骨形态蛋白2诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的 观察骨形态蛋白2体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)定向分化为心肌样细胞的作用.方法 采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs,取第4代BMMSCs进行诱导:骨形态蛋白2组(BMP-2,终浓度为10 μg/L),空白对照组.诱导24h后更换常规培养液继续培养4周.倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后BMMSCs中心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的表达,Western Blot检测诱导2周和4周后Cx43以及cTnI的表达量,流式细胞计数法计算心肌样细胞诱导分化率.结果 原代培养的BMMSCs 2周形成集落,呈梭形或星形.传代细胞体积变大,诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长,并出现肌岛样结构.免疫荧光染色结果显示诱导后BMMSCs表达cTnI.Western Blot检测结果提示诱导后Cx43以及cTnI均明显增多,4周组明显高于2周组.流式细胞计数法显示:BMP-2组心肌样细胞诱导率为(17.9±0.8)％.结论 骨形态蛋白2可在体外诱导大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化率高.     

P53抑制剂诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的研究P53特异性抑制剂对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞分为对照组(CON)和P53特异性抑制剂(PFT-α)组。观察骨髓间充质干细胞诱导前后细胞形态变化,流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原及诱导后心肌样细胞分化率,免疫荧光法检测诱导后cTnI、CX-43表达,Western Blot法测定诱导后cTnI、P53、P21蛋白表达情况。结果原代培养的骨髓间充质干细胞2周形成集落,传代诱导后细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞表面抗原CD44阳性表达率为(89.98±1.29)%,CD45阳性表达率为(2.14±0.22)%。心肌样细胞鉴定结果显示:诱导后1周,空白对照组未见cTnI和CX-43免疫荧光表达,PFT-α组少量表达cTnI和CX-43;诱导后4周时,可见空白对照组少量表达cTnI和CX-43,PFT-α组强表达cTnI和CX-43。WesternBlot检测诱导1周时PFT-α组cTnI表达与对照组比较,有统计学差异(P<0.01)。诱导后4周,PFT-α组cTnI表达与对照组比较,有统计学差异(P<0.01)。两组cTnI表达量4周与1周比较有统计学差异(P<0.05)。诱导1周时,PFT-α组几乎不表达P53蛋白,PFT-α组与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。诱导4周时,PFT-α组与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。PFT-α组诱导4周时P53、P21表达量与1周时比较均有统计学差异(P<0.05)。心肌细胞分化率结果显示,诱导4周时,PFT-α组与空白对照组比较有统计学差异(P<0.01)。结论通过P53特异性抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

P53特异性抑制剂PFT-α诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：最新研究表明,P53可通过阻断P53-P21蛋白通路,显著提高干细胞分化率。而5-氮杂胞苷主要通过激活P53-P21蛋白通路,抑制细胞增殖,导致细胞凋亡。目的：观察P53特异性抑制剂PFT-α对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法：分离SD大鼠骨髓间充质干细胞进行培养、传代,取第4代细胞分为4组,正常对照组、PFT-α组、5-氮杂胞苷组及PFT-α＋5-氮杂胞苷组。结果与结论：原代培养的骨髓间充质干细胞传代诱导后细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。当PFT-α浓度≤20μmol/L时,能减少骨髓间充质干细胞凋亡。心肌样细胞鉴定结果显示,诱导后4周时,可见正常对照组少量表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43,其余3组均强表达。心肌细胞分化率结果显示,诱导4周时,PFT-α组和5-氮杂胞苷＋PFT-α组显著高于5-氮杂胞苷组。Western Blotting检测结果示,诱导1周时,5-氮杂胞苷组P53、P21表达最强,PFT-α组几乎不表达;诱导4周时,5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α＋5-氮杂胞苷组P53、P21表达明显高于正常对照组。PFT-α组、PFT-α＋5-氮杂胞苷组内诱导4周时P53、P21表达量均高于1周时表达。提示通过P53抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能显著减少骨髓间充质干细胞凋亡,促进其增殖,且能诱导其向心肌样细胞分化。     

