外源性小鼠干扰素诱导蛋白-10抑制实验性角膜新生血管的作用机制

背景 干扰素诱导蛋白-10(IP-10)作为趋化因子调节免疫炎症反应方面的作用已被证实,但最近的研究发现其在抑制新生血管生成方面发挥一定的作用.角膜新生血管(CNV)的形成与多种血管新生相关因子有关,IP-10对CNV形成的作用及机制尚不明确. 目的 探讨外源性小鼠IP-10点眼对角膜碱烧伤诱导CNV形成的作用.方法 选用SPF级BALB/c小鼠82只,并按随机数字表法分组.采用浸润1 mol/LNaOH的滤纸贴附于左眼角膜中央40 s的方法制作角膜碱烧伤小鼠模型,角膜碱烧伤后1d及7d开始局部应用IP-10共7d分别作早期点眼组10只眼和中晚期点眼组5只眼,各自的模型对照组均给予质量分数0.2％透明质酸钠(HA)点眼(分别为11只眼和6只眼).早期点眼组于造模后2周,中晚期点眼组于造模后3周取角膜组织以CD31免疫荧光标记法比较模型对照组及实验组的CNV面积.收集早期IP-10碱烧伤后2d及4d小鼠的角膜组织,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测并比较各组小鼠角膜组织中趋化因子受体3(CXCR3)、血管内皮生长因子(VEGF)及转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA的表达情况.所有实验动物的使用、饲养及处死均按照视觉及眼科学研究协会的有关规定及苏州大学的《实验动物管理及使用指南》进行.结果 模型对照组小鼠CNV占角膜面积的比例为(88.67±10.22)％,IP-10早期点眼1周组小鼠CNV占角膜面积的(70.06±12.21)％,差异有统计学意义(t=3.77,P=0.00).角膜碱烧伤后21 d,模型对照组小鼠CNV占角膜面积的比例为(87.33±13.47)％,IP-10中晚期点眼1周组CNV占角膜面积的(86.56±12.47)％,差异无统计学意义(t=1.260,P＞0.05).IP-10早期点眼2d和4d的小鼠角膜组织中CXCR3的表达较模型对照组同期值明显升高(t=3.13、3.07,P＜0.05)、VEGF表达降低(t=5.99、6.27,P＜0.01)、TGF-β1表达降低(t=8.50,P＜0.01;t=4.53,P＜0.05).结论 角膜碱烧伤后外源性IP-10蛋白早期干预可通过上调CXCR3和下调VEGF及TGF-β1的表达抑制CNV的形成,中晚期干预不能减少角膜碱烧伤诱导的CNV.     

趋化因子受体4拮抗剂对实验性角膜新生血管的抑制作用及其机制

背景基质细胞源性细胞因子1α/趋化因子受体4（SDF-1αCXCR4）信号途径是机体内介导多种细胞趋化、黏附以及增生的关键分子,能通过促进血管内皮祖细胞向肿瘤组织的迁移而促进肿瘤新生血管的发生,同时也参与新生血管性眼病的病理过程。目的探讨阻断CXCR4信号通路对实验性角膜新生血管（CNV）发生发展的抑制作用及机制。方法收集8周龄BALB／c小鼠80只,将浸有1mol／LNaOH的滤纸贴附在左眼角膜中央40S以诱导小鼠CNV,按随机数字表法将动物分为透明质酸钠组（质量分数0．2％透明质酸钠点眼）及CXCR4拮抗剂组（0．2％透明质酸钠配制的CXCR4拮抗剂点眼）,自碱烧伤当日分别用相应的药物点眼共14d,于第14天裂隙灯下观察两组小鼠的CNV,然后制备角膜悬液,用流式细胞技术检测角膜悬液中CD31的表达值;制备角膜组织切片,以逆转录PCR（RT—PCR）和Western blot法检测CXCR4mRNA和蛋白在小鼠角膜组织中的表达,以免疫组织化学法检测角膜组织内CD31阳性标记的血管内皮细胞。以ELISA法检测角膜组织裂解液内血管内皮生长因子（VEGF）的表达。使用CXCR4拮抗剂干预小鼠腹腔来源的巨噬细胞,检测粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM—CSF）刺激后培养上清液中VEGF的表达。结果小鼠角膜碱烧伤后2周,裂隙灯下可见CNV达高峰,与透明质酸钠组比较,CXCR4拮抗剂组CNV明显减少;角膜免疫组织化学检测显示,CXCR4拮抗剂组小鼠角膜中CD31阳性染色强度弱于透明质酸钠组,CD31阳性细胞数量明显减少;进一步流式细胞技术检测发现,CXCR4拮抗剂组CD31阳性表达率为（9．50±2．34）％,明显低于透明质酸钠组的（17．50±3．16）％,差异有统计学意义（t=-7．312,P〈0．05）;RT—PCR和Western blot法检测表明,碱烧伤后2、4、7d小鼠角膜组织中CXCR4mRNA和蛋白的表达均明显高于正常小鼠角膜组织,组间比较差异均有统计学意义（P〈0．01;P〈0．05）。ELISA检测结果显示,CXCR4拮抗剂点眼后4d、7d角膜组织内VEGF表达明显低于透明质酸钠组,差异均有统计学意义（t=10．927、5．151,P〈0．05）。体外实验发现,细胞培养后12、24和48h,GM—CSF＋CXCR4拮抗剂组上清液中VEGF的表达水平明显低于GM—CSF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论CXCR4拮抗剂能通过下调VEGF的表达抑制实验性CNV的形成。     

