体外培养的兔角膜内皮细胞生物学特性

背景如何选择高质量、生物学特性更接近在体生理状态的角膜内皮种子细胞是组织工程角膜研究的基础。角膜内皮细胞（CECs）的培养、鉴定及生物学特性检测是优选角膜内皮种子细胞的瓶颈问题。目的建立兔CECs原代培养及鉴定的方法,检测传代后细胞的生物学特性。方法从30只新西兰大白兔的角膜组织完整撕除后弹力层及CECs层,采用胰蛋白酶消化法进行原代培养,观察培养细胞的生长状态。分别从形态学、基因水平和蛋白水平鉴定细胞：茜素红染色法观察细胞形态,并与新鲜角膜组织的内皮细胞进行对比;逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测IVα2型胶原（COL4A2）、血管内皮生长因子受体2（FLK1）、Na^-K^＋ATP酶α亚单位（ATPIA1）、水通道蛋白1（AQP1）、电压依丛性阴离子通道（VDACs）等相对特异性基因;免疫细胞化学法观察神经元特异性烯醇化酶（NSE）、Na^-K^＋ATP酶及紧密连接蛋白ZO-1的表达。采用MTT比色法测定传代细胞的增生活性变化,采用超微量ATP酶试剂盒及免疫荧光法分别测定传代细胞Na^-K^＋ATP酶活性及其表达量的变化。结果原代培养的兔CECs多在24h内贴壁,2—3d达融合,形态呈六边形。随着传代代数的增加,细胞形态逐渐发生改变,第2代、第3代细胞可见空泡样变。原代培养的细胞茜素红染色可见清晰的细胞轮廓,与在体的CECs形态相似。RT—PCR法检测可见COL4A2、FLKl、ATP1Al、AQP1、VDACs等基因在培养细胞中表达。免疫荧光染色结果显示NSE、Na^-K^＋ATP酶、ZO-1在培养细胞中呈阳性表达。MTT检测结果显示,传代后细胞的增生活性逐渐下降,尤其第2代、第3代细胞下降明显。定量检测结果显示随着传代代数的增加,兔CECs的Na^-K^＋ATP酶活性逐渐降低,各代细胞的Na^-K^＋ATP酶活性总体比较的差异有统计学意义（F=77．174,P=0．000）。结论成功用酶消化法建立了体外培养兔CECs的方法,并从多个层次建立了纯化细胞的鉴定方法。研究结果证实经传代后的CECs的增生活性和功能均有所下降,因此在进行相关的研究时应选用前2代的细胞。     

血小板源性生长因子和bFGF促进猫角膜内皮细胞增生的协同作用研究

目的 观察血小板源性生长因子（PDGF-BB）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对猫角膜内皮细胞（CECs）增生的影响及其联合应用对细胞增生是否有协同作用。方法 猫CECs原代培养，传1代后，分别在培养液中加不同浓度的PDGF-BB和bFGF，加药后第1、3、5d分别利用MTT法测定在490nm处的吸光值来判断CECs的增生情况；同时应用倒置相差显微镜观察细胞形态，扫描电镜检测细胞超微结构。结果 与对照组比较，加药后第1、3、5d，PDGF-BB和bFGF均能增加培养的猫CECs的数量，最有效质量浓度分别为100ng／ml和10ng／ml，二者联合培养组猫CECs的增生能力更强。结论 PDGF-BB和bFGF可促进猫CECs的增生，二者具有协同作用。     