HGF联合5-aza诱导间充质干细胞心肌样分化实验探讨

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)联合5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向心肌样细胞分化的机制。方法 1采用全骨髓贴壁法培养BMMSCs,用流式细胞仪对阳性表面标记抗原CD44、CD29和阴性标记抗原CD34进行检测。2取第4代BMMSCs进行分组诱导,空白对照组(普通培养基)、5-aza组(10μmol/L)、HGF组(10 ng/ml)、5-aza+HGF组(10μmol/l+10 ng/ml)。各组BMMSCs诱导4周后,实时荧光定量PCR法检测各组α-actin、GATA-4相对表达量,免疫组化法鉴定肌钙蛋白T(cTnT)表达。结果 1大鼠BMMSCs体外培养形态特征及鉴定:细胞呈长梭形、同心圆状生长,形态逐渐趋向一致。CD44阳性表达率为(86.14)%,CD29阳性表达率为(98.97)%,CD34阳性表达率为(6.86%);2BMMSCs诱导4周后空白对照组细胞死亡,免疫组化显示3组均表达心肌特异性结构蛋白cTnT;实时荧光定量PCR显示3组均表达心肌分化早期基因,其中5-aza+HGF组明显高于其他两组。结论 1骨髓间充质干细胞经5-aza、HGF诱导后可以分化为心肌样细胞。2在骨髓间充质干细胞诱导为心肌样细胞的过程中,5-aza+HGF组优于5-aza及HGF组。     

P53特异性抑制剂PFT-α诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:最新研究表明,P53可通过阻断P53-P21蛋白通路,显著提高干细胞分化率。而5-氮杂胞苷主要通过激活P53-P21蛋白通路,抑制细胞增殖,导致细胞凋亡。目的:观察P53特异性抑制剂PFT-α对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞进行培养、传代,取第4代细胞分为4组,正常对照组、PFT-α组、5-氮杂胞苷组及PFT-α+5-氮杂胞苷组。结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞传代诱导后细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。当PFT-α浓度≤20μmol/L时,能减少骨髓间充质干细胞凋亡。心肌样细胞鉴定结果显示,诱导后4周时,可见正常对照组少量表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43,其余3组均强表达。心肌细胞分化率结果显示,诱导4周时,PFT-α组和5-氮杂胞苷+PFT-α组显著高于5-氮杂胞苷组。Western Blotting检测结果示,诱导1周时,5-氮杂胞苷组P53、P21表达最强,PFT-α组几乎不表达;诱导4周时,5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组P53、P21表达明显高于正常对照组。PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组内诱导4周时P53、P21表达量均高于1周时表达。提示通过P53抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能显著减少骨髓间充质干细胞凋亡,促进其增殖,且能诱导其向心肌样细胞分化。     

P53-P21蛋白通路对5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞 增殖和凋亡的影响

背景：5-氮杂胞苷是诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的有效化学试剂。目的：观察 P53 特异性抑制剂 PFT-α阻断 P53-P21 蛋白通路对 5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响。方法：分离 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,取第 3 代细胞分为 4 组,即正常对照组、5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α＋5-氮杂胞苷组。观察骨髓间充质干细胞培养传代过程中细胞形态变化,应用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原,MTT 法测定诱导后各组骨髓间充质干细胞增殖能力,以流式细胞仪检测诱导后各组细胞凋亡率,采用 Western blot 法测定诱导后P53、P21 蛋白表达情况。结果与结论：原代培养的骨髓间充质干细胞 2 周形成集落,传代细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。骨髓间充质干细胞表面抗原 CD44,CD45 阳性表达率分别为（89.98±1.29）%,（2.14±0.22）%。MTT 结果显示,当 PFT-α浓度≤20 μmol/L 时,对骨髓间充质干细胞的增殖有一定促进作用;而当其浓度达到 40 μmol/L 时,PFT-α则可明显抑制骨髓间充质干细胞的增殖。培养第 5,7 天时,与其他 3 组比较,5-氮杂胞苷组对骨髓间充质干细胞增殖表现出明显抑制（P〈0.01）。流式细胞仪结果显示,5-氮杂胞苷组骨髓间充质干细胞凋亡率显著高于其他 3 组（P〈0.01）。Western blot 结果显示,各组均有 P53、P21 蛋白的表达,以 5-氮杂胞苷组表达量明显增多。提示通过 P53 特异性抑制剂 PFT-α阻断 P53-P21 蛋白通路,能显著减少 5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡,促进 5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞增殖。     