趋化因子CX3CL1和CCL2对人单核细胞来源巨噬细胞的作用及意义

背景 研究发现巨噬细胞及其分泌的趋化因子与角膜新生血管（CNV）的发生相关.巨噬细胞具有异质性,在不同的微环境以及不同的刺激条件下发挥不同的作用. 目的 检测C-X3-C趋化因子配体1（CX3CL1）和C-C趋化因子配体2（CCL2）对巨噬细胞增生的作用,并探讨其意义. 方法 7～8周龄雄性BALB/c小鼠20只,用角膜碱烧伤的方法构建左眼CNV模型,术后4d在裂隙灯显微镜下检查小鼠CNV情况,颈椎脱臼法处死小鼠并制备角膜切片.用荧光免疫组织化学法检测小鼠角膜组织中巨噬细胞表面两种趋化因子受体C-C趋化因子受体2（CCR2）和CX3CR1的表达.用密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,在含质量分数10％胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液中加入30 μg/L粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）,诱导和培养人外周血单核细胞来源的巨噬细胞.将培养的细胞分为CD68＋CCR2组和CD68＋CX3CR1组,分别加入CD68＋CCR2抗体和CD68＋CX3CR1抗体,每组2管,其中一管作为IgG同型对照.采用流式细胞仪分别检测小鼠碱烧伤角膜组织中巨噬细胞和人外周血巨噬细胞中CX3CR1以及CCR2的表达.分别用人重组CX3CL1和CCL2蛋白刺激巨噬细胞,实时定量PCR（real-time PCR）法检测干预后巨噬细胞中血管内皮生长因子（VEGF）、血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶1（ADAMTS-1）、凝血酶敏感蛋白1（TSP-1）等血管生成相关因子的表达.结果 角膜碱烧伤后4d,裂隙灯显微镜下可见角膜局部有新生血管发生,CNV沿角膜缘向角膜中心区域延伸.荧光免疫组织化学法检测发现,角膜组织内有F4/80阳性的巨噬细胞浸润,其表面可见CCR2和CX3CR1分子的表达,呈绿色荧光.未受GM-CSF诱导培养的巨噬细胞能维持生长约2周,但死亡细胞较多,而经GM-CSF诱导培养的细胞生长稳定,细胞数量增加,无明显悬浮死亡现象.培养的巨噬细胞中CX3CR1表达率平均约为75％,CCR2表达率为45％.Real-time PCR法检测发现,CCL2干预后巨噬细胞中VEGF mRNA的相对表达量明显增加,其中150 mg/L CCL2组VEGF mRNA的相对表达量明显高于对照组,差异有统计学意义（t=-5.09,P=0.03）,而ADAMTS-1 mRNA、TSP-1 mRNA表达下降,其中150 mg/L CCL2组ADAMTS-1 mRNA、TSP-1 mRNA表达明显低于对照组,差异有统计学意义（t=3.01,P=0.04;t=4.27,P=0.02）.CX3CL1干预后巨噬细胞中VEGF mRNA表达量明显下降,而ADAMTS-1mRNA、TSP-1 mRNA的表达水平升高,与对照组相比,150 mg/L CX3CL1组VEGF mRNA表达量下降,ADAMTS-1 mRNA、TSP-1mRNA表达量下降,差异均有统计学意义（t=6.35,P=0.02;t=-2.92,P=0.04;t=-3.81,P=0.03）. 结论 CCL2、CX3CL1能通过其对应受体影响巨噬细胞VEGF、ADAMTS-1、TSP-1等血管新生相关因子的表达,提示通过CCL2、CX3CL1等干预靶点治疗新生血管性眼病的可能.     

