β1调节体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原表达的变化。结果:TGF-β1基因转染软骨细胞后,其Ⅱ型前胶原mRNA及其蛋白的表达均显著增强,且随着TGF-β1蛋白表达的丧失,其对软骨细胞Ⅱ型前胶原mRNA表达的促进作用亦逐渐减弱。结论:TGF-β1可以上调体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原的表达。     

银屑病患者皮肤间充质干细胞中表皮生长因子、转化生长因子-β1的表达水平及其意义

目的 观察银屑病患者皮肤间充质干细胞(SMSCs)的形态特征、免疫表型、诱导分化情况及其分泌表皮生长因子(EGF)及转化生长因子-β1(TGF-β1)的水平,尝试探讨银屑病可能的发病机制。方法 选取35例银屑病及35例非银屑病患者设为观察组及对照组,分离、培养2组人群的SMSCs,流式细胞仪鉴定免疫表型,多向分化法鉴定细胞分化功能,ELISA法测定EGF、TGF-β1的表达水平。结果 2组患者的SMSCs形态学特征、免疫表型及诱导分化结果比较相似,观察组SMSCs分泌EGF含量显著高于对照组(P<0.01),TGF-β1含量显著低于对照组(P<0.01),且2种细胞因子的含量高低与患者病情严重程度无相关性(P>0.05)。结论 银屑病患者的SMSCs分泌EGF、TGF-β1的水平异常,可能参与了银屑病的发病机制。     

藻酸钠凝胶三维培养条件下胰岛素样生长因子Ⅰ对兔关节软骨细胞表型的影响

目的:观察胰岛素样生长因子Ⅰ对藻酸盐凝胶三维培养条件下兔关节软骨细胞表型的影响。方法:实验于2004-10/2006-10在上海长海医院血管外科实验室完成。实验材料:4周龄雄性新西兰兔6只。实验方法:利用机械与酶消化的方法获得均一的兔关节软骨细胞,在单层培养条件下将软骨细胞增殖至P2代;将P2代细胞高密度条件下转入藻酸盐凝胶培养介质,进行三维培养。细胞培养分组:①不含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养。②含50μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养组。③单层培养。实验评估:①三维培养细胞于培养的2,4,6周行冰冻切片苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。②单层培养细胞每传代1次行细胞爬片苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果:①细胞学外观形态变化:两组藻酸盐凝胶三维培养体系中的软骨细胞在6周的培养过程中始终保持了圆形的细胞外观。单层培养软骨细胞在第5代以前,均保持了星形及多角形的正常软骨细胞外观。②免疫组织化学显示结果:培养6周后,含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养软骨细胞特异性Ⅱ型胶原细胞仍呈强阳性染色,表达水平较转入三维体系前未见降低,培养细胞保持了良好的分化表型。单层培养软骨细胞在第5代以前,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性。第6代以后,大部分细胞呈梭形,向成纤维细胞转化,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性。结论:胰岛素样生长因子Ⅰ对藻酸盐三维培养条件下的关节软骨细胞表型具有维持作用。     

自组装短肽水凝胶体外三维培养兔关节软骨细胞

背景:自组装短肽是人工设计合成的一类新型纳米生物材料,与软骨细胞复合培养后如能促进细胞基质的分泌,细胞分裂增殖及细胞表型的维持,将有可能成为一种较理想的细胞支架应用在软骨组织工程中。目的:观察兔关节软骨细胞在纳米自组装短肽KLD-12水凝胶中三维培养的生物学特性。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-04在四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所实验室完成。材料:纳米短肽KLD-12序列为:Ac-KLDLKLDLKLDL-CONH2,由上海波泰生物公司合成。方法:取新西兰兔关节软骨,通过酶消化法获取软骨细胞,体外培养2代后以5×109L-1的密度接种于4g/L的自组装短肽KLD-12溶液中,用磷酸盐缓冲液诱导成胶后进行三维培养。主要观察指标:①通过倒置相差显微镜观察软骨细胞在纳米短肽水凝胶中的形态。②用甲苯胺蓝染色,免疫组化检测细胞外基质分泌情况。③反转录-聚合酶链反应检测软骨细胞黏多糖、前Ⅱ型胶原、前Ⅰ型胶原基因的表达情况。结果:①兔关节软骨消化分离的软骨细胞成活率达95%以上。②软骨细胞在纳米短肽水凝胶中体外培养时,细胞生长旺盛、增殖活跃,细胞为圆形聚集成团状或岛状,细胞团周围有类似的软骨陷窝形成。③甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性,细胞基质中黏多糖、Ⅱ型胶原含量随培养时间延长逐渐增加。④反转录-聚合酶链反应结果显示软骨细胞在纳米短肽水凝胶经过3周体外培养一直保持了分泌黏多糖及表达Ⅱ型胶原的能力。结论:自组装短肽KLD-12三维水凝胶能较好维持软骨细胞正常形态、功能和增殖能力。     