兔自体骨髓间充质干细胞移植治疗角膜内皮损伤的研究

目的研究自体骨髓间充质干细胞（MSCs）移植到兔角膜内皮细胞（CECs）部位后的形态和功能分化。方法体外培养新西兰兔自体MSCs并用5-溴尿嘧啶脱氧核苷（Brdu）标记后接种在明胶载体膜上;利用α-氰基丙烯酸脘基酯作为组织黏合剂,将接种有兔自体MSCs的载体与机械去除了内皮细胞的自体兔角膜植片相黏合,原位缝合进行MSCs移植;对照分别移植体外培养的同种异体CECs和空白载体膜。59只新西兰白兔接受了移植实验,其中21只新西兰兔的右眼接受了自体MSCs移植,21只兔的右眼接受了CECs移植,另外17只兔的右眼移植了空白载体。术后不同时间观察兔眼角膜移植片的透明情况、角膜厚度及眼压,并利用共焦显微镜进行移植细胞的形态观察和精确计数。术后观察12周,取角膜标本分别进行组织切片、抗Brdu单克隆抗体免疫组织化学染色和电镜观察。结果MSCs和CECs在明胶载体膜上生长良好,体外培养3～5d后细胞汇合,细胞密度可达约MSCs3000个／mm^2、CECs2700个／mm^2。术后2周,57只植片均发生了水肿,并逐渐混浊。自体MSCs移植组术后8周植片水肿逐渐减轻,角膜透明度恢复;CECs移植组植片术后约4周水肿减退;而对照组角膜植片则持续水肿、混浊。术后12周时,移植细胞的平均密度为：MSCs组（2105±677）个／mm^2、CECs组（2023±330）个／mm^2。扫描电镜显示MSCs移植后逐渐分化成为类似多角形的细胞,但是细胞间的间隙较大,细胞表面有丰富的微绒毛。Brdu单克隆抗体免疫组织化学染色可将移植的细胞核着色。结论自体MSCs细胞替代CECs进行移植后,这些细胞在角膜内表面可以分化成为一种类似CECs形态和功能的细胞。（中华腠科杂志,2007,43：540-545）     

荧光激活细胞分离技术在角膜缘干细胞研究中的应用

目的探讨荧光激活细胞分离技术（FACS）在体外培养的兔角膜缘上皮细胞生物学特性研究中的应用。方法收集新西兰白兔的角膜缘组织进行组织块培养。采用FACS分离出体外培养的兔角膜缘上皮细胞中的侧群（SP）细胞和非SP细胞。用2%锥虫蓝染色法对分离出的SP细胞进行克隆形成率（CFE）检测以评估SP细胞的活性,用免疫组织化学染色检测K3/12和ABCG2蛋白在SP细胞和非SP细胞中的表达。结果SP细胞在体外培养的兔角膜缘上皮细胞中占（0.22±0.09）%,分离出的SP细胞的CFE为（5.52±0.45）%,而非SP细胞为（0.78±0.73）%,二者差异有统计学意义（t=2.17,P〈0.01）;大部分SP细胞呈K3/K12抗原阴性,ABCG2免疫标记呈阳性;而非SP细胞呈K3/K12抗原阳性,ABCG2免疫标记呈阴性。结论FACS可以应用于体外培养的兔角膜缘上皮细胞的SP细胞分离,分离出的SP细胞具有较强的增生能力。     

EDTA对兔角膜内皮细胞增殖的影响

目的 观察不同浓度的EDTA对免角膜内皮细胞(corneal endothelial cells,CECs)增殖的影响.方法 采取揭取角膜后弹力层联合酶消化法分离培养兔CECs;分别用0.5 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、5.0 mmol·L-1的EDTA作用于体外培养的免CECs 1h然后于24 h、48 h、72 h、96 h观察不同浓度的EDTA对免CECs的影响.采用CCK-8检测方法测定在450 nm处各吸光度(A值)来判断CECs的增殖状况采用流式细胞检测仪对各组细胞周期进行检测同时采用倒置显微镜观察细胞形态的变化.结果 揭取带内皮细胞的后弹力层联合酶消化法培养的兔CECs可很快贴壁、增殖,并在4～5 d融合为单层 CCK-8检测结果显示0.5 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、5.0 mmol·L-1的EDTA作用后各个时间点均能使CECs的吸光度发生改变,同一时间点0.5 mmol·L-1的EDTA对细胞增殖的作用最为显著,各摩尔浓度的EDTA对兔CECs作用后96h吸光度改变最明显(A值分别为:2.595 2±0.053 0、2.090 4±0.159 2、0.939 1±0.077 2).作用48 h后0.5mmol·L-1组兔CECs的S+C2/M期细胞所占比例(A值为1.292 5±0.018 3)与阴性对照组比较,差异有统计学意义,而2.5mmol·L-1、5.0 mmol·L-1组与阴性对照组(A值为0.921 2±0.084 8)比较,差异均无统计学意义.结论 0.5 mmol·L-1的EDTA作用于兔CECs 1 h后的不同时间均有明显的促进增殖的作用.     