P53-P21蛋白通路对5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响

背景:5-氮杂胞苷是诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的有效化学试剂.目的:观察P53特异性抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路对5-氮杂胞苷诱导的大鼠骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响.方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为4组,即正常对照组、5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α+5-氮杂胞苷组.观察骨髓间充质干细胞培养传代过程中细胞形态变化,应用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原,MTT法测定诱导后各组骨髓间充质干细胞增殖能力,以流式细胞仪检测诱导后各组细胞凋亡率,采用Western blot法测定诱导后P53、P21蛋白表达情况.结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞2周形成集落,传代细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致.骨髓间充质干细胞表面抗原CD44,CD45阳性表达率分别为(89.98±1.29)%,(2.14±0.22)%.MTT结果显示,当PFT-α浓度≤20 μmol/L时,对骨髓间充质干细胞的增殖有一定促进作用;而当其浓度达到40 μmol/L时,PFT-α则可明显抑制骨髓间充质干细胞的增殖.培养第5,7天时,与其他3组比较,5-氮杂胞苷组对骨髓间充质干细胞增殖表现出明显抑制(P < 0.01).流式细胞仪结果显示,5-氮杂胞苷组骨髓间充质干细胞凋亡率显著高于其他3组(P < 0.01).Western blot结果显示,各组均有P53、P21蛋白的表达,以5-氮杂胞苷组表达量明显增多.提示通过P53特异性抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能显著减少5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡,促进5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞增殖.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的探讨骨髓问充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是否能体外诱导分化为心肌样细胞。方法用浓度梯度法分离和纯化Wistar大鼠MSCs，贴壁法培养，培养的第2代细胞分别用终浓度为0、0．1、1．0、10．0、50．0、100．0μmol／L的5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导分化，用光学显微镜观察细胞的形态并用免疫细胞化学方法鉴定细胞内的心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）。结果以终浓度10．0μmol／L 5-aza为诱导组，细胞从原来的梭形变为排列趋向较为一致的长梭形，且体积增大，诱导10d后，细胞内cTnI蛋白染色阳性。终浓度为0、0．1、1．0μmol／L组细胞形态变化不明显，细胞内cTnI染色阴性。终浓度为50．0、100．0μmol／L组细胞死亡。结论大鼠MSCs细胞可经5-aza诱导分化为心肌样细胞，且5-aza的最佳诱导浓度为10．0μmol／L。     

“心肌样”环境下5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞分化的实验研究

目的研究在“心肌样”环境下5-氮胞苷（5-Aza）诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化的有效性。方法①分离和纯化大鼠BMSCs,用5-Aza诱导部分BMSCs,组1不用5-Aza诱导。取第3代细胞进行下一步试验;组2于原代培养第3天加入5-Aza（10μmol／L）诱导24h;组3在第3代细胞接近融合前24h加入5-Aza（10μmol／L）诱导24h;组4于原代培养第3天加入5-Aza（10μmol／L）诱导24h,在第3代细胞接近融合前24h加入5-Aza（10μmol／L）再次诱导24h;并用流式细胞仪鉴定。②BMSCs标记后与乳鼠心肌细胞共培养（“心肌样”环境）。③免疫荧光法检测BMSCs的肌球蛋白重链（MHC）和心肌特异性肌钙蛋白I（cTnI）表达。结果①各组的BMSCs形态基本相同,流式细胞仪鉴定CD29、CIM4为阳性,而CD34阴性。②免疫荧光结果显示5-Aza单次诱导组（组3）与未诱导组（组1）比较MHC[（6．82±2．05）％与（3．61±1．14）％]、cTnI[（5．63±1．86）％与（2．76±0．82）％]阳性率显著增加（P均〈0．05）;且5-Aza双次诱导组（组4）较单次诱导组（组3）MHC[（12．18±3．16）％与（6．82±2．05）％]、cTnI[（9．93±2．79）％与（5．63±1．86）％]阳性率显著增加（P均〈0．05）。结论“心肌样”环境下5-Aza能够明显促进BMSCs向心肌样细胞分化,且双次诱导较单次诱导效果更好。     

心肌条件培养液对体外骨髓间充质干细胞向心肌细胞诱导分化的影响

目的:观察心肌培养液中可溶性细胞因子对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞诱导分化过程的影响;方法:10 μmol/L 5氮胞苷(5-aza)诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化后,实验分为两组:5-aza诱导组常规培养基培养,5-aza诱导 心肌条件培养组以1∶1混合的心肌条件培养液培养,观察与比较两组细胞形态,免疫细胞化学法和western blot技术分析心肌特异蛋白表达.结果:5-aza组细胞排列紊乱,5-aza诱导 心肌条件培养组细胞呈集落样排列,可见肌管形成,自诱导2周开始两组均见肌钙蛋白I(troponin I)阳性细胞,而troponin I、结蛋白(desmin)、连接蛋白-43(connexin-43)在诱导2周开始表达,3、4周达高峰,各时间点两组蛋白表达没有明显差异;结论:心肌条件培养液对心肌细胞的体外分化过程没有促进作用,但是可以加强体外诱导生成的心肌样细胞之间的有机排列.     

