Ⅱ型登革病毒非结构蛋白1特异性T细胞系的构建和特征分析

目的 构建Ⅱ型登革病毒(DENV2)非结构蛋白1(NS1)特异性T细胞系,分析其抗原特异性、表型特征和细胞因子分泌能力.方法 NS1蛋白与弗氏佐剂乳化后腹腔注射免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞分离T细胞,加入丝裂霉素C预处理的同系小鼠单核细胞和NS1蛋白,体外循环间歇刺激和有限稀释培养获得DENV2 NS1特异性T细胞,MTT法分析其抗原特异性,流式细胞术分析其表型特征,ELISA法分析其细胞因子分泌能力.结果 共获得9株DENV2 NS1抗原特异性的T细胞,其纯度和活细胞率均大于95%;与胎牛血清刺激培养比较,该抗原特异性T细胞在NS1特异性刺激和植物血凝素非特异性刺激下均明显增殖(t=6.2780,P<0.05;t=5.1176,P<0.05),而在DENV2 E非特异性刺激下无明显变化;与同系小鼠T细胞比较,九株NS1特异性T细胞均高表达死亡配体分子FasL(t=30.3652,P<0.05);培养6 h和12 h时,NS1特异性T细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α浓度均明显升高;其中IFN-γ浓度升高最显著,6 h时达到峰值[(348.2±53.4)pg/ml],TNF-α浓度在培养24 h时仍维持在较高水平[(23.2±1.2)pg/ml],而同系小鼠T细胞培养上清中上述细胞因子浓度均无明显变化.结论 成功构建了DENV2 NS1特异性T细胞系,为进一步研究NS1蛋白介导的细胞免疫应答在登革病毒所致疾病中的作用奠定了一定基础.     

自身免疫性肝炎患者可溶性肝抗原特异性T淋巴细胞反应特点及其临床意义

目的 分析评价AIH患者SLA特异性T淋巴细胞反应特点.方法 用化学法人工合成SLA序列多肽段作为刺激肽,刺激31例AIH患者(SLA/LP抗体阳性10例,SLA/LP抗体阴性21例)、30例PBC患者、29例病毒性肝炎患者和30名健康人中PBMC,使其分泌干扰素γ(IFN-γ),并采用ELISpot方法观察各组SLA肽特异性T淋巴细胞反应特点.结果 31例MH患者中18例患者PBMC对SLA肽库刺激可诱导分泌IFN-γ,其阳性率58.06%(18/31),PBC、病毒性肝炎患者、健康人阳性率分别为3.33%(1/30)、3.45%(1/29)、0.00%(0/30),AIH患者PBMC受SLA肽库刺激分泌INF-γ阳性率明显高于PBC、病毒性肝病患者及健康人(x2值分别为21.295、20.655、15.988,P均＜0.01).18例AIH患者反应单肽位于SLA中8个抗原簇,包括aa1～44、aa57～132、aa129～180、aa177～196、aa 193～244、aa241～268、aa281～308、aa321～428;平均识别SLA序列单肽宽度为6(2～17)条,显示多克隆性.18例呈阳性反应的AIH患者中14例患者在采集PBMC同时进行肝功能检测,该14例患者识别SLA序列单肽的反应宽度与谷草转氨酶(AST)对数值呈正相关(r=0.539,P＜0.05).结论 SLA肽库可诱导AIH患者外周血PBMC分泌IFN-γ,其反应呈多克隆性,反应宽度间接反映患者肝脏炎症活动程度.     