重组人内皮抑素抑制角膜新生血管的实验研究

目的研究重组人内皮抑素（rHES）对碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管（CNV）的抑制效应。方法60只Wistar大鼠按随机数字表法分为正常组、阳性对照组、rHES组3组,每组各20只。阳性对照组右眼角膜碱烧伤后不治疗;rHES组右眼角膜碱烧伤后立即100mg／mL rHES点眼,每日3次;20只正常鼠不做任何干预处理作为正常组。观察碱烧伤后1、4、7、10、14d各组角膜情况及CNV的生长面积。碱烧伤后第16天处死动物,取角膜行组织病理学检查。免疫组织化学、PCR检测血管内皮生长因子（VEGF）蛋白量和mRNA在角膜组织的表达,透射电镜下检查碱烧伤后角膜组织的超微结构变化。结果rHES组角膜在碱烧伤后各时间点新生血管面积均小于阳性对照组（t4d=3．294,P=0．040;t7d=5．391,P=0．000;t10d=6．560,P=0．000;t14d=10．346,P=0．000）。角膜碱烧伤后第16天各组VEGF蛋白表达量的差异有统计学意义（F=337．62,P=0．00）,各组VEGF mRNA表达量的差异有统计学意义（F=114．43,P=0．00）。透射电镜检查显示正常组结构正常,rHES组较阳性对照组角膜结构变化小。PCR结果发现rHES组VEGF mRNA的相对表达量低于阳性对照组,但高于正常组。结论rHES用于眼表可有效抑制碱烧伤诱导的CNV。     

瘦素和血管内皮生长因子在碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管模型中的表达

目的 观察碱烧伤后不同时期角膜的组织病理学变化,以及瘦素和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VFGF)的表达,探讨它们与角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的关系.方法 使用碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管模型,采用浸润1 mol·L-1 NaOH溶液、直径为3 mm的单片滤纸,准确置于大鼠右眼角膜中央30 s,制作CNV模型.25只SD大鼠右眼为实验眼,随机分成5组,每组5眼,左眼为正常对照眼.每天用裂隙灯显微镜观察角膜新生血管,分别计算新生血管长度和面积.并行HE染色和免疫组织化学检测.结果 碱烧伤后4 d、7 d、14 d、21 d,实验组CNV面积分别为:(2.55±0.15)m2、(4.15±0.36)mm2、(10.21±0.45)mm2、(8.56±0.06)mm2.免疫组织化学检测显示角膜碱烧伤后1 d,实验组瘦素、VEGF的表达开始增高,碱烧伤后14 d达高峰,14 d后瘦素、VEGF的表达下降,21 d后显著下降;其表达部位主要分布在形成的新生血管区域和上皮层;正常对照组瘦素可微弱表达于角膜上皮层和基质层,VEGF没有表达或仅在上皮基底膜有微弱表达.实验组角膜瘦素、VEGF阳性表达率较对照组明显增加(χ2=29.07,P=0.001;χ2=35.51,P=0.001),瘦素与VEGF的表达具有正相关性(r=0.95,P=0.001).结论 瘦素和VEGF表达水平与角膜新生血管的生成具有相关性,瘦素可能成为治疗CNV的靶点.     

血管内皮生长因子与大鼠角膜新生血管生长及退化的相关性实验研究

目的 观察大鼠碱烧伤后角膜新生血管（corneal neovascularization,NCV)的生长及退化过程和角膜中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA的变化，探讨两者间的相互作用。方法 建立大鼠角膜碱烧伤新生血管模型，利用角膜灌注和照相方法对CNV进行观察。在不同时间点提取角膜的总RNA，并用半定量逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）检测VEGF mRNA。应用结膜下注射地塞米松治疗CNV，并观察其对VEGF表达的调节作用。结果 大鼠角膜碱烧伤后角膜新生血管的生长过程可分为3个阶段：（1）角膜新生血管的初期阶段（烧伤后2d内）；（2）角膜新生血管的增长阶段（烧伤后3－10d）；（3）新生血管的退化阶段（烧伤2周后）。实验发现VEGF mRNA在烧伤后24h达到高峰，是正常角膜的5．3倍；在烧伤后第4天，VEGF mNRA水平为正常时1倍；第7天时，VEGF mRNA下降至正常。地塞米松组CNV生长与VEGF mRNA的表达均受到抑制，在烧伤后24h VEGF的表达是正常时的3．24倍，抑制率为38．8％；烧伤后4d，较对照组VEGF的表达下降了16．2％。地塞米松组CNV面积抑制率分别是对照组的21．7％（烧伤后第4天）和23．7％（烧伤后第7天）。结论 VEGF mRNA的升高及降低同CNV的发生及退化关系密切，激素对角膜新生血管的抑制与对VEGF表达的抑制相关。     