"心肌样"环境下5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞分化的实验研究

目的 研究在"心肌样"环境下5-氮胞苷(5-Aza)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的有效性.方法 ①分离和纯化大鼠BMSCs,用5-Aza诱导部分BMSCs,组1不用5-Aza诱导,取第3代细胞进行下一步试验;组2于原代培养第3天加入5-Aza(10 μmol/L)诱导24 h;组3在第3代细胞接近融合前24 h加入5-Aza(10 μmol/L)诱导24 h;组4于原代培养第3天加入5-Aza(10μmol/L)诱导24 h,在第3代细胞接近融合前24 h加入5-Aza(10 μmol/L)再次诱导24 h;并用流式细胞仪鉴定.②BMSCs标记后与乳鼠心肌细胞共培养("心肌样"环境).③免疫荧光法检测BMSCs的肌球蛋白重链(MHC)和心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)表达.结果 ①各组的BMSCs形态基本相同,流式细胞仪鉴定CD29、CD44为阳性.而CD34阴性.②免疫荧光结果 显示5-Aza单次诱导组(组3)与未诱导组(组1)比较MHC[(6.82±2.05)%与(3.61±1.14)%]、cTnI[(5.63±1.86)%与(2.76±0.82)%]阳性率显著增加(P均<0.05);且5-Aza双次诱导组(组4)较单次诱导组(组3)MHC[(12.18±3.16)%与(6.82±2.05)%]、cTnI[(9.93±2.79)%与(5.63±1.86)%]阳性率显著增加(P均<0.05).结论 "心肌样"环境下5-Aza能够明显促进BMSCs向心肌样细胞分化,且双次诱导较单次诱导效果更好.     

H9C2细胞培养液诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景：文献报道间充质干细胞经体外化学药物诱导或自体移植体内诱导或模拟心肌样微环境体外诱导等方法可不同程度的诱导心肌细胞分化,但这些方法诱导率低、操作复杂、毒副作用大。 目的：验证心肌细胞株H9C2细胞培养液对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的诱导作用。 方法：运用全骨髓贴壁筛选法分离培养大鼠间充质干细胞,制备 H9C2细胞培养液作为诱导培养液,将间充质干细胞诱导培养1,3,5,7 d;以单独10%F12-DMEM培养液培养的H9C2细胞为阳性对照组;单独10%F12-DMEM培养液培养的间充质干细胞为阴性对照组。用免疫荧光法和western-blot检测其肌钙蛋白T、心肌细胞结蛋白的表达,用实时荧光定量检测其心肌细胞特征性基因α-肌球蛋白重链和β-肌球蛋白重链mRNA的表达。 结果与结论：H9C2细胞培养液诱导间充质干细胞培养7 d,间充质干细胞增殖分化细胞中肌钙蛋白T阳性细胞达（16±7）%,显著高于对照组（P 〈0.05）;与阴性对照组比较,western-blot检测诱导培养间充质干细胞后分化细胞肌钙蛋白T表达明显上调（P〈0.05）,结蛋白表达明显上调（P 〈0.05）;RT-PCR检测分化细胞α-肌球蛋白重链与β-肌球蛋白重链mRNA表达均上调（P 〈0.05）。结果提示H9C2细胞培养液能诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性