姜黄素对角膜基质细胞纤维化的抑制作用

背景角膜的创伤或手术可导致角膜基质细胞纤维化,进而形成瘢痕。研究表明姜黄素可明显减轻组织的纤维化程度,但姜黄素是否会影响角膜基质细胞纤维化的研究尚少。目的观察不同质量浓度的姜黄素对小鼠角膜基质细胞向成纤维细胞转化过程的影响,探讨姜黄素抗角膜基质纤维化的作用。方法150只6～8周龄BALB／c小鼠,分离角膜基质细胞并在含质量分数10％胎牛血清（FBS）的DMEM中进行培养,以原代角膜基质细胞重悬于DMEM中并分为5组：（1）空白对照组（DMEM＋10％FBS,含质量分数1％。DMSO,CG组）。（2）低剂量组（CG＋7．5mg／L姜黄素组）。（3）中剂量组（CG＋10mg／L姜黄素组）。（4）高剂量组（CG＋12．5mg／L姜黄素组）。（5）无诱导剂组（DMEM,含1％oDMSO）。上述因素干预7d后,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组中细胞表型keratocan、醛脱氢酶（ALDH）、CD90、decorin、fibronectin一1的表达。用MTS法检测姜黄素对角膜基质细胞增生的影响。制备小鼠角膜冰冻切片,采用免疫荧光技术检测角膜基质细胞内fibronectin-1的表达。结果原代培养的角膜基质细胞呈梭形,为细胞质丰富且核大的角膜基质成纤维细胞。随着姜黄素质量浓度的增加,角膜基质细胞中keratocanmRNA、ALDHmRNA的表达量增加,CD90mRNA和decorinmRNA的表达量减少,差异均有统计学意义（P〈O．05）,fibronectin-1mRNA的表达变化差异无统计学意义（P〉0．05）。MTS法检测发现,随着姜黄素质量浓度的增加,对角膜基质细胞增生的抑制率逐渐增加（F=956．00,P〈0．05）。免疫荧光技术检测发现角膜基质细胞中fibronectin-1的表达呈红色荧光。结论姜黄素对离体小鼠角膜基质细胞纤维化有明显的抑制作用,可减轻角膜基质创伤修复过程中的过度纤维化。     

小鼠胚胎干细胞条件培养液培养的人角膜内皮细胞在脱细胞猪角膜基质上单层细胞片的构建

背景 目前角膜供体来源短缺,且体外培养的人角膜内皮细胞(HCECs)难以再生和扩增,为临床上角膜移植的开展带来了很大困难,组织工程角膜的构建仍是研究的主要课题.前期研究已证实,小鼠胚胎干细胞条件培养基(ESC-CM)能够促进体外HCECs的增生,脱细胞猪角膜基质(APCS)是较好的支架材料,但ESC-CM培养的HCECs是否能在APCS上融合成单层细胞鲜见研究. 目的 研究ESC-CM培养的HCECs在APCS上是否能够形成单层细胞. 方法 用小鼠ESC-CM培养液培养小鼠ES-E14细胞,收集培养上清液,离心后按体积比1∶3与人角膜内皮细胞培养液(CEM)混合,制备体积分数25％ ESC-CM液.取穿透角膜移植术后剩余的供体人角巩膜缘组织,采用组织块培养法用ESC-CM对HCECs进行培养和传代,采用逆转录PCR法检测HCECs中Ⅷ型胶原蛋白(ColⅧ)与神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达以鉴定细胞.取猪角膜,利用磷脂酶A2和碳酸氢盐溶液脱细胞法制备APCS,将第2代HCECs混合液按照800/mm2的密度种植于灭菌的APCS上进行培养,于倒置相差显微镜下观察细胞形态,采用苏木精-伊红染色法观察培养细胞的组织结构;采用免疫荧光法检测构建的HCECs单细胞片中闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和Na+-K+-ATP酶的表达. 结果 体外培养的HCECs呈典型的六角形,内皮特异性标志物ColⅧ和NSE mRNA表达阳性.脱细胞APCS呈白色透明状,苏木精-伊红染色显示APCS中无角膜细胞,但角膜胶原纤维排列规则.第2代HCECs复水后可在APCS上生长并贴附,培养后7d融合成单层细胞片,细胞片上HCECs的细胞密度为(2 694-± 143)/mm2.构建的HCECs片中内皮细胞泵功能相关蛋白ZO-1和Na+-K+-ATP酶均呈阳性表达,呈红色荧光. 结论 25％ESC-CM可促进HCECs的生长并维持细胞的正常形态,APCS可为HCECs片的构建提供支架和较好的生存微环境.在APCS形成的HCECs单细胞片可表达HCECs泵功能,是角膜移植的良好供体.     