HIV合并HBV/HCV感染患者外周血T细胞亚群的变迁

目的了解HIV合并HBV、HCV感染患者外周血T细胞亚群的变化特征,探讨HIV合并HBV和HCV感染后患者的免疫功能。方法采用三色流式细胞学检测技术,对26例HIV合并HBV和HCV感染患者(合并感染组)、35例单纯HIV感染患者(单纯感染组)和194例健康人群(健康对照组)外周血总T细胞、T4细胞、T8细胞含量进行测定并计算T4/T8比值。结果单纯感染组患者外周血总T细胞、T4细胞、T8细胞的百分含量和T4/T8比值分别为66.42±4.11、27.74±2.34、47.72±3.86和0.74±0.19,合并感染组分别为54.76±3.42、22.31±1.87、58.23±4.62和0.33±0.12,健康对照组值分别为69.98±5.79、35.25±5.16、25.08±4.34和1.45±0.28单纯感染组患者T4细胞和T4/T8比值明显低于健康对照组(P<0.05,P<0.01),T8细胞较对照组明显升高(P<0.05);合并感染组总T细胞、T4细胞和T4/T8比值明显低于健康对照组和单纯感染组(P<0.05,P<0.01),T8细胞较健康对照组和单纯感染组明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论 HIV感染患者合并HBV和HCV感染将进一步加重体内免疫功能的紊乱;检测外周血T细胞亚群有利于HIV、HBV和HCV多重感染患者的鉴别诊断、病情监测以及预后判断,是一项十分有效的客观依据。     

特异性细胞因子对T辅助17细胞和T调节性细胞表达的调节作用

目的 探讨多种细胞因子包括转化生长因子β(TGF-β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素2(IL-2)对CD+4T淋巴细胞的分化调节作用.方法 将人外周血T淋巴细胞、鼠脾脏T淋巴细胞在不同的刺激条件下进行体外培养,采用流式细胞仪分析活化T淋巴细胞中CD+4IL-17+T辅助17细胞(Th17细胞)、C+4IL-17+T淋巴细胞、CD+4CD+25FOXP+3T调节性细胞(Treg细胞)的表达情况.结果 鼠脾脏T淋巴细胞培养液中有TGF-β存在时可促进Treg细胞、rh17细胞和CD+8;IL-17+T淋巴细胞分化,表达水平分别为(7.8±2.2)%、(12.6±3.1)%、(10.1±2.6)%.无细胞因子培养的同类细胞为实验对照组,表达水平分别为(4.8±0.6)%、(1.7±0.5)%、(1.0±0.4)%,差异均有统计学意义(q=4.09、8.80、9.61,P<0.05或P<0.01).TGF-β与IL-6细胞因子共同存在时可促进Th17和CD+8IL-17+T淋巴细胞分化,表达水平分别为(17.8±5.3)%、(15.0±4.2)%,而分化受抑制的Treg细胞的表达水平为(4.I±1.2)%,与TGF-β组同类细胞表达水平比较差异均有统计学意义(q=5.03、5.17、5.04,P均<0.01).在TGF-β刺激的T淋巴细胞中加入IL-2细胞因子可使Th17细胞、CD+8;IL-17+T淋巴细胞表达减少,同时伴有Treg细胞表达量的增加;在加入抗IL-2后结果相反,即Th17细胞、CD+8IL-17+T淋巴细胞表达水平增加,Treg细胞表达水平减少.人外周血T淋巴细胞上Th17、CD+8IL-17+、Treg细胞表达水平变化趋势与鼠脾脏淋巴细胞相似.结论 不同细胞因子对于调控Th17细胞和Treg细胞之间的平衡起着十分重要的作用.     

HCV包膜蛋白E2的B细胞抗原模拟表位的筛选、重组表达与抗原性鉴定

目的　采用蛋白质 /多肽递呈技术对HCV包膜蛋白E2进行模拟表位研究。方法　通过使用E2蛋白结合血清中的抗 E2 ,筛选M1 3噬菌体构建的随机肽库 ,寻找E2区蛋白的模拟表位 ;用大肠杆菌硫氧还蛋白作为骨架 ,在其活性部位以“内融合”形式重组表达该模拟表位 ,用HCV感染者血清验证重组蛋白的抗原性。结果　寻找到一个E2区蛋白的模拟表位 ,可能为E2蛋白的构象性表位。结论　本实验为研究HCV外膜蛋白E2抗原表位水平的特异诊断试剂的研制、疫苗的设计提供依据     