外源性肿瘤坏死因子α对碱烧伤诱导角膜新生血管的影响及机制

目的探讨外源性肿瘤坏死因子α（TNF—α）局部干预对碱烧伤诱导角膜新生血管（CNV）形成的影响及内在机制。方法BALB／c小鼠45只,利用碱烧伤法制作左眼CNV模型。根据实验设计．分3组实验进行研究。①CNV模型小鼠15只,随机分为3组,每组5只。自伤后分别给予100、500μg／ml TNF—α（实验组）或0-2％透明质酸钠（HA,对照组）点眼1周。于碱烧伤后第14天处死小鼠取眼球,免疫组织化学法检测各组角膜组织中CD31的表达,计数微血管密度（MVD）,分析TNF-α对碱烧伤CNV形成的作用。②CNV模型小鼠20只．随机分为2组,每组10只。实验组给予100μg／mlTNF一仅点眼,对照组给予0．2％HA点眼。分别于伤后第2天和第4天随机取5只小鼠处死取角膜．RT—PCR法检测角膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达情况,分析TNF—α对碱烧伤角膜中VEGF表达的影响。③利用二氯亚甲二磷酸脂质体（Cl2MDP—lip）射制作小鼠巨噬细胞特异剔除模型,10只BALB／c小鼠随机分为Cl2MDP—lip实验组及PBS—lip对照组,每组5只。所有小鼠自碱烧伤后均给予100μg／mlTNF-α滴眼1周于.伤后第14天拍照记录CNV形成情况,图像分析软件测算CNV长度及面积,分析巨噬细胞在TNF—α调控碱烧伤后CNV形成中的作用。结果①碱烧伤后第14天,100μg／mlTNF-α组CNV形成较对照组明显增多．而500μg／ml TNF-α组CNV形成与对照组差异不明显。整张切片和热点区域MVD值,100μg／ml TNF-α组为63．25±9．75和114．94±12．93,500μg／ml TNF-α组为39．53±10．41和108．04±23．55．0．2％HA对照组为30．99±7．08和73．81±13．80和100μg／mlTNF—α组与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）,而500μg／mlTNF-α组与对照组相比差异无统计学意义（19〉0．05）。②碱烧伤后第2天和第4天VEGFmRNA与β—actin的比值,100μg／mlTNF-α组为0．40±0．12和1,51±0．21,0．2％HA对照组为0,31±0．10和0．58±0．30。两组差异均有统计学意义（P〈0．05）。⑧碱烧伤后第14天,Cl2MDP—lip组CNV形成较对照组明显减少,Cl2MDP—lip组的CNV长度和面积分别为（0．84±0．10）mm和（6．64±1．19）mm^2,PBS—lip对照组为f1．37±0．24）mm和（12．25±1．33）mm^2,两组差异有统计学意义（P〈0．01）.结论外源性TNF-α可通过上调碱烧伤角膜组织中VEGF表达来促进CNV的形成,其促进碱烧伤CNV形成机制主要是通过巨噬细胞起作用．     

环氧合酶-2及其抑制剂对角膜新生血管作用的研究

目的 观察大鼠角膜新生血管（CNV）形成过程中环氧合酶-2（COX-2）的表达,探讨COX-2抑制剂Celecoxib对CNV的作用.方法 采用免疫组织化学方法、RT-PCR法检测碱烧伤后COX-2和VEGF蛋白、mRNA在角膜中的分布,比较实验组和对照组COX-2与VEGF蛋白和mRNA的表达量,计算二者的相关性.结果 碱烧伤2 d,CNV芽形成,4 d出现成熟的新生血管腔.活化的COX-2、VEGF蛋白和mRNA的表达在碱烧伤24 h开始增加,4 d达峰,7 d开始回落,14 d仍有表达.COX-2主要表达于大鼠角膜损伤上皮及修复的上皮层、基质层中浸润的炎性细胞和新生血管内皮细胞,VEGF与COX-2的表达部位一致.实验Ⅱ组和Ⅲ组COX-2和VEGF蛋白、mRNA表达量与对照组的差异有统计学意义（P＜0.05）,实验Ⅰ组与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 COX-2在炎性CNV形成过程中表达上调,通过调控VEGF的表达而起重要作用.Celecoxib抑制COX-2的表达,抑制CNV形成.     