低强度脉冲超声介导威灵仙干预兔膝关节软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原和转化生长因子β1的表达

背景：研究显示威灵仙可促进软骨细胞增殖,维持和促进软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原;低强度脉冲超声能有效促进软骨细胞增殖、提高细胞膜的通透性,促进药物或基因的传递,从而提高药物的生物学效应。目的：观察低强度脉冲超声介导威灵仙对体外培养的兔膝关节软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原及转化生长因子β1表达的影响,探讨低强度脉冲超声介导威灵仙在软骨损伤修复中的作用及机制。方法：体外分离培养兔膝关节软骨细胞,取处于对数生长期的2代细胞,随机分为4组：对照组,低强度脉冲超声组,威灵仙组,威灵仙＋低强度脉冲超声组,干预3 d后分别采用CCK-8比色法检测软骨细胞增殖情况,细胞化学染色法分析Ⅱ型胶原分泌情况及Western blot检测转化生长因子β1的表达情况。结果与结论：干预培养3 d后,与对照组比较,其他3组细胞数量均显著增加（P〈0.05）,威灵仙＋低强度脉冲超声组细胞数量最多;威灵仙＋低强度脉冲超声组软骨细胞Ⅱ型胶原表达面积、吸光度值均显著大于对照组（P〈0.05）,且其差值大于低强度脉冲超声组、威灵仙组与对照组差值之和;威灵仙＋低强度脉冲超声组转化生长因子β1表达水平显著,其相对灰度值显著高于其他各组（P〈0.05）。结果提示低强度脉冲超声、威灵仙均可促进体外培养兔膝关节软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原、转化生长因子β1的分泌,二者联用具有一定的协同作用。     

转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化

背景:转化生长因子β1是关节软骨组织工程研究的首选生长因子,适当浓度能刺激关节软骨细胞增殖、分裂和分化.目的:建立含有转化生长因子β1的特殊诱导体系培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的能力,观察诱导后的细胞形态及表型变化.方法:于兔胫骨结节内侧抽取骨髓,采用贴壁培养法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞行流式细胞仪检测鉴定其表面抗原,以含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下对第3代骨髓间充质干细胞诱导培养21 d,诱导后与人鼻中隔软骨细胞进行比较.采用免疫组织化学法对Ⅱ型胶原进行定性检测.结果与结论:贴壁培养法可分离并纯化兔骨髓间充质干细胞,所得第3代骨髓间充质干细胞表面抗原CD44 阳性,CD34、CD45 阴性.经诱导培养21 d后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示可见阳性细胞.提示含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下,骨髓间充质干细胞可以转化为软骨细胞,且与正常软骨细胞无明显差异.     

携带人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的重组腺病毒体外转导培养关节软骨细胞

目的:胰岛素样生长因子Ⅰ通常被认为是软骨生长和稳定中最关键的生长因子之一,可以促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖.应用携带人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的重组腺病毒(Adenovirus-human insulin like growth factor-Ⅰ transgene construct,Ad-hIGF-Ⅰ)体外转导培养关节软骨细胞,探讨其在体外促进软骨细胞外基质成分生成的能力.方法:实验于2005-01/2007-04在大连医科大学附属四院骨科实验室完成.分离培养3周龄兔膝关节及股骨头软骨细胞,将受测细胞随机分为转导组与未转导组,以500感染复数的Ad-hlGF-I转导第1代软骨细胞,转导组中的第1,3,5,7代细胞分别为转导后48 h,3周,7周和9周的软骨细胞.采用样本碱水解法、阿利新蓝法和酶联免疫吸附方法检测转导组和未转导组的第1,3,5,7代细胞羟脯氨酸、糖胺多糖、胰岛素样生长因子I蛋白浓度.结果:①倒置显微镜观察,转导组兔关节软骨细胞生长增殖稳定,至第7代仍旧以三角形、梭形及纺锤形细胞为主,偶见长梭形和树根形细胞,且轮廓清晰,透亮度大,折光性强;而末转导组细胞培养至第4代时即己出现长梭形细胞,自第5代细胞形态几乎全部变成长梭形.②随着培养时间延长和传代次数增加,软骨细胞上清液中胰岛素样生长因子I蛋白、羟脯氨酸和糖胺多糖浓度的逐渐降低,转导组软骨细胞均高于同代未转导组细胞(P<0.05).结论:携带人胰岛素样生长因子I基因的重组腺病毒体外转导的关节软骨细胞,可以稳定产生内源性的胰岛素样生长因子I,并进而促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和蛋白多糖.     