丙型肝炎病毒NS5a区血清型特异性多肽的选择及应用

目的:从HCV非结构5a区(NS5a)选出基因型特异性多肽,并应用酶免疫法(EIA)进行HCV血清分型。方法:根据HCV NS5a高免疫源区(2182～2343)的氨基酸序列,设计并合成305个特异性多肽,应用已知基因1～6型的抗-HCV阳性血清,通过EIA法检测每个多肽的抗原性,并用基因型特异性多肽进行血清分型,同时将其与序列分析法基因分型结果进行比较。结果:不同基因型间NS5a区氨基酸的同源性较低,相同基因型不同区段氨基酸的同源性也很低。对305个特异性多肽抗原性检测结果表明,主要线性抗原区位于氨基酸残基R3、R7和R9区。18个来自保守区的多肽可与不同基因型抗-HCV阳性血清反应;12个多肽具基因型特异性。血清基因分型结果与基因分型的结果高度一致。结论:HCV NS5a高免疫源区存在主要的线性抗原;来自高度保守区的多肽抗原无基因型特异性,可用于HCV抗体检测;基因型特异性多肽可用于HCV基因分型,特别适用于HCV RNA阴性患者。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对环加氧酶2表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒基因组产物对环加氧酶2(COX-2)表达的影响。方法将带有COX-2基因启动子的报告质粒分别与10种表达丙型肝炎病毒基因组的单个基因的质粒共转染Huh7细胞,并测定荧光色素酶的活性,采用反转录PCR和Western blot检测COX-2的mRNA和蛋白表达的变化,酶联免疫吸附试验检测前列腺素E2含量的改变,探讨这些丙型肝炎基因组产物与COX-2基因启动子之间的相互作用。结果在所有10个基因组产物中,非结构蛋白NS3能够显著地激活COX-2基因启动子的活性,并在mRNA和蛋白水平上调COX-2的表达。而且这种激活作用呈剂量依赖性,前列腺素E2的分泌量随着NS3蛋白表达量的增加而增加。结论 NS3蛋白能功能性地激活COX-2的表达。     

MHC五聚体方法检测基因疫苗体外诱导的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞

目的 探讨MHC五聚体方法检测在体外用抗B细胞淋巴瘤基因疫苗(简称基因疫苗)刺激PBMC生成抗原特异性CTL的效率.方法 用于细胞培养的4份血液标本来自2例B淋巴细胞肿瘤患者(1例为滤泡性淋巴瘤患者,另1例为毛细胞白血病患者)和2名健康对照者.分别检测上述标本中PBMC受基因疫苗刺激后CTL生成情况.PBMC贴壁培养获得DC前体,在重组细胞因子GM-CSF和IL4的支持下诱导培养DC,采用基因枪方法将基因疫苗质粒导入DC,RT-PCB方法检测转染后细胞IgHV1-GM-CSF mRNA的转录,ELISA方法检测细胞因子GM-CSF的表达,并验证转染是否获得有效表达.转染后的DC再与从PBMC中获得的淋巴细胞共培养,诱导抗原特异性的CTL;共进行2次DC刺激,共计培养24 d,分别在培养前、培养第7天、第17天及第24天收获培养细胞,培养分为转染基因疫苗组和转染对照质粒组,流式细胞术分析培养细胞中CD3+ CD8+细胞亚群的水平;用针对基因疫苗抗原肽抗原表位的MHC五聚体荧光抗体检测CTL产生水平.结果 基因枪颗粒轰击方法转染DC后,RT-PCR结果显示转染得到了表达;转染基因疫苗组的DC中GM-CSF含量为(28±6)ng/106个细胞,而转染对照质粒组的DC中GM-CSF含量为(10±3)ng/106个细胞,差异有统计学意义(t=5.191,P<0.01).分析培养后的T淋巴细胞亚群,显示随着培养时间的延长,CD3+CD8+细胞亚群比例明显增加,转染对照质粒组在培养前、培养第7天、第17天和第24天的比例分别为(34.24±2.72)%,(46.06±3.08)%,(65.34±4.26)%,(73.86±4.85)%,而在转染基因疫苗组,其比例分别为(32.28±2.08)%,(45.32±3.81)%,(63.37±4.21)%,(75.01±3.20)%.两因素方差分析显示培养不同时间点的CD3+CD8+细胞亚群比例差异有统计学意义(F培养时间=176.966,P<0.01),但转染因素本身对其产生的影响差异无统计学意义(F转染因素=0.657,P>0.05).MHC五聚体检测结果显示转染基因疫苗组的DC能够诱导针对该表位的抗原特异性CTL产生,CTL水平随着DC的刺激逐渐增高;在培养第24天,健康对照者最高获得2.03%的CTL,滤泡性淋巴瘤患者的CTL达4.36%,而毛细胞白血病患者为3.89%.结论 MHC五聚体方法能够有效检测基因疫苗诱导的抗原特异性CTL;该方法对于抗肿瘤细胞免疫的检测、肿瘤患者的细胞免疫状态及早期预后判定可能是一项有前景的临床检验方法.     