目的:通过体外诱导分化实验,评价人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力.方法:实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.①对象:经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离,D-Hank's液冲洗后剪成碎片,加入含有0.2 g/L乙二胺四乙酸的0.5 g/L胰蛋白酶溶液,离心、消化、过滤,收集滤液,加入胎牛血清终止消化,重复消化2次.合并3次消化所得的细胞悬液,离心后将细胞沉淀悬浮于L-DMEM培养基中,按1.25×108 L-1密度接种,常规培养3 d后更换培养基,待细胞达80%~90%融合后用胰蛋白酶 乙二胺四乙酸联合消化,终止后离心弃上清,细胞沉淀用培养基重新悬浮,按1×107 L-1密度传代.③实验评估:用流式细胞仪鉴定人羊膜上皮细胞表型;使用10 μmol/L 5-氮杂胞苷和1 mmol/L抗坏血酸磷酸盐诱导第2代人羊膜上皮细胞,免疫荧光染色法检测诱导后细胞中特异蛋白结蛋白和α-辅肌动蛋白的表达,RT-PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA的表达.结果:①人羊膜上皮细胞的免疫组化特征:人羊膜上皮细胞几乎不表达CD44,不表达波形蛋白,表达角蛋白19.②人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达肌系细胞标志α-辅肌动蛋白和结蛋白.③人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链mRNA的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达心肌特异性转录因子Nkx2.5 mRNA和GATA-4 mRNA，心肌特异的可收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA未见表达.结论:通过胰蛋白酶消化法分离获得的人羊膜上皮细胞具有向心肌样细胞分化的特性,可能成为细胞心肌成形术的候选供体细胞.     

17-DMAG体外对结肠癌HT-29细胞的影响及细胞内活性氧的研究

目的 观察17-二甲胺乙胺基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-DMAG）对人结肠癌HT-29细胞增殖、细胞凋亡的影响及其细胞内活性氧（ROS）的变化.方法 用CCK-8检测17-DMAG对结肠癌HT-29细胞增殖影响;AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞检测细胞凋亡率;酶标仪检测细胞内ROS的变化.结果 17-DMAG呈时间-剂量依赖性抑制HT-29细胞增殖.0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.5μmol/L作用于HT-29细胞24h后,细胞增殖抑制率分别为（22.17±1.15）％、（28.45±1.16）％、（35.04±1.58）％和（46.85±2.44）％,作用48 h后,细胞增殖抑制率分别为（27.55±0.65）％、（33.33±1.23）％、（46.20±4.76）％和（55.45±4.47）％,作用72h,细胞增殖抑制率分别为（39.19±1.74）％、（44.29±2.00）％、（50.66±2.17）％和（58.84±3.18）％.正常对照组HT-29细胞24h的自然总凋亡率（早期＋晚期）为（2.72±0.57）％,0.25 μmol/L、0.5μmol/L、1.0 μmol/L和2.5μmol/L 17-DMAG干预24h后细胞总凋亡率分别为（5.38±0.46）％、（6.88±0.52）％、（10.44±0.32）％与（17.87 ±4.66）％,17-DMAG作用HT-29细胞24h的凋亡率与对照组细胞凋亡率相比差异有统计学意义（P＜0.05）.0.25 μmoL/L、0.5μmol/L、1.0 μmol/L和2.5 μmol/L 17-DMAG作用HT-29细胞12 h与24h,其活性氧水平均较对照组有不同程度的上升,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 17-DMAG体外呈时间-剂量依赖性抑制HT-29细胞增殖,诱导其凋亡,可能部分与细胞内的ROS升高有关.     