血管内皮钙黏蛋白对实验性角膜新生血管的作用及机制

目的 探讨血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）在实验性角膜新生血管发生过程中的作用及机制。方法 动物实验研究。以碱烧伤诱导构建小鼠角膜新生血管模型;RT-PCR法检测VE-cadherin在碱烧伤角膜组织中的表达;碱烧伤1周后角膜局部应用阻断性抗小鼠VE-cadherin抗体进行干预,碱烧伤3周后大体观察角膜新生血管的发生情况以及全角膜铺片CD31荧光组织化学法检测角膜组织新生血管的面积;RT-PCR检测烧伤角膜组织内caspase-3 mRNA的表达;流式细胞术检测角膜组织血管内皮细胞凋亡数目;体外实验进一步验证VE-cadherin对血管内皮细胞（HREC）血管网形成的影响。采用成组t检验方法处理数据。结果 碱烧伤3周后,VE-cadherin抗体干预组角膜新生血管数目较对照组明显减少。RT-PCR结果显示VE-cadherin抗体干预组caspase-3基因水平表达增高;进一步流式细胞术检测结果显示VE-cadherin抗体干预后,角膜组织内凋亡的血管内皮细胞明显增多。体外实验证实VE-cadherin抗体明显抑制HREC细胞系血管网的形成。结论 VE-cadherin钙黏蛋白能通过维护细胞间黏附以及抑制细胞的凋亡等作用保护实验性角膜新生血管内皮细胞的生长,从而维持新生血管的发生发展。     

水通道蛋白1在大鼠角膜碱烧伤新生血管形成中的表达

目的检测大鼠角膜碱烧伤后新生血管形成过程中水通道蛋白1（AQP1）的表达变化,探讨其在角膜新生血管（CNV）形成中的作用。方法碱烧伤诱导CNV模型,将25只sD大鼠按处死的时间点不同分成5组,每组5只。每日裂隙灯下观察CNV的生长情况,并采用免疫组织化学法和RT-PCR法检测AQP1及VEGF在大鼠CNV形成中的表达。结果在正常大鼠角膜组织中,AQP1和VEGF不表达或弱表达。碱烧伤后1d,AQP1表达开始增强,第7天表达最强,14d下降,21d时仍有弱表达。RT—PCR检测显示碱烧伤后AQP1表达增强,在伤后第7天表达最明显,21d后呈弱表达（t1d=3．491,t4d=10．690,t7d=12．936,t14d=10．767,t21d=8．594,P〈0．05）。免疫组织化学检测结果表明,VEGF与AQP1的表达分布相似,强度较弱,统计学分析表明二者的表达水平呈正相关（r=0．834,P〈0．05）。结论AQP1在碱烧伤后角膜巾的表达水平与新生血管的形成明显相关。     