LV-EGFP标记兔角膜基质细胞体外基质层移植的实验观察

目的:探讨兔角膜基质细胞(CSCs)体外移植兔角膜后的存活时间。方法:体外培养原代兔CSCs,并行细胞免疫组化鉴定,利用慢病毒载体(LV)携带标记基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染兔CSCs,倒置荧光显微镜下观察转染后细胞生长状态及荧光强度,体外动物实验,随机分为2组,实验组行LV-EGFP标记的兔CSCs细胞悬液角膜基质注射,对照组等量生理盐水角膜基质注射,转染后1wk,1mo取材冰冻切片观察移植的CSCs荧光,石蜡切片行苏木素-伊红(HE)染色观察组织形态。结果:LV-EGFP转染兔CSCs在倒置荧光显微镜下24h后可见少量荧光,96h和110h荧光较强,转染后的CSCs与正常CSCs细胞形态无明显差异;转染后1wk,1mo实验组中角膜基质层中可见绿色荧光,对照组中无绿色荧光;石蜡切片1wk实验组见明显上皮细胞增生及角膜轻微水肿,少量炎症细胞浸润,转染后1mo实验组上皮细胞增生减弱,未见角膜层水肿;对照组1wk,1mo均未见明显异常。结论:LV-EGFP标记的兔CSCs行体外角膜基质移植,可在角膜中至少存活1mo,且与邻近组织相容性较好。     

刀豆蛋白A条件化培养基对体外培养兔角膜内皮细胞Na^＋-K^＋-ATP酶的作用

目的 研究刀豆蛋白A(ConA)条件化培养基对体外培养兔角膜内皮细胞膜表面Na+-K+-ATP酶的分布及其酶活性的影响.方法 超微量ATP酶试剂盒测定原代培养兔角膜内皮细胞细胞膜表面Na+-K+-ATP酶的活性,并对ConA条件化培养基作用下不同生长周期(5、7、10 d)细胞Na+-K+-ATP酶的活性进行测定;免疫酶组织化学电镜下观察不同培养基作用下体外培养角膜内皮细胞膜表面Na+-K+-ATP酶的分布.结果 ConA条件化培养基组兔角膜内皮细胞Na+-K+-ATP酶活性明显高于无ConA组(P＜0.01),原代细胞生长7～10 d时Na+-K+-ATP酶活性最高(P＜0.01).单层兔角膜内皮细胞膜外侧可见Na+-K+-ATP酶阳性反应.在ConA条件化培养基处理组,其阳性反应物较多、致密;而在无ConA组则阳性反应物较少、疏松.结论 体外原代培养角膜内皮细胞在7～10 d时,Na+-K+-ATP酶活性最高.ConA条件化培养基可提高兔角膜内皮细胞Na+-K+-ATP酶活性.     

脱细胞角膜材料的生物相容性研究

目的研究异种脱细胞猫角膜板层角膜移植术后的组织相容性。方法24只18周龄的健康新西兰白兔随机平均分成3组：A组为脱细胞猫角膜材料→兔板层移植组,B组为猫→兔异种新鲜角膜植片板层移植组,C组为兔→兔同种异体新鲜角膜植片板层移植组。用扫描电镜观察术后不同时期术眼角膜的组织病理学改变,抽取兔血测定CD4^＋/CD8^＋T细胞百分比。结果术后1个月3个组间角膜植片炎症反应指数组间比较差异均无统计学意义;2个月A组与B组、A组与C组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。3个月A组与B组、A组与C组间比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。3个组间术后同期7、15、30d兔外周血CD4＋T细胞和CD8＋T细胞活化率差异均无统计学意义（P〉0.05）。组织切片显示术后3个月内,B、C两组角膜植片炎症反应轻,植片内皮细胞吸收,组织结构基本正常。A组角膜植片炎症反应显著,结构较紊乱,新生血管增生。扫描电镜可见B、C2组角膜上皮结构基本正常,细胞连接较好。A组扫描电镜可见有上皮缺损。结论脱细胞处理的异种猫角膜移植后生物相容性较新鲜角膜差,免疫反应无显著差异。     

