骨髓间充质干细胞与角膜损伤修复的研究现状

骨髓间充质干细胞是一种主要存在于骨髓中具有自我更新和多向分化潜能的干细胞.目前大量国内外研究证实,骨髓间充质干细胞可以分化为角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、角膜缘干细胞,并对眼表损害的修复有重要作用.本文旨在总结骨髓间充质干细胞在角膜损伤修复的基础研究和临床治疗等方面的研究进展.     

骨髓间充质干细胞在角膜损伤修复中的应用和研究进展

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)可在体内外培养诱导分化为角膜上皮细胞、角膜缘上皮细胞和角膜基质细胞等。BMSC移植后可分化为角膜上皮细胞,有效修复损伤的角膜上皮细胞组织,能表达多种细胞因子,减少炎症细胞浸润,减轻细胞损伤,并抑制细胞凋亡,降低角膜移植后的排斥反应; BMSC还能分化促进角膜缘干细胞增殖。也可在载体上利用BMSC构建生物角膜,进行眼表修复,此为基础研究提供了新的研究方向,为临床治疗角膜损伤类疾病提出了新的临床治疗思路,在基础研究和临床运用方面都有非常巨大的潜力和广阔的前景。本文就BMSC在角膜损伤修复中的研究现状和进展进行综述。     

胚胎干细胞诱导分化视网膜细胞的方法新进展

视网膜变性疾病是引起视力丧失的重要原因,由于这类眼病的病因不明确、发病机制复杂,目前尚无有效的治疗方法.近年来,干细胞研究领域取得了突破性进展,干细胞具有分化为机体所有细胞的潜能,可以利用胚胎干细胞(ESCs)分化出各种视网膜细胞,这为视网膜变性疾病的治疗带来了新的曙光.ESCs治疗视网膜变性疾病至关重要的一步是将ESCs分化为视网膜光感受器细胞和视网膜色素上皮(RPE)样细胞.本文对自发诱导培养法、共培养法、细胞因子诱导法、单层贴壁诱导培养法和3D诱导培养法等ESCs分化为视网膜光感受器细胞和RPE细胞方法的最新进展进行综述.     

组织工程角膜三维构建的实验研究

目的以人胚胎干细胞（hESC）诱导细胞为种子细胞,以脱细胞猪角膜基质（APCM）为支架三维构建生物工程角膜,以期用于穿透性角膜移植,解决角膜供体极度匮乏的难题。方法实验研究。无菌条件下将新鲜猪角膜组织置于0.5% SDS溶液中4 ℃脱细胞 24 h,获取APCM。将hESCs与人角膜基质细胞通过Transwell共培养5 d,获取眼周间充质干细胞（POMPs）,再于人晶状体上皮细胞源性条件培养基继续培养14 d获取角膜内皮样细胞并进行鉴定和筛选纯化。将纯化后扩增的角膜内皮样细胞接种于APCM构建角膜内皮植片,并移植入角膜内皮功能失代偿动物模型进行泵功能评估;采用人角膜缘干细胞（LSCs）来源的条件培养基培养hESCs 12 d,诱导其分化人角膜上皮样细胞并筛选鉴定,将其与APCM构建的角膜上皮植片移植于LSC失代偿动物模型的角膜缘,观察其眼表修复能力。结果诱导的人角膜内皮样细胞表达内皮细胞相关标记物vimentin、N-cadherin、Na+/K+ATP酶和ZO-1。构建的角膜内皮植片能够促使角膜内皮功能失代偿动物的角膜逐渐恢复透明。构建的角膜上皮细胞植片具有4～5层细胞复层结构,类似于正常角膜上皮,且能够一定程度上修复LSC失代偿动物模型眼表。结论采用hESCs诱导分化来源的细胞与APCM构建的人角膜内皮植片和人角膜上皮植片具有类似于正常角膜的功能,为全层生物角膜的构建提供了良好的实验和理论基础,具有良好的临床应用前景。     

干细胞移植修复眼表损伤的研究进展

角膜缘干细胞、口腔黏膜细胞、胚胎干细胞、骨髓问充质干细胞等多种来源干细胞在修复眼表损伤的研究中都取得了较大的进展.本文就角膜上皮的组织结构、功能特征及上皮细胞的生物学特点,对胚胎干细胞和多种成体干细胞向角膜上皮细胞的分化及其对眼表损伤修复过程的影响进行了阐述,并对其各自的临床应用前景和存在的问题进行了讨论.(中华眼科杂志,2009,45:658-662)     