兔自体脂肪干细胞成骨诱导后经皮注射修复骨缺损

目的:探索兔自体脂肪干细胞、成骨诱导后的脂肪干细胞联合骨形态发生蛋白-2/纤维蛋白胶(bone morphogenetic proein-2/Fibrin glue,BMP-2/FG)经皮移植到骨缺损后体内成骨能力的差异.方法:实验于2006-0812007-11在北京军区总医院全军骨科研究所完成.①实验材料:清洁级日本大耳白兔,2.0～2.5 kg,雌雄不限,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:制作新西兰大白兔桡骨中段15 mm骨缺损模型35侧,随机分为5组,每组7侧:未诱导细胞组、诱导细胞组、未诱导细胞 BMP-2/FG组、诱导细胞 BMP-2/FG组、空白对照组.未诱导细胞组、诱导细胞组直接用生理盐水重悬未诱导脂肪干细胞和经成骨诱导的脂肪干细胞,未诱导细胞 BMP-2/FG、诱导细胞 BMP-2/FG组分别用含20 g/L骨形态发生蛋白-2、5 g/L纤维蛋白原的生理盐水重悬未诱导和经成骨诱导的脂肪干细胞.⑨实验评估:X射线片观察各组骨缺损修复情况,并进行生物力学榆测.结果:①12周时,未诱导细胞 BMP-2/FG组、诱导细胞 BMP-2/FG组在骨缺损区新生骨的数晕明显优于未诱导细胞组、诱导细胞组(P均＜0.05).②术后4周x射线显示,未诱导细胞 BMP-2/FG组、诱导细胞 BMP-2/FG组阻射密度值高于其他组(P均＜0.05),未诱导细胞组与诱导细胞组无差别.术后8,12周时,诱导细胞组高于未诱导细胞组,未诱导细胞 BMP-2,FG、诱导细胞 BMP-2/FG组均高于其他组,诱导细胞 BMP-2/FG组高于未诱导细胞 BMP-2/FG组(P均＜0.05).③生物力学检测显示,未诱导细胞 BMP-2/FG组、诱导细胞 BMP-2/FG组桡骨标本的四点弯曲断裂载荷均明显高于其他组,并且诱导细胞 BMP-2/FG组高于未诱导细胞 BMP-2/FG组(P均＜0.05).未诱导细胞组与诱导细胞组无差别.结论:成骨诱导脂肪干细胞及联合BMP-2/FG移植后8周和12周时具有更强的成骨能力,可作为种子细胞应用于骨组织工程.     

鲍氏威酸诱导急性早幼粒白血病细胞分化与PML/RARα关系的研究

目的：研究鲍氏威酸（BC4）诱导不同融合基因PML／RARα基因型的急性早幼粒白血病（APL）细胞分化的能力及对APL细胞分化相关基因c-myc的表达影响，探讨鲍氏威酸诱导分化作用的机制。方法：采用RT-PCR检测APL细胞PML／RARα的基因型；运用骨髓干、祖细胞集落培养技术分析各基因型APL细胞分别在生理盐水（NS）对照组，鲍氏威酸（BC4）组，全反式维甲酸（ATRA）组培养体系中增殖与分化能力，测定各组集落与丛的形成率，形态分化率，NBT还原率以及粒细胞吞噬率，培养前后各组APL细胞c-myc表达阳性率。结果：与NS对照比较，BC4和ATRA均使PML-RARα^＋组APL细胞丛形成率明显增高（P〈0.01），而集落形成率无明显变化（P〉0．05），3项细胞分化指标增高（0．01〈P〈0．05），c-myc表达阳性率降低（P〈0．05）；BC4对PML／RARα^＋（L型）诱导分化作用强于PML-RARα^＋（S型）APL，BC4对部分ATRA治疗后复发耐药病例有诱导分化能力。BC4及ATRA对PML／RARα^＋APL细胞的各项诱导分化指标无明显改变。结论：BC4对APL具有诱导分化作用，下调c-myc基因表达，其诱导分化能力与PML／RARα^-基因型有关，并能诱导部分ATRA耐药细胞分化     

羧胺三唑对TNF-α诱导的佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞中细胞因子分泌和NF-κB活化的影响

目的 探讨羧胺三唑对TNF-α诱导的佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞分泌促炎细胞因子的影响及部分机制.方法 用弗氏完全佐剂诱导大鼠佐剂性关节炎模型,分离培养的佐剂性关节炎成纤维样滑膜细胞用20 ng/ml TNF-α刺激并用不同浓度羧胺三唑（10、20、40 μmol/L）处理.ELISA法检测成纤维样滑膜细胞上清中IL-1β和IL-6含量,Western blot法检测NF-KB p65的蛋白表达.结果 经20 ng/mlTNF-α刺激后,成纤维样滑膜细胞分泌IL-1β和IL-6水平,以及细胞核中NF-KB p65的表达显著增加（P＜0.01）.羧胺三唑（20、40 μmol/L）能够显著抑制TNF-α诱导的IL-1β[（417.39 ＋29.80） pg/mlvs.（264.63±9.35） pg/ml,（186.13±25.71）pg/ml,P ＜0.01]和IL-6[（383.45±32.13） pg/ml vs.（248.39±30.51） pg/ml,（189.64±27.86） pg/ml,P＜0.01]分泌,且明显减少细胞核中NF-κB p65的表达（P＜0.01）.结论 羧胺三唑可能通过抑制NF-KB活化来减少TNF-α诱导的佐剂性关节炎成纤维样滑膜细胞中促炎细胞因子IL-1β、IL-6的产生.     