丙型肝炎病毒(HCV)NS3抗原检测方法的建立与临床应用

用基因工程表达的丙型肝炎病毒 ( HCV) NS3蛋白 ,制备兔抗 - HCV NS3抗体 ,建立检测 HCVNS3抗原的 EL ISA法。该法特异性好 ,批内和批间 CV分别为 5.4%～ 8.9%和 7.8%～ 9.8% ,临床检测结果表明 :60例慢性丙型肝炎患者 ;30例抗 - HCV- Ig G合并 Ig M阳性病人 ;2 50例抗 - HCV- Ig G病人 ;2 0 0例透析病人 ;2 0例白血病病人 ;1 50例普通病人 ;30 0例供血员中 HCV NS3抗原阳性检出率分别为1 3.3% ,2 3.3% ,1 0 .4% ,3.0 % ,5.0 % ,2 .6% ,1 .0 %。结果显示 NS3抗原的检测 ,可作为一种新的方法 ,能更好地反映患者体内 HCV的感染情况     

献血者血清中HCV NS3和核心蛋白抗原的检测及临床意义

丙型肝炎病毒(HCV)主要经血液传播, 目前尚无预防疫苗,阻断其传播的主要手段为用抗-HCV试剂检测筛查献血者血及血液制品.然而,抗-HCV-IgG阳性并不能判断献血者或病人是否携带HCV,抗-HCV 抗体阴性者体内仍有可能带有HCV,所以输血后丙型肝炎仍有一定的发生率.笔者利用基因工程表达的HCV NS3蛋白及核心蛋白免疫小鼠所制备的单克隆抗体,建立了检测HCVNS3和核心蛋白的ELISA法,旨在更好地判断献血者和病人的HCV携带情况,减少输血后肝炎的发生.     

丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定研究

目的构建含丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体,为C蛋白与宿主蛋白相互作用机制研究奠定基础。方法聚合酶链反应(PCR)法扩增HCV 1b基因型C蛋白基因,经EcoR I和Pst I双酶切后插入到诱饵载体pGBKT7中,构建含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Core,经酶切分析及核酸测序分析加以鉴定。醋酸锂法将pGBKT7-Core转化入酵母菌株Y2HGold,蛋白印迹法检测C蛋白的表达,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母细胞的毒性作用及对报告基因的激活作用。结果重组质粒pGBKT7-Core中的C蛋白基因为576 bp,经核酸测序分析与NCBI中注册的HCV 1b基因型C蛋白基因序列一致;转化酵母菌后检测到C蛋白的表达;HCV C蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性,且对报告基因无激活作用。结论含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体构建成功,表达稳定。     