硫酸软骨素联合甘油长期冷冻保存角膜植片的实验研究

背景 硫酸软骨素(CS)是从动物软组织中提取的一种具有高黏滞性和高弹性的酸性黏多糖类物质,因具有广泛的生物活性而用于眼科临床.中期保存液中含有CS时,对角膜内皮细胞(CECs)具有显著的保护作用.然而,CS对长期甘油冷冻保存的CECs是否起到保护作用尚待研究. 目的 研究CS在甘油冷冻保存角膜中对CECs的保护作用,并与透明质酸钠(SH)比较,探索长期保存CECs活性的新方法.方法 获取52只Wistar雌性大鼠角膜片104只,采用随机数字表法随机分为4个组,正常对照组为新鲜角膜直接进行实验,质量分数3％ CS处理组、质量分数1％ SH处理组的角膜分别在内皮面黏附3％ CS、1％SH后放入甘油中冷冻保存,单纯甘油保存组角膜直接装入甘油中-25℃冷冻保存,每组26只角膜片.96只雌性SD大鼠作为受体,角膜植片保存2个月后各组取24只植片行同种异体穿透角膜移植术(PKP),CECs锥虫蓝-茜素红染色分别评价保存的角膜片和移植术后14d的角膜植片上CECs的存活率;透射电子显微镜下观察不同方法保存的角膜植片的超微结构.角膜移植术后1d通过裂隙灯显微镜检查各组角膜排斥反应指数(RI)和植片存活时间,分别于术后7、14、30 d制备角膜标本行常规组织病理学检查,免疫组织化学法检测各时间点植片中转化生长因子β1(TGF-β1)和细胞间黏附因子1(ICAM-1)的表达水平.结果 正常对照组大鼠角膜植片CECs细胞结构正常,未见锥虫蓝-茜素红蓝染细胞,3％ CS处理组偶见细胞蓝染,1％ SH处理组和单纯甘油保存组蓝染CECs数增加.与3％ CS处理组比较,1％ SH处理组和单纯甘油保存组的细胞密度均明显下降,差异均有统计学意义(t=2.214、4.068,P＜0.05),细胞活性率表现出同细胞密度同样的趋势.CECs超微结构检查表明,3％ CS处理组仪表现为内质网的轻度肿胀,而1％SH处理组和单纯甘油保存组细胞内质网肿胀程度较重.3％ CS处理组术后14d时植片淋巴细胞浸润及新生血管明显少于1％ SH处理组和单纯甘油保存组.临床评分表明,与1％ SH处理组和单纯甘油保存组比较,3％ CS处理组的R1明显降低而CECs生存时间明显延长,差异均有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学检测显示,在各时间点,3％ CS处理组植片中TGF-β1的表达量(A值)明显高于1％ SH处理组和单纯甘油保存组(P＜0.01);而ICAM-1的表达量低于1％ SH处理组和单纯甘油保存组(P＜0.05),3％ CS处理组植片中TGF-β1和ICAM-1的表达量接近于正常对照组表达水平.结论 3％ CS处理后的甘油保存方法能长期维持CECs的活性,同种异体PKP结果显示3％ CS处理后的甘油保存方法效果优于1％ SH处理后的甘油保存法.     

Cultivation of an immortalized human corneal endothelial cell population and two distinct clonal subpopulations on thermo-responsive carriers

Background  Recently, it was possible to show that human corneal endothelial cells (HCEC) can be cultured on thermo-responsive polymer substrates, and can be harvested as entire cell sheets without losing viability. We sought to study HCEC sheet cultivation on such cell culture carriers under serum-free conditions as the next consequential step in developing methods for generation of corneal endothelial cell transplants. Methods  An immortalized heterogenous HCEC population and two immortalized, clonally grown HCEC lines (HCEC-B4G12 and HCEC-H9C1) were cultured on thermo-responsive substrates under serum-supplemented and serum-free culture conditions. Cell sheets were characterized by phase contrast microscopy and by immunofluorescent staining for ZO-1, Na⁺,K⁺-ATPase, and vinculin. Results  All tested HCEC populations were able to adhere, spread and proliferate on thermo-responsive substrates under serum-supplemented conditions. Under serum-free conditions, pre-coating of the polymer substrates with ECM proteins was necessary to facilitate attachment and spreading of the cells, except in the case of HCEC-B4G12 cells. The heterogenous HCEC population formed closed monolayers, properly localized ZO-1 to lateral cell borders, and had moderate vinculin levels under serum-free, and higher vinculin levels under serum-supplemented culture conditions. HCEC-B4G12 cells formed closed monolayers, showed proper localization of ZO-1 and Na⁺,K⁺-ATPase to lateral cell borders, and had high vinculin levels irrespective of culture conditions. In contrast, HCEC-H9C1 cells had lowest vinculin levels under serum-supplemented, and higher vinculin levels under serum-free culture conditions. ZO-1 was detected throughout the cytoplasm under both culture conditions. These loosely adherent cells were only able to form a closed monolayer under serum-supplemented conditions. Conclusions  Serum-free production of HCEC sheets is possible. The extremely adherent clonal HCEC line B4G12 produced higher vinculin levels than the other two tested HCEC populations, and showed strong adherence to the thermo-responsive, polymeric culture substratum irrespective of culture conditions. This cell line closely resembles terminally differentiated HCEC in vivo, and was found to be particularly suitable for further studies on HCEC cell sheet engineering.     