角膜基质诱导胚胎干细胞定向分化的初步实验研究

目的:探索角膜基质接触诱导胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES.细胞)定向分化的可能性。方法:分别在去上皮的新西兰白兔表层角膜缘基质上、晶状体上皮细胞饲养层上培养ES-D_3细胞,裸鼠皮下移植使其形成复层细胞,一段时间后,行扫描电镜和光镜观察。结果:I.ES细胞在新鲜表层角膜缘基质上增殖缓慢,2～3周形成较大细胞集落,光镜下细胞形态单一,体积较正常ES细胞大,电镜下细胞核已演变为细长形,移植到裸鼠皮下2周形成上皮样细胞复层,电镜下可见微绒毛,而角膜基质非上皮面的ES细胞仍保持其小细胞状态不变。2.晶状体上皮细胞与ES细胞共培养只能延缓其分化时间,不能诱导其定向分化。结论:表层角膜缘基质具有诱导ES细胞定向分化的潜能,体外培养条件下可能不发生晶状体诱导的第三级胚胎诱导。眼科学报1999;15:195-198。     

干细胞与角膜眼表重建研究进展

角膜是眼表的重要防护屏障和光学系统的重要组成部分,其完整性和透明性是实现有效视功能的重要前提。各种原因造成的眼表疾病未经及时有效治疗都有可能发展到终末阶段———角膜缘干细胞功能障碍,包括角膜缘干细胞数目的减少和微环境的病理改变。自体角膜移植无疑是治疗角膜缘干细胞功能障碍最有效的方法。但是供体角膜来源十分有限,且切除健眼组织行角膜移植可能会对健眼造成长期损害。随着干细胞研究的不断深入和组织工程技术的兴起,组织工程角膜应运而生,并且迅速发展。其基本原理为选用生物性能良好的支架材料,体外模拟角膜缘干细胞微环境,诱导各类种子干细胞分化为角膜类上皮,然后再行角膜眼表重建。常用种子细胞包括角膜缘干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、骨髓间充质干细胞、皮肤干细胞、口腔黏膜干细胞。本文就上述干细胞在角膜眼表重建中的应用作一综述。     

间充质干细胞在角膜损伤修复和角膜移植中的应用

严重损伤后角膜的修复及角膜移植后的抗免疫排斥反应是角膜疾病治疗中的重点和难点.间充质干细胞可在特定环境下诱导分化为角膜上皮细胞、角膜基质细胞等细胞类型,或通过旁分泌作用抑制炎性反应及新生血管的生成,进而保护损伤组织,促进角膜修复.此外,间充质干细胞还具有抗炎和调节免疫的特性,使其在抗角膜移植排斥反应中发挥作用.     

联合标记在角膜缘干细胞鉴别中的应用

角膜缘干细胞是角膜上皮更新和修复的来源,眼表正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成.近年来,眼角膜缘干细胞的定位与鉴别也有了进一步发展,大量证据显示角膜缘干细胞位于角膜缘区域的微生境(niche)内,对微生境进行角膜缘相关标记物的研究也发现其区域内大量细胞高表达干细胞的相关标记.然而,到目前为止任何一种单独的标记物均不能特异性地鉴别角膜缘干细胞,而较可靠的方法是标记物的联合应用,或联合角膜缘于细胞自身的一些特征如小细胞特性、慢细胞周期特性等来进行鉴别.本文就角膜缘干细胞的鉴别以及联合标记在干细胞鉴别中的应用作一综述.     

联合标记在角膜缘干细胞鉴别中的应用

角膜缘干细胞是角膜上皮更新和修复的来源,眼表正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成.近年来,眼角膜缘干细胞的定位与鉴别也有了进一步发展,大量证据显示角膜缘干细胞位于角膜缘区域的微生境(niche)内,对微生境进行角膜缘相关标记物的研究也发现其区域内大量细胞高表达干细胞的相关标记.然而,到目前为止任何一种单独的标记物均不能特异性地鉴别角膜缘干细胞,而较可靠的方法是标记物的联合应用,或联合角膜缘于细胞自身的一些特征如小细胞特性、慢细胞周期特性等来进行鉴别.本文就角膜缘干细胞的鉴别以及联合标记在干细胞鉴别中的应用作一综述.     