BMP-4与VEGF促进拟胚体中原始造血干细胞发生的实验研究

本研究旨在探讨骨形态发生蛋白-4（BMP-4）和血管内皮生长因子（VEGF）在诱导胚胎干细胞（ESC）形成拟胚体（EB）过程中促进原始造血干细胞形成的作用。将小鼠E14ESC在半固体培养基中诱导为EB，根据培养体系中有无添加因子分组：未添加因子的自然分化组、含不同浓度（5、15、25、50ng／ml）的BMP-4组，在BMP-4单因子实验的基础上联合10ng／ml VEGF组及单因子VEGF组。分别于3,6,9,12、15天时收获EB，用流式细胞术检测Flk-1^＋细胞含量。结果表明：随着添加BMP-4因子浓度的逐渐升高，EB中Flk-1^＋细胞形成比例也逐渐增加，在第3天（D3）和第6天（D6）两个时点，25ng／ml BMP-4作用组Flk-1^＋细胞达到峰值，分别为（6．51&#177;1．02）％和（7．70&#177;1．12）％，与无BMP-4对照组及5ng／ml组比较有统计学意义的差异（P〈0．05）。然而在BMP-4浓度升高至50ng／ml条件下Flk-1^＋细胞形成比例有减少趋势。在BMP-4单因子实验的基础上，以25ng／ml BMP-4联合10ng／mlVEGF共同作用于ESC→EB诱导过程，Flk-1^＋细胞百分比明显提高，在9天达到峰值，为（27．53&#177;8．14）％，与自发分化组[（8．77&#177;2．35）％]及VEGF单因子组[（11．21&#177;2．23）％]相比均有显著性差异（P〈0．05）。结论：BMP-4和VEGF联合使用可促进EB中胚层原始造血干细胞的形成，为进一步模拟造血微环境定向诱导ESC造血分化提供了实验依据。     

骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的研究5-氮胞苷（5-Aza）对培养人骨髓间充质干细胞（MSCs）的作用,并对分化后的心肌样细胞进行鉴定。方法采用密度梯度离心法分离到骨髓单个核细胞（MB-MNC）,用含200ml／L胎牛血清的低糖型DMEM培养液进行培养。采用差速贴壁法纯化MSCs,用流式细胞仪检测细胞表面抗原。以5-Aza诱导第3代MSCs 24h后,继续培养。于培养的第4周,采用免疫细胞化学方法检测肌系特异性标记抗原结合蛋白（nesmin）,RT-PCR检测心肌早期转录因子GATA-4和心肌特异性蛋白肌钙蛋白T（cTnT）。结果MSCs经5-Aza诱导分化后表达Desmin、GATA-4和cTnT,未经诱导的同培养天数的MSCs中均呈未见表达。结论MSCs经5-Aza诱导后可以表现心肌样细胞特征。     

成体小鼠心脏Sca1+细胞体外分化潜能的实验研究

目的:研究成体小鼠心脏Sca-1~+细胞体外诱导分化的潜能。方法:利用免疫磁珠分选法分离成体小鼠心脏Sca-1~+细胞,通过BMP-2/FGF-4,TGF-β1及VEGF165等三种不同的体外诱导方法使其向心脏"三系"分化,并从细胞形态的变化、RT-PCR和免疫荧光染色等方面鉴定其分化潜能。结果:经BMP-2/FGF-4诱导,小鼠心脏Sca-1~+细胞发生形态改变,上调心肌细胞特征基因α-MHC、β-MHC、MLC-2a和MLC-2v的mRNA表达,同时表达心肌特征性蛋白cTNT和cMHC。经TGF-β1诱导,小鼠心脏Sca-1~+细胞亦发生形态改变,上调平滑肌特征基因α-SMA和Calponin的mRNA表达,同时表达平滑肌特征性蛋白SMA、sMHC和Calponin的表达。经VEGF165诱导,小鼠心脏Sca-1~+细胞同样发生了形态改变,上调内皮细胞特征基因CD31、vWF和VE-Cadherin的mRNA表达,同时表达内皮细胞特征性抗原CD31。结论:成体小鼠心脏Sca-1~+细胞在体外多种因素的分别作用下,能向心肌样细胞、平滑肌样细胞和内皮样细胞分化,具有心脏干细胞特性的多向分化潜能。