紧密连接蛋白对实验性角膜新生血管发生的抑制作用

背景 角膜新生血管（CNV）是导致角膜盲的主要原因之一,研究表明紧密连接蛋白中的闭锁小带蛋白1（ZO-1）对病理性新生血管的发生有调节作用,能通过紧密连接结构构成有效的生理屏障,抑制病理性新生血管的生长,但ZO-1对CNV是否发挥作用尚不清楚. 目的 探讨ZO-1在实验性CNV发生及发展中的作用及其机制.方法 将清洁级7～8周龄雄性BALB/c小鼠24只按随机数字表法随机分为碱烧伤15s组和碱烧伤40 s组,用NaOH滤纸贴附小鼠左眼中央角膜的方法构建CNV模型,于碱烧伤后2周在裂隙灯显微镜下观察并比较两组小鼠CNV生长情况,采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测并比较两组小鼠角膜组织中ZO-1 mRNA的表达.另取鼠龄和性别相匹配同种小鼠54只随机分为3个组,均用NaOH滤纸贴附小鼠左眼中央角膜40 s的方法构建CNV模型,造模后分别用质量分数0.2％透明质酸钠（HA）配制的10 mg/L的ZO-1抗体和0.2％ HA配制的5 mg/L缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）重组蛋白点眼1周,每日3次.于实验后2周摘除大鼠左眼角膜,用免疫组织化学法检测CD31在CNV中的表达,鉴定CNV的形成数目和面积;采用RT-PCR法检测3个组小鼠角膜组织中血管内皮生长因子（VEGF） mRNA的表达;采用流式细胞术检测碱烧伤角膜中巨噬细胞特异性标志物F4/80、中性粒细胞特异性标志物Ly-6G的阳性细胞比例,评价炎性细胞的浸润情况.结果 裂隙灯显微镜下可见造模后2周小鼠CNV达高峰;碱烧伤15 s组小鼠轻度、中度、重度CNV的眼数分布明显少于碱烧伤40 s组,差异有统计学意义（x2=6.032,P=O.049）;碱烧伤15s组和碱烧伤40 s组小鼠角膜中ZO-1 mRNA的相对表达量分别为1.53±0.04和1.15±0.08,差异有统计学意义（t=4.157,P=0.014）.免疫组织化学法检测显示,ZO-1抗体干预组和HIF-1α阳性对照组小鼠角膜组织中CD31阳性细胞数多于0.2％ HA组,差异均有统计学意义（t=-129.590、-226.820,均     

碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对角膜中期保存液保存人角膜内皮细胞的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对中期保存角膜内皮细胞活性的影响。方法角膜中期保存液保存人角膜环,对照组为角膜中期保存液,实验组分为A、B、C、D组,分别为角膜中期保存液中加入bFGF(5ng/ml)、bFGF(20ng/ml)、EGF及bFGF+EGF,在保存角膜第3、7、14天后分别取保存角膜环复温观察,锥虫蓝茜素红联合染色检测角膜内皮活细胞率,电镜检测细胞超微结构的改变。结果保存角膜环第14天角膜内皮活细胞率,对照组为(10.35±1.32)%,A组为(62.18±1.56)%,B组为(92.57±0.90)%,C组为(71.01±2.67)%,D组(82.59±1.45)%,与对照组比较,各保存时间各实验组活细胞率均高,差异有统计学意义(P<0.01)。保存第14天,对照组保存的角膜环明显水肿、混浊不透明、内皮细胞形态结构不完整,超微结构显示角膜内皮细胞Y型连接断裂;而实验B、D组,保存的角膜环轻度水肿、后弹力层皱褶少、角膜透明度高、内皮细胞形态结构完整,超微结构显示保存角膜内皮细胞连接紧密,Y型连接无明显断裂,细胞表面可见较丰富的微绒毛,胞体大,核突起明显。结论bFGF和EGF在角膜中期保存液中均有促进细胞增殖、保持角膜细胞活性的作用,以bFGF作用更明显。     