结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型的影响

背景:在关节软骨损伤修复的过程中,由于目前实验室中常用的细胞因子存在半衰期短、价格昂贵等缺点,不能广泛应用于临床.目的:假设结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型有一定的影响,为组织学方法修复关节软骨缺损寻找新的细胞因子.设计、时间及地点:随机区组设计对照实验,于2007-08/2008-02在深圳龙岗中心医院完成.材料:健康1月龄新西兰大白兔2只:结缔组织生长因子为Propetech公司产品.方法:获取兔关节软骨组织,将其剪碎,Ⅱ型胶原酶消化法原代分离培养兔关节软骨细胞,待细胞铺满瓶底80%胰酶消化传代,取其第2代,细胞贴壁后随机分组,实验组分别加入30,50,100,150 μ g/L的结缔组织生长因子,对照组仅加入DMEM培养液进行体外培养.主要观察指标:采用倒置相差显微镜下观察细胞形态及数量改变,采用四唑盐(MTT)法检测不同浓度的结缔组织生长因子对软骨细胞增殖的影响,免疫组织化学法(SABC法)检测Ⅱ型胶原的表达情况.结果:①结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞生长迅速,呈典型的软骨细胞形态,部分细胞聚集成团,形成软骨结节.②结缔组织生长因子能显著促进兔关节软骨细胞增殖,与对照组相比差异具有显著性意义(P<0.01).不同质量浓度的结缔组织生长因子均能促软骨细胞增殖,100μg/L为最佳作用质量浓度(P<0.01).③结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达增多,且始终为阳性.结论:结缔组织生长因子可以刺激体外培养的兔关节软骨细胞增殖,促进软骨特异性Ⅱ型胶原表达,维持软骨表型.结缔组织生长因子可能用来作为组织工程学修复软骨缺损,治疗骨关节炎的新的生长因子.     

转化生长因子β2诱导鼠脂肪间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞成骨和成软骨的促分化作用已被广泛证实.目的:假设转化生长因子β2可在体外诱导鼠脂肪间充质干细胞向成软骨细胞分化,实验拟验证其可行性.设计、时间及地点:体外细胞学实验,于2007-03/11在北京大学第三医院中心实验室完成.材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,用于分离培养脂肪间允质干细胞.方法:取第2代脂肪间充质于细胞,通过10μg/L外源性转化生长因子β2以离心管内微团培养、单层培养两种方式向软骨细胞进行诱导分化,培养3周.对照组单纯加入基础培养液.主要观察指标:两种湾导方式下细胞(团)形态结构的变化、Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果、软骨细胞特异性基因Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达.结果:微团培养诱导的脂肪间充质干细胞组织块经苏木精.伊红染色显示在组织内部形成类似软骨陷窝样结构,阿尔新蓝染色呈强阳性,Ⅱ型胶原免疫组化结果显示有棕褐色强阳性颗粒,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA的表达.单层培养诱导的脂肪间充质干细胞无细胞外软骨基质分泌,未发现Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan mRNA的表达.结论:在离心管内微团培养方式下,转化生长因子β2可以启动或促进脂肪间充质干细胞的软骨分化,且分泌软骨细胞特异性基质.简单的单层培养方式诱导失败.     

转化生长因子β3诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景: 转化生长因子β是一族多肽类生长因子,胚胎形成期可诱导原始的间充质干细胞分化形成软骨组织,有研究报道转化生长因子β3和碱性成纤维细胞生长因子可促进软骨细胞的代谢和增殖.目的: 验证转化生长因子β3体外诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的可行性.方法: 骨髓来源于髋关节手术时的松质骨碎片或于下肢骨开放性手术时收集,分离培养骨髓间充质干细胞,鉴定其表面抗原,用含体积分数10%胎牛血清以及10μg/L转化生长因子β3的条件培养基诱导,诱导后细胞通过软骨细胞特征性染色,即甲苯氨蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定.结果与结论: 骨髓间充质干细胞表面抗原CD73,CD90,CD105阳性,CD14,CD34,CD45,CD106以及HLA-DR阴性.诱导后细胞形态明显改变,甲苯氨蓝以及Ⅱ型胶原染色结果阳性.提示骨髓间充质干细胞在转化生长因子β3作用下,体外可分化为软骨细胞,可以作为组织工程种子细胞的一种有效来源.     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用

背景:近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相瓦作用的报道.目的:观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用.方法:获取脂肪来源间充质干细胞,以2×10~5 cells/cm~2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞.2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况.RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9mRNA的表达.结果与结论:加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色.RT-PCR检测显示胰岛索样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义.提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用.     

TGF-β1和IGF-1对人骨髓基质干细胞体外增殖和分化的影响

目的探讨转化生长因子β1（TGF-β1）和胰岛样细胞生长因子-1（IGF-1）对人骨髓基质干细胞（BMSC）体外增殖、分化的影响。方法8份标本分两组,每组4份,抽取骨髓,分离基质干细胞,体外连续传代培养,A组为基础培养液,B组加入TGF-β1和IGF-1,观察细胞生长情况及形态特征,阿新蓝染色,Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果B组细胞增殖速度及形态变化均较A组加快。阿新蓝染色：原代细胞阴性;传代细胞,A组淡染或阴性,B组呈蓝色;Ⅱ型胶原mRNA表达：A组未检出,B组阳性。结论TGF-β1和IGF-1在体外可诱导人BMSC分化为软骨样细胞,但同时其增殖能力减弱。