胚胎干细胞体外培养及在眼科的研究进展

胚胎干细胞（ESC）具有体外无限增生和自我更新并能够分化为体内各种细胞的潜能。ESC独特的生物学特性被广泛应用于生物和医学研究领域,因此,成功地培养ESCs对于更深入地探讨ESCs的作用机制是非常有帮助的。目前,培养和分化的ESCs已用于一些眼科疾病的治疗,如视网膜变性性疾病和严重的角膜疾病等。ESC在动物和人的胚胎发育、致畸实验、组织工程和移植治疗等研究领域具有重要的科学意义和巨大的应用前景。对胚胎干细胞的发展、体外培养体系及在眼科研究进展进行综述。     

脂肪干细胞在眼科的应用及研究进展

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是存在于脂肪组织的间充质干细胞,具有多向分化潜能,在特定的条件下可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等中胚层细胞,甚至可以跨胚层分化为神经细胞等外胚层细胞及肝细胞等内胚层细胞。ADSCs还有易于获取、对取材区损伤小等众多优势,使其成为组织修复等领域的热点之一。本文对ADSCs的生物学特性及其在眼科领域的研究进行了分类总结,以期为ADSCs在眼科的应用研究给予有益的提示。     

诱导人脐带间充质干细胞分化为角膜上皮样细胞的研究

背景眼表疾病导致的角膜盲已成为全球致盲性角膜疾病中的主要原因之一。随着组织工程技术的发展和进步,组织工程角膜为眼表疾病的治疗开辟了新的途径。目的观察体外培养的人脐带间充质干细胞（UC—MSCs）移植到兔角膜基质后的分化发育情况,探讨人UC-MSCs分化为角膜上皮细胞以及治疗兔角膜损伤的可行性。方法获取人脐带组织,采用Ⅳ型胶原酶消化法分离纯化人UC—MSCs并传代,取第3代细胞用于扩增和实验。流式细胞仪检测细胞的免疫表型及诱导成骨分化鉴定。24只新西兰大白兔按随机数字表法随机分为2个组,将人UC—MSCs接种于去上皮的猪角膜基质上,培养4d后行实验组兔左眼板层角膜移植;对照组以相同的手术方法单纯移植去上皮猪角膜基质。术后对角膜定期行活体激光共焦显微镜检查,并分别于术后2、4、8周摘除各组实验眼行组织病理学和免疫荧光检查,评价移植到兔角膜基质的人UC-MSCs的存活、分化以及移植局部的反应等;应用免疫荧光技术检测移植后角膜上皮细胞中角蛋白3（CK3）、CKl2以及转运蛋白G超家族成员（ABCG2）的表达。结果消化培养的人UC—MSCs呈圆形,细胞胞体较大,贴壁后细胞呈长梭形。培养获得的人UC—MSCs的细胞表型CD105^＋／CD29^＋／CD44^＋／CD34^-／CD45^-,并可诱导分化为成骨细胞。实验组人ISC—MSCs接种到去上皮猪角膜基质后贴附良好、生长迅速,术后植片在植床上存活良好,种植了人UC-MSCs的去上皮猪角膜移植到兔眼,可见实验组受体角膜较对照组透明,未见明显新生血管,在活体共焦显微镜下可见新生的角膜上皮样细胞,未发生免疫排斥反应。免疫荧光检测可见在重建的角膜上皮层检测到CK3及CKl2的阳性表达,而未见ABCG2的表达。结论将种植了人UC—MSCs的猪角膜基质移植到损伤的兔角膜后,人UC—MSCs可以存活、增生并分化为角膜上皮样细胞,可用于修复甚至重建损伤的角膜表层。     