Na^＋-K^＋-ATP酶活性及其α1催化亚基在鸡晶状体中的分布

目的对Na^＋-K^＋-ATP酶催化亚基蛋白在鸡晶状体的上皮层、周边部和中央部纤维的分布和酶活性进行检测和比较。方法将部分胚胎第10天（E10）的鸡晶状体显微解剖为晶状体上皮部、周边部纤维和中央部纤维3个部分，剩余部分制备冰冻切片。利用免疫荧光染色和Western blot方法检测Na^＋-K^＋-ATP酶催化亚基（α）在晶状体各部分的表达，通过检测哇巴因敏感的ATP水解率测定Na^＋-K^＋-ATP酶的活性。结果在晶状体切片上，α1催化亚基蛋白在晶状体上皮细胞（LECs）膜上有很强的表达，而在晶状体纤维细胞膜的表达明显减弱，在周边部上皮细胞的表达有明显的极性，而在中央部上皮细胞中未见表达。Western blotting检测也再次证实α1催化亚基蛋白在LECs中的表达明显高于在晶状体纤维中的表达。上皮层Na^＋-K^＋-ATP酶的活性是周边部纤维酶活性的2倍，是中央部纤维酶活性的11倍。结论Na^＋-K^＋-ATP酶α1催化亚基蛋白在鸡晶状体的上皮细胞和纤维上表达；在鸡晶状体上Na^＋-K^＋-ATP酶及其活性的分布是不均一的。     

α-GalCer活化的自然杀伤T细胞对高危角膜移植后排斥反应的防治作用

背景 角膜移植排斥反应是导致角膜移植手术失败的主要原因,抑制角膜移植排斥反应的各种药物均有不良反应.研究发现自然杀伤T(NKT)细胞可致器官移植患者免疫耐受,但目前有关NKT细胞用于治疗高危角膜移植免疫反应的研究较少. 目的 探讨体外α-GalCer活化的NKT细胞在防治大鼠高危角膜移植免疫排斥反应中的作用. 方法 无菌条件下取Lewis大鼠脾脏淋巴细胞,加入质量浓度为100 mg/L的α-GalCer,在RPMI 1640培养基培养1周后,流式细胞仪分选出NKT细胞(密度为5×106个/ml).取10只Fisher 344大鼠为供体,20只Lewis大鼠为受体,受体角膜移植前1周角膜缝线诱导角膜新生血管(CNV).将受体大鼠按照随机数字表法随机分为NKT细胞组和生理盐水组,每组各10只.Lewis大鼠行穿透角膜移植.NKT细胞组在手术结束时球后注射0.1 ml NKT细胞液,生理盐水组注射相同体积的生理盐水.术后裂隙灯下观察记录角膜植片的反应情况并按照Holland的标准进行评分.术后第14天,两组各获取3只大鼠角膜植片行组织病理学检测,采用免疫组织化学法检测角膜植片中CD4+和CD8+T淋巴细胞的浸润情况.结果 生理盐水组角膜植片平均存活时间为(7.90±1.37)d,NKT细胞组为(14.70±1.49)d,差异有统计学意义(t=10.61,P=0.00).术后2周,生理盐水组角膜植片重度混浊水肿,大量炎性细胞浸润,新生血管长入植片,而NKT细胞组角膜植片仅轻度混浊、水肿,炎性细胞明显少于生理盐水组.免疫组织化学检测可见,生理盐水组角膜植片中大量CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润,NKT细胞组中CD4+和CD8+T淋巴细胞明显减少.流式细胞仪检查结果表明,NKT细胞组大鼠脾脏中NKT细胞百分数为(5.67±0.25)％,明显高于生理盐水组的(1.21±0.19)％,差异有统计学意义(t=8.43,P=0.00).结论 α-GalCer活化的NKT细胞球后注射可以明显延长大鼠高危角膜移植植片的存活时间,为角膜移植排斥反应的防治提供了新的手段.     