ADP-核糖基化因子抑制剂在实验性碱烧伤诱导角膜新生血管中的作用及其机制

背景角膜新生血管（CNV）是导致角膜盲的主要原因之一,研究表明,ADP一核糖基化因子（ARF）对肿瘤细胞的增生有调节作用,抑制ARF能抑制血管的形成,但ARF抑制剂对CNV是否发挥作用尚不清楚。目的探讨ARF抑制剂在碱烧伤诱导的CNV形成过程中的作用及其机制。方法7～8周龄清洁级雄性BABL／c小鼠60只按照随机数字表法分为PBS对照组和ARF抑制剂干预组,每组各30只。所有小鼠采用角膜碱烧伤诱导法构建CNV模型,ARF抑制剂干预组小鼠于造模后1周腹腔内注射0．5g／LARF抑制剂溶液0．5ml,每周3次,共1周,PBS对照组小鼠以同样方式注射0．5mlPBS。各组分别取24只小鼠,于造模后0、4、7、14d采用实时定量PCR（real—timePCR）和Westernblot法检测小鼠角膜组织中ARFmRNA和蛋白的动态表达,并于造模后14d,采用Westernblot法检测各组小鼠角膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达。各组另取6只小鼠,于造模后2、4、7、14d裂隙灯显微镜下观察CNV形成情况,并于造模后14d,采用全视网膜铺片免疫荧光组织化学法检测角膜组织中CD31在CNV中的表达。体外实验中应用ARF抑制剂干预人视网膜血管内皮细胞（RECs）,CCK8法和细胞划痕法检测ARF对人RECs增生和迁移的影响。实验动物的使用和喂养遵循视觉及眼科学研究协会有关规定及苏州大学《实验动物管理及使用指南》。结果造模后PBS对照组和ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织中ARFmRNA在各个时间点均有表达,在造模后14d达高峰,各组小鼠角膜中ARFmRNA的表达随着时间的延长而增加,差异有统计学意义（F时间=65．17,P=0．00）,不同时间点的组间比较差异无统计学意义（F＊＊=1．98,P=0．18）;造模后14d,ARF抑制剂干预组实验后不同时间点ARF蛋白水平相对表达值比较差异有统计学意义（F=10．77,P=0．00）。裂隙灯显微镜下检查发现,ARF抑制剂干预组CNV相对面积为0．45±0．05,PBS对照组为0．72±0．11,2个组间差异有统计学意义（t=-3．87,P〈0．05）。全角膜铺片免疫荧光组织化学法检测表明,ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织CD31表达面积明显小于PBS对照组。造模后14d,Westernblot法检测显示,ARF抑制剂干预组VEGF蛋白表达水平为1．20＋0．21,明显低于PBS对照组的2．47±0．33,差异有统计学意义（t=-5．62,P〈0．05）。CCK8法检测结果显示,随着ARF抑制剂质量浓度的增加,ARF抑制剂对人RECs的抑制率增加,差异有统计学意义（F=8．47,P=0．02）。细胞划痕实验后24h,100μg／L和1000μg／LARF抑制剂干预组人RECs迁移距离分别为（5．46±1．32）μm和（5．04±1．68）μm,与PBS对照组的（8．49±1．18）μm相比明显减小,差异均有统计学意义（t=-2．94、-2．91,P〈0．05）。结论ARF抑制剂能抑制碱烧伤诱导的CNV发生,可能与其下调VEGF的表达以及抑制血管内皮细胞的增生和迁移有关。     

新型生物肽GC31对脂多糖诱导的非特异性角膜炎的抑制作用

背景 人体血栓调节蛋白中筛选的生物肽GC31具有天然抗炎活性,相比传统的眼部抗炎药物具有优势及临床转化价值,但目前对其具体的抗炎价值评估研究较少. 目的 研究GC31对脂多糖（LPS）诱导的非特异性角膜炎的抑制作用及可能机制.方法 按随机数字表法将SPF级8～10周龄雄性Wistar大鼠60只随机分为6个组.用于角膜基质内注射10 μl LPS（2g/L,溶于PBS）的方法诱导大鼠非特异性角膜炎模型,角膜中央出现云雾状混浊为造模成功,然后于GC31低剂量组、GC31高剂量组、地塞米松组大鼠结膜下分别注射125 μg GC31、250 μg GC31和250 μg地塞米松（均溶于25 μlPBS）,PBS对照组大鼠以同样方式注射PBS,而空白对照组大鼠不给予任何干预.注射后24 h裂隙灯显微镜下观察大鼠角膜炎症表现,并按照Anand的标准进行炎症评分,然后摘除大鼠眼球,对角膜组织进行组织病理学观察;采用免疫组织化学法检测各组大鼠角膜中核因子-KB（NF-KB） p65的表达;用ELISA法检测各组大鼠角膜组织中白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α （TNF-α）蛋白的变化;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）法检测各组大鼠角膜组织中IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表达量. 结果 空白对照组、PBS对照组、GC31低剂量组、GC31高剂量组和地塞米松组大鼠眼部炎症评分差异有统计学意义（F=301.238,P=0.000）,其中GC31高剂量组大鼠角膜炎症评分为1.85±0.36,明显低于模型组的2.90±0.43,差异有统计学意义（t＇=-5.144,P=0.000）,地塞米松组大鼠角膜炎症评分为1.28±0.36,低于GC31高剂量组,差异有统计学意义（t＇=-3.931,P=0.000）.角膜组织病理学检查显示,GC31高剂量组和地塞米松组大鼠角膜组织炎性细胞浸润较模型组明显减轻;免疫组织化学法检测显示,GC31低剂量组、GC31高剂量组以及地塞米松组大鼠角膜组织中NF-κB p65阳性细胞较模型组大鼠减少;ELISA法测定     