兔骨髓间充质干细胞及人羊膜上皮细胞移植治疗兔角膜缘干细胞缺损的研究

背景角膜缘干细胞缺乏可引起致盲性眼病,但传统的治疗方法疗效欠佳。最近的研究表明,骨髓间充质干细胞（BMSCs）和人羊膜上皮细胞（AECs）有分化成多种细胞的能力,但其对角膜缘于细胞缺乏的疗效仍有待研究和评价。目的观察和对比兔BMSCs和人AECs移植治疗兔角膜缘干细胞缺损的治疗效果。方法将18只新西兰白兔采用随机数字表法分为羊膜基质（AS）移植组、兔BMSCs移植组和人AECs移植组,每组6只。将浸有NaOH溶液的滤纸贴附于角膜表面建立碱烧伤角膜缘干细胞缺损的动物模型。抽取兔髂窝处骨髓并收集人胎盘组织分别分离、制备兔BMSCs和人AECs,通过密度梯度离心加贴壁培养法及胰蛋白酶多次分步消化法获取兔BMSCs和人AECs,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法对培养细胞进行鉴定,再接种于人去上皮AS上,按照动物的分组分别将上述材料缝合至动物模型的角膜表面。术后28d,对各组动物的角膜新生血管（CNV）评分以及角膜混浊度评分进行对比,对角膜组织行组织病理学检查并针对角膜上皮细胞特异性标记物细胞角蛋白3（CK3）行免疫组织化学染色。结果第3代兔BMSCs接种于AS载体上12h后贴附生长,第1代人AECs接种于AS载体上48h后呈单层膜状生长,传代细胞经RT—PCR鉴定符合目标细胞的特征。兔BMSCs移植组术后28d,免疫组织化学染色结果显示,兔BMSCs移植组和人AECs移植组的角膜表面细胞CK3均呈阳性表达,而AS组CK3表达阴性。与AS移植组比较,兔BMSCs移植组和人AECs移植组CNV评分以及角膜混浊度评分明显降低,差异均有统计学意义（BMSCs：Z=-2．983,P=0．003;Z=-2．844,P=0．004;AECs：Z=-2．817,P=0．005;Z=-2．041,P=0．041）。组织病理学检查显示,AS组兔角膜组织有较多的炎性细胞生长,胶原纤维排列紊乱。兔BMSCs组术后角膜表层形成了角膜上皮样的复层结构,无明显杯状细胞,角膜基质内无新生血管生长,炎性细胞减少,胶原纤维排列更加规则,且兔BMSCs移植组角膜透明度明显优于人AECs移植组,差异有统计学意义（Z=-2．091,P=0．037）,而2组间CNV评分的差异无统计学意义（Z=-0．267,P=0．789）。结论移植至兔角膜缘干细胞缺损角膜表面的兔BMSCs和人AECs均能分化为角膜上皮细胞样细胞,可抑制CNV,减轻角膜混浊。在改善角膜透明度方面,兔BMSCs优于人AECs。     

骨髓间充质干细胞移植治疗视网膜病变

目前,对视网膜病变的治疗仍缺乏有效的药物.为解决视网膜损伤的修复问题,有研究者用胚胎干细胞、胚胎视网膜祖细胞、成体哺乳动物眼干细胞等进行了实验,但这些方法都存在着伦理学和移植学上的不足.骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)是骨髓中一类具有多向分化潜能的细胞群,在体外可诱导分化为神经元样细胞,进行BMSC移植,为视网膜病变的治疗提供了一条新的途径.现就BMSC生物学特征、体外的分离和纯化、向神经元样细胞的诱导分化及在视网膜病变治疗中的研究进展作一综述.     

Induced pluripotent stem cells as a potential therapeutic source for corneal epithelial stem cells

Corneal blindness caused by limbal stem cell deficiency (LSCD) is one of the most common debilitating eye disorders. Thus far, the most effective treatment for LSCD is corneal transplantation, which is often hindered by the shortage of donors. Pluripotent stem cell technology including embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) have opened new avenues for treating this disease. iPSCs-derived corneal epithelial cells provide an autologous and unlimited source of cells for the treatment of LSCD. On the other hand, iPSCs of LSCD patients can be used for iPSCs-corneal disease model and new drug discovery. However, prior to clinical trial, the efficacy and safety of these cells in patients with LSCD should be proved. Here we focused on the current status of iPSCs-derived corneal epithelial cells used for cell therapy as well as for corneal disease modeling. The challenges and potential of iPSCs-derived corneal epithelial cells as a choice for clinical treatment in corneal disease were also discussed.     

Corneal stromal mesenchymal stem cells: reconstructing a bioactive cornea and repairing the corneal limbus and stromal microenvironment

Corneal stroma-derived mesenchymal stem cells(CS-MSCs) are mainly distributed in the anterior part of the corneal stroma near the corneal limbal stem cells(LSCs). CS-MSCs are stem cells with self-renewal and multidirectional differentiation potential. A large amount of data confirmed that CS-MSCs can be induced to differentiate into functional keratocytes in vitro, which is the motive force for maintaining corneal transparency and producing a normal corneal stroma. CS-MSCs are also an important component of the limbal microenvironment. Furthermore, they are of great significance in the reconstruction of ocular surface tissue and tissue engineering for active biocornea construction. In this paper, the localization and biological characteristics of CS-MSCs, the use of CS-MSCs to reconstruct a tissue-engineered active biocornea, and the repair of the limbal and matrix microenvironment by CS-MSCs are reviewed, and their application prospects are discussed.