白内障超声乳化术后角膜内皮细胞的形态学变化

目的 探讨白内障超声乳化术对角膜内皮细胞（CEC）形态学的影响.方法 自身对照研究.50例（50眼）行白内障超声乳化联合人工晶状体植入术,用角膜内皮显微镜（CSM）对手术前及术后12个月角膜中央及5.5 mm处12点、3点、6点、9点5个点位,每一点位的5个区域（中央-C、上方-S、颞侧-T、鼻侧-N、下方-I）,共25个点的CEC进行拍照及图像合并.计算图像数字化后的CSM常用参数及新参数：细胞分型比例、细胞边长变异、角度变异、暗区面积等.采用单因素方差分析中的Dunnett-q检验比较各象限参数与中央区参数,手术前后的参数比较采用配对t检验.结果 术后12个月与术前比较,细胞密度（CD）[术前（2 854-＆#177;290） cells/mm2、术后（2 035＆#177;150）cells/mm2,t=17.86]、平均细胞面积（Save）[术前（351土29）μm2、术后（606＆#177;59）μm2,t=27.14]差异均有统计学意义（P均＜0.01）;六角形细胞比例（HEX）[术前（63.5＆#177;4.2）％、术后（61.2＆#177;3.7）％]、六角形细胞边长变异（Ev）[术前（19.7＆#177;2.5）％、术后（20.2＆#177;2.2）％]、六角形细胞角度变异（Av）（术前158.4＆#176;＆#177;27.5＆#176;、术后155.3＆#176;＆#177;19.1＆#176;）、多边形细胞比例[术前（12.3＆#177;2.7）％、术后（11.2＆#177;3.4）％]、五边形细胞比例[术前（4.8土2.2）％、术后（5.7＆#177;2.4）％]的差异均无统计学意义;CEC暗区数量（术前0.31＆#177;0.14、术后0.83＆#177;0.25,t=18.65）及暗区面积[术前（81.3＆#177;55.2）μm2、术后（244.9＆#177;131.6）μm2,t=5.25]的差异均有统计学意义（P均＜0.01）.术后12个月,以上CEC参数在角膜中央5.5 mm范围内的4个代表性点位（12点位、3点位、6点位、9点位）和中央区相比,差异均有统计学意义（P均＜0.01）.结论 白内障术后的较长时间内CEC未完全再平均分布,采用多象限多点位分析的方法更能反映整个角膜CEC的特点.     

氮酮促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞及毒性的实验研究

目的探讨氮酮(AZONE)促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞的作用及其对细胞活性的影响。方法采用细胞培养方法,利用绿色荧光蛋白基因做报告基因,配制不同转染液,脂质体联合pEGFP-N1、氮酮联合脂质体及pEGFP-N1、氮酮联合pEGFP-N1、单纯pEGFP-N1、单纯脂质体、单纯氮酮,分别处理兔角膜内皮细胞,荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达。用RT-PCR方法检测EGFPmRNA表达情况。采用MTT法研究不同转染液对细胞活性的影响。结果单纯氮酮、单纯脂质体及对照组处理的细胞不表达绿色荧光蛋白。氮酮联合脂质体及pEGFP2N1对兔角膜内皮细胞的转染效率为42.6%,脂质体联合pEGFP2N1组的转染效率为22.4%,氮酮联合PEGFP-N1组的转染效率为7.2%,单组质粒组的转染效率为1%。氮酮加脂质体加PEGFP-N1组转染效率高于其他转染组(P<0.01)。各组转染液对角膜内皮细胞活性无影响。结论氮酮可促进脂质体介导质粒DNA转染兔角膜内皮细胞,在有效的转染浓度下对细胞无明显毒性,有望成为促进角膜内皮细胞基因转染的新型试剂。     

无血清器官培养法保存大鼠角膜内皮细胞的活性

目的:研究两种新型培养基-内皮细胞培养基(endothelial cell medium,ECM)和无动物成分培养基(animal compoundfree medium,ACF)在无血清器官培养法保存角膜内皮细胞活性方面的应用效果。方法:将大鼠角膜密闭保存于ECM和ACF培养基中4wk,再经葡聚糖T500脱水2d。以含低浓度牛血清的MEM基础培养基作为对照。计数保存前后角膜内皮细胞密度,检测保存结束大鼠角膜内皮层中胞质紧密粘连蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)的表达水平,评估内皮细胞层的屏障功能。结果:保存结束后,MEM+20mL/L FBS对照组大鼠的角膜内皮细胞密度值最低,ECM+20mL/L FBS组则高达2250±202个/mm2,ECM和ACF组结果与ECM+20mL/LFBS组接近,细胞死亡率也较低,组间差异有统计学意义(F=28.965,P=0.000)。冰冻切片显示ZO-1在保存后大鼠角膜内皮层成功表达。RT-PCR检测表明ZO-1mRNA在各组的表达趋势与内皮细胞密度结果一致(F=592.751,P=0.000)。结论:无血清ECM和ACF培养基可以很好地保持器官培养法保存角膜内皮细胞的活性和紧密连接的屏障功能。