电离辐射对角膜新生血管形成的抑制作用

背景 角膜新生血管(CNV)可发生在多种跟表疾病中,常可加重病情,但有效的临床治疗方法仍在探索中. 目的 探讨电离辐射对角膜碱烧伤后新生血管的抑制作用.方法 76只清洁级Wistar纯系大鼠中70只用角膜碱烧伤的方法建立大鼠右眼CNV模型,然后按照随机数字表法将造模动物分为β射线10 Gy一次性照射组2只、β射线7 Gy分次照射组17只、β射线10 Gy分次照射组17只、质量分数1％环孢素A(CsA)点眼组17只和角膜碱烧伤模型组17只,6只正常兔6只眼(均取右眼)作为正常对照组.用90 Sr-90Y眼科敷贴器于右眼角膜碱烧伤后第1天开始沿角膜缘进行β射线照射,1％ CsA点眼组用药时间与照射时间相同.实验后每日行裂隙灯检查并计算CNV长度和面积.于角膜碱烧伤后3、5、7d制备角膜组织石蜡切片和匀浆,采用免疫组织化学法检测各组大鼠角膜组织中bcl-2、bax、血管内皮生长因子(VEGF)的表达,分别采用Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组大鼠角膜组织中VEGF蛋白及mRNA表达的变化.结果 角膜碱烧伤后7d,裂隙灯下可见β射线10 Gy一次性照射组、β射线10 Gy分次照射组均出现角膜溃疡,角膜碱烧伤模型组可见大量CNV生成,而β射线7 Gy分次照射组和1％CsA点眼组CNV明显较少.角膜碱烧伤后7d,β射线7 Gy分次照射组、1％ CsA点眼组CNV长度和面积均明显小于角膜碱烧伤模型组,差异均有统计学意义(长度:q=14.40、24.20,P＜0.01;面积:q=17.80、14.00,P＜0.01).免疫组织化学检测表明,与角膜碱烧伤模型组比较,β射线7Gy分次照射组、1％CsA点眼组大鼠角膜中bcl-2和VEGF蛋白表达均减弱,而bax蛋白表达均增强.RT-PCR检测表明,β射线7 Gy分次照射组、β射线10 Gy分次照射组、1％CsA点眼组VEGF mRNA表达强度明显低于角膜碱烧伤模型组,Western blot检测发现VEGF蛋白的表达与VEGFmRNA的表达遵循同样的规律.结论 90Sr-90Y跟科敷贴器小剂量分次放射治疗可明显抑制角膜碱烧伤后CNV的生长,并且以β射线7 Gy分次照射作用效果最佳.     

高血糖对小鼠骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管形成的体内动态观察

背景 我们先前的研究提示高血糖可加重脉络膜新生血管（CNV）的严重程度,并有可能通过促进骨髓来源细胞（BMCs）的趋化参与血管发生,且已证实在体生物发光成像（BLI）技术能实时、活体观察CNV的动态变化,但糖尿病与CNV发生的关联性尚无明确的研究证据.目的 应用BLI技术并结合组织学研究方法,动态观察高血糖状态下BMCs参与CNV的形成过程. 方法 将荧光素酶-绿色荧光蛋白（FlucGFP）双转基因小鼠的BMCs移植至野生型C57BL/6J小鼠构建嵌合体,嵌合度＞85％的小鼠纳入实验并按照随机数字表法分为对照组和糖尿病组,每组9只.糖尿病组嵌合体小鼠采用腹腔内注射链脲佐菌素法[（STZ60 mg/（kg＆#183;d）,连续5d]建立糖尿病模型,血糖浓度＞15 mmol/L者视为建模成功,对照组不进行注射.2个组嵌合体小鼠均应用532 nm倍频激光视网膜光凝法诱导CNV形成.采用IVIS Kinetics小动物成像系统,分别于CNV模型建立后第1、3、5、7、14、21和28天对2个组小鼠进行BLI检测,动态观察CNV小鼠眼部发光信号.于CNV模型建立后第7天处死动物,制备视网膜脉络膜组织切片行苏木精-伊红染色,比较2个组小鼠CNV的长度和厚度.结果 流式缅胞仪分析显示,C57BL/6J小鼠行Fluc-GFP双转基因小鼠BMCs移植后28 d,纳入实验的嵌合体小鼠平均嵌合度为（88.85±2.46）％;糖尿病组嵌合体小鼠平均血糖浓度为（17.88±0.86） mmol/L.小鼠视网膜脉络膜组织病理学检查显示,CNV造模后第7天,新生血管穿过Bruch膜到达视网膜下腔,糖尿病组小鼠CNV长度为（338.67±33.17） μm,明显长于对照组小鼠的（180.33±24.68） μm,差异有统计学意义（t=8.943,P＜0.05）;2个组间小鼠CNV的厚度差异无统计学意义（t=1.790,P＞0.05）.CNV建模后第1天,两组小鼠眼部出现光学信号,第7天光学信号值均达最高,且糖尿病组明显强于对照组;第14天后两组小鼠眼部信号减弱.CNV建模后第5、7、14和21天,糖尿病组小鼠眼部光学信号均明显强于对照组小鼠,差异均有统计学意义（t=3.411、5.594、5.067、2.663,P＜0.05）.结论 高血糖可促使更多的BMCs参与CNV的形成过程,加重CNV的严重程度.BLI技术可用于评估和比较高血糖条件下BMCs在CNV形成过程中的动态变化.     