用酶联免疫夹心法测定肝炎患者血清丙型肝炎抗原

目的建立血清中丙肝病毒NS3抗原（HCAg-NS3）的酶免检测方法。方法以特异性强、敏感度高、识别不同HCAg-NS3抗原表位的HCAg-NS3单克隆抗体和高效价的纯化抗-HCV分别作为包被抗体和酶标记抗体，采用夹心ELISA法测定血清中HCAg-NS3抗原。结果优化了酶免疫反应条件；该方法对HCAg-NS3的最低检测限为1—2ng／ml；批内（n=13）及批间（n=3）变异系数（CV）分别为4．51％和5．64％；对52例抗-HCV阳性血清测定HCAg-NS3抗原的检出率为21．2％，对15例HCAg-NS3阳性标本测定HCV RNA的检出率为60％，1350例抗-HCV阴性的其他类型肝炎患者血清标本中，HCAg-NS3检出率为1．7％，50例正常人血清标本的HCAg-NS3抗原测定结果均为阴性。结论该方法敏感性较高，特异性、重复性和稳定性均良好，可以作为早期诊断HCV感染的有效方法。     

丙型肝炎病毒NS3区优势表位基因的克隆和高效表达研究

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的Ｃ３３ｃ基因编码蛋白是ＨＣＶ抗体检测中所需的重要抗原。应用打点杂交法得到了来源于３例病人的８个Ｃ３３ｃ的克隆，并从中挑选出能在大肠杆菌中高效表达的克隆─—ｐＫＨ２６。该重组质粒中的插入片段与ＨＣＶ－Ｊ的核苷酸同源性为９２．６％，所编码氨基酸的同源性为９５．９％，属于中国主要的ＨＣＶ流行株，它可通过温度变化这种简单、方便、经济的方式进行诱导表达，得到以天然蛋白形式存在的具有良好免疫学活性的表达产物，表达蛋白产量可占整个细菌蛋白的１５％以上。由于不含有融合蛋白，用于抗－Ｃ３３ｃ的检测特异性高，是建立诊断ＨＣＶ感染方法的良好原材料。     

HCV RNA对HIV合并HCV感染者高效抗逆转录病毒治疗的影响

目的 探讨HCV RNA对HIV和HCV合并感染者接受高效抗反转录病毒治疗(highlyactive antiretroviral therapy,HA.ART)后疗效、肝脏功能和血脂的影响.方法 招募我国河南既往有偿供血人群中接受HAART治疗的HIV/HCV合并感染者275例,每6个月随访一次,定期检测HCVRNA、HIV RNA、CD+4T淋巴细胞计数、肝脏功能指标和血脂等实验室指标,采用卡方检验、成组设计秩和检验比较HCV RNA阳性组和HCV RNA阴性组HAART治疗后HIV病毒抑制率、免疫学应答、肝损伤和血脂的差异.结果 HAART治疗6月以上患者中,HCV RNA阳性组和HCV RNA阴性组HIV完全抑制率差异无统计学意义(45.6%vs.38.5%,x2=1.150,P>0.05);HAART治疗前(286个/μ1 vs.209个/μ1,z=0.734,P=0.463)、治疗后6个月(310个/μ1 vs.362个/μ1,z=0.562,P=0.574)、12个月(378个/μl vs.289个/μ1,Z=1.091,P=0.275)、18个月(363个/μ1 vs.288个/μ1,z=1.435,P=0.151)、24个月(413个/μ1 vs.348个/μ1,z=0.939,P=0.348)CD+4;T淋巴细胞计数在HCV RNA阳性组和HCV RNA阴性组间差异无统计学意义.HCV HNA阳性组血清ALT(55.0 U/L vs 29.5 U/L,Z=6.789,P<0.01)、AST(46.0 U/L vs.33.0 U/L,Z=4.890,P<0.01)、TBIL(9.3 mmol/L vs.7.2 mmol/L,z=3.748,P<0.01)水平显著高于HCV RNA阴性组;HCV RNA阳性组HAART治疗后发生肝损伤的风险显著高于HCV RNA阴性组(调整后优势比aOR=3.8,P<0.01).HIV/HCV合并感染者HCV RNA阳性组TG水平显著低于HCV RNA阴性组(1.2 mmol/Lvs.1.4 mol/L,Z=1.936,P=0.043)、而HDL-C水平显著高于HCV RNA阴性组(1.5 mmol/L vs.1.3 mmol/L,z=2.251,P=0.024).结论 HCV RNA对HIV/HCV合并感染者HAART治疗后HIV病毒抑制率无影响,亦不影响HAART治疗后CD+4淋巴细胞的恢复;HCV RNA是HIV/HCV合并感染者HAART治疗后肝损伤的独立危险因素,但可能减轻HAART治疗引起的血脂异常.     