人羊膜匀浆上清液抑制兔角膜新生血管的研究

目的观察人羊膜匀浆上清液对家兔角膜新生血管（CNV）的抑制作用。方法63只新西兰白兔随机选取3只作为正常对照组,余60只制作双眼碱烧伤模型,随机分为4个组：A组为碱烧伤对照组滴用PBS液,B、C、D组为实验组分别滴用50、200、400μg／mL的羊膜匀浆上清液。术后1、5、7、14、28d每组分别随机处死3只兔子,行组织病理学检查,测量微血管数量、多形核白细胞（PMNL）含量、血管内皮生长因子（VEGF）的表达量。结果碱烧伤1、5、7、14、28d各时间点CNV的生长面积、微血管计数、PMNL浸润、VEGF的表达4个组差异均有统计学意义（P〈0．01）,其中D组均数最小。VEGF、PMNL、微血管计数三者呈正相关（P〈0．01）。结论羊膜匀浆上清液有减轻角膜血管化的作用,呈质量浓度依赖性,质量浓度达到400μg／mL时抑制作用显著增强。     

骨髓间充质干细胞移植对角膜化学伤后炎症和血管生成相关因子表达的影响

背景 已有研究证明骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植可重建损伤的角膜上皮并促进角膜上皮的修复,但BMSCs的作用机制尚不明确. 目的 探讨BMSCs移植在大鼠角膜化学伤后抗炎和抗新生血管形成的作用.方法 从2只成年清洁级SD大鼠双侧股骨及胫骨提取骨髓并进行BMSCs培养和传代,第3代细胞种植于羊膜.18只成年清洁级SD大鼠用NaOH滤纸片贴附于角膜中央的方法制作角膜碱烧伤模型,然后按随机数字表法随机分为3组,每组6只眼,均取右眼为模型眼.造模1周后,BMSCs移植组行带有BMSCs的羊膜移植；羊膜移植组行无BMSCs的羊膜移植；模型对照组不进行移植.术后2周裂隙灯显微镜下进行角膜透明度评分并计算角膜新生血管(CNV)面积,ELISA法检测各组大鼠角膜中白细胞介素2(IL-2)、IL-10、干扰素γ(IFN-γ)和转化生长因子B(TGF-β)的含量,荧光实时定量PCR法检测各组角膜中基质金属蛋白酶2(MMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) mRNA的表达.结果 传代细胞CD90及CD29表达阳性率分别为99.78％及99.79％,CD34、CD45及CD11b的表达率分别为7.90％、1.16％和1.28％,符合间充质干细胞的特征,种植于羊膜后生长状态良好.角膜碱烧伤后1周,各组大鼠角膜水肿混浊评分和CNV面积的差异均无统计学意义(F=0.021,P=0.979；F=0.076,P=0.927).移植术后2周,羊膜移植组和BMSCs移植组大鼠角膜混浊水肿评分均明显低于模型对照组(P=0.011、0.001),CNV面积均小于模型对照组(P=0.005、0.000).与羊膜移植组比较,BMSCs移植组CNV面积较小(P=0.001).角膜中Thl细胞分泌的IL-2和IFN-γ在BMSCs移植组明显下降,与模型对照组及羊膜移植组比较差异均有统计学意义(P=0.000、0.002、0.003、0.045),而Th2细胞分泌的IL-10和TGF-β明显高于模型对照组和羊膜移植组(P=0.000、0.000、0.000、0.021).3个组间VEGF在角膜中的表达差异无统计学意义( F=4.880,P=0.056).BMSCs移植组大鼠角膜中MMP-2及bFGF的表达均明显低于模型对照组及羊膜移植组(P＜0.01).结论 BMSCs移植可调节大鼠角膜碱烧伤后炎性相关因子和新生血管相关因子的分泌,从而减轻角膜炎症反应,抑制CNV的形成.