他汀类药物在糖尿病患者心血管事件一级预防中的新证据和新指南

大量的循证医学证据证实了他汀类药物的心血管事件二级预防作用。但是,他汀类药物在心血管事件一级预防中患者是否获益目前仍有争论。糖尿病本身是冠心病的等危症,无心血管疾病的糖尿病患者使用他汀类药物进行心血管事件一级预防应视为非糖尿病患者的二级预防。如此推论,糖尿病患者使用他汀类药物进行心血管事件一级预防应该获得肯定。临床真实情况是否如此？近期陆续发表的一些研究,用部分临床研究证据对其进行了初步的分析和探索。     

献血者HCV RNA实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立快速检测献血者中丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的方法。方法利用体外转录制备的HCV RNA转录体进行病毒RNA抽提方法及抽提效率的比较;将RNA转录体与正常血清进行不同数目的混合,对最佳混合标本数进行了摸索;建立HCV荧光定量PCR方法(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR),并对献血者进行混合标本HCV核酸检测。结果确定了比较理想的病毒RNA抽提方法;用于HCV核酸检测的混合标本数为24例;建立的荧光定量PCR方法能最低检测出10个copies/ml;采取24例混合血标本方法,FQ-PCR检测HCV RNA,576例ELISA检测HCV阴性的献血者未检测出HCV RNA。结论初步建立了献血者HCV感染的混合标本荧光定量PCR检测方法。     

丙型肝炎患者T细胞CD28表达的探讨

目的 探讨丙型肝炎病毒携带者外周血T淋巴细胞上的CD28表达在丙型肝炎病毒感染免疫耐受机制中的作用。方法 采用流式细胞技术（FCM）用三色标记法检测40例丙肝患者和30例正常人群外周血T细胞CD28的表达。结果 丙肝患者外周血中CD28^＋CD8^＋的表达显著高于正常健康对照组，CD8^＋，CD28^＋CD8^＋T细胞则显著低于正常健康对照组。结论 CD28对丙肝患者的免疫功能及愈后判断有一定的意义。     

丙型肝炎患者T淋巴细胞亚群及调节性T细胞的变化研究

目的研究丙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群和免疫调节T细胞在病程发展中的变化。方法采用流式细胞术（FCM）检测丙肝患者RNA高拷贝组、低拷贝组、RNA阴性组及健康对照组外周血CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋及CD4^＋CD25^＋CD127^＋调节T细胞百分率,分析其在丙型肝炎病程中的变化。结果丙型肝炎患者CD4^＋T细胞降低,CD8^＋T细胞升高,CD4^＋／CD8^＋降低,患者组与对照组差异均有统计学意义（P〈0．05）;RNA阴性组和低拷贝组调节性T细胞（CD4^＋CD25^＋CD127^＋）与正常对照组明显偏高（P〈0．05）,RNA高拷贝组与对照组无明显统计学差异（P〉0．05）。结论在丙型肝炎病程发展过程中T淋巴细胞亚群均发生变化且有调节性T细胞的增高,说明细胞免疫及调节机制参与了丙型肝炎的发病及发展,为临床诊疗提供了新的思路。