NADPH氧化酶在rd小鼠遗传性视网膜变性中的活化表达

背景研究表明,小胶质细胞中烟酰胺二磷酸腺苷（NADPH）氧化酶的活化在中枢神经系统神经元损伤及神经变性疾病中发挥重要作用。已有研究证实NADPH氧化酶在rd小鼠视锥细胞退行性改变中的作用,但关于其在rd小鼠视网膜变性早期视杆细胞病变过程中的作用研究较少。目的研究NADPH氧化酶在rd小鼠感光细胞凋亡过程中的活化表达,探讨其在遗传性视网膜变性中的致病作用。方法取出生后8、10、12、14、16、18d的rd小鼠各18只,过量麻醉法处死后提取视网膜总RNA和总蛋白,并制备视网膜切片,分别用实时荧光定量PCR及Western blot法测定在rd小鼠感光细胞凋亡过程中视网膜中NADPH氧化酶亚单位gp91phox mRNA及蛋白的定量表达变化;采用免疫组织化学及gp91phox和CD11b免疫荧光双染法确定gp91phox在不同鼠龄rd小鼠视网膜中的表达及定位,并与其近交系C57BL／6N小鼠进行比较。结果实时荧光定量PCR研究证实,C57BL／6N小鼠视网膜中未见gp91phox mRNA的表达,而生后8d的rd小鼠视网膜中即有少量gp91phox mRNA的表达,随着鼠龄的增加,gp91phox mRNA表达量（gp91phox mRNA／β-actin）逐渐增加,生后14d达到高峰。不同鼠龄rd小鼠视网膜中gp91phox mRNA表达量差异有统计学意义（F=17．81,P=0．00）;生后10、12、14、16、18d的Td小鼠视网膜中gp91phox mRNA表达量均明显高于出生后8d小鼠,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,以出生后14d表达量最高,为1．136±0．370。随着小鼠鼠龄的增加,视网膜中gp91phox蛋白表达量（A值）与其基因表达变化趋势一致,不同鼠龄及C57BL／6N对照小鼠间视网膜中gp91phox蛋白表达的差异有统计学意义（F=354．00,P〈0．01）,不同鼠龄rd小鼠出生后视网膜中gp91phox蛋白表达量均明显高于C57BL／6N对照小鼠,差异均有统计学意义（均P〈0．05）。免疫组织化学法检测表明,rd小鼠出生后10d视网膜内层gp91phox阳性细胞开始增多,出生后14d达到高峰,外核层也可见到gp91phox阳性细胞。免疫荧光双染结果显示,gp91phox与小胶质细胞标志物CD11b共表达,呈现橙色荧光。结论NADPH氧化酶在rd小鼠视网膜中的表达随着鼠龄的增长而增多,其表达与小胶质细胞活化及感光细胞的凋亡相平行,提示NADPH氧化酶可能在小胶质细胞活化导致的感光细胞凋亡中发挥致病作用。     

小胶质细胞活化与rd小鼠遗传性视网膜变性

目的研究小胶质细胞活化与rd小鼠遗传性视网膜变性的关系。方法对出生后8、10、12、14、16及18d的rd小鼠及对照小鼠视网膜进行感光细胞凋亡TUNEL法检测及形态计量学分析。CD11b免疫组织化学染色标记视网膜小胶质细胞。结果rd小鼠出生后10d视网膜感光细胞层开始出现TUNEL染色阳性细胞,第16d达到高峰。视网膜小胶质细胞在rd小鼠出生后10d开始活化,第14d达到高峰。小胶质细胞向感光细胞层的迁移与感光细胞凋亡之间存在紧密的时间和空间关系。结论rd小鼠视网膜变性以感光细胞凋亡为主。小胶质细胞活化可能在视网膜变性过程中发挥重要作用。     

β趋化因子受体CCR1在遗传性视网膜变性小鼠视网膜中的表达

目的探讨B趋化因子主要的受体之一β趋化因子受体1（CCR1）在视网膜变性模型小鼠（rd小鼠）的视网膜变性过程中的表达及其在感光细胞凋亡中的病理作用。设计实验研究。研究对象出生后8、10、12、14、16及18天的rd小鼠各10只（共60只）及同龄C57BL／6N对照小鼠各10只（共60只）。方法小鼠断颈处死,取双眼眼球制作冰冻切片或分离新鲜视网膜组织。逆转录多聚酶链反应（RT．PCR）测定各鼠龄rd小鼠及对照鼠视网膜CCR1mRNA的表达水平。免疫组织化学法观察CCR1蛋白在各鼠龄rd小鼠视网膜的定位表达。CCR1在感光细胞及凋亡细胞中的表达由免疫荧光双标法确定。主要指标视网膜CCR1mRNA及蛋白的表达、CCR1的细胞定位及与凋亡细胞的关系。结果CCR1mRNA在对照组及各鼠龄rd小鼠视网膜中均有表达,但在出生后12、14天rd小鼠视网膜中表达明显升高（光密度值分别为0．986±0．17和1．152＋0．22,P=0．010和0．008）。CCR1阳性染色细胞开始出现于出生后8天的rd视网膜外核层,并于12及14天达到高峰。对照组视网膜外核层无CCRl阳性染色。CCR1与视紫红质、CD11b或TUNEL染色免疫荧光双标结果显示,CCR1表达于感光细胞而非小胶质细胞中,部分CCR1表达于凋亡的感光细胞中。结论在rd小鼠视网膜中CCR1表达于感光细胞并随其变性程度加重表达升高。CCR1的活化可能在rd小鼠感光细胞凋亡中发挥作用。     

小胶质细胞在人原发性视网膜色素变性中的活化

目的 观察小胶质细胞在原发性视网膜色素变性(RP)患者中的活化表现.方法制备22个原发性RP患者及18个正常人眼的石蜡切片.抗体HLA-DR,CD45及CD68对视网膜小胶质细胞进行免疫标记. 结果 RP患者赤道部视网膜内层出现大量肥大的活化小胶质细胞,部分向变性的感光细胞层浸润.黄斑区小胶质细胞主要以三种形式存在:在视网膜内层明显活化并向感光细胞层浸润;在视网膜内层活化但很少向外核层浸润;视网膜全层未见小胶质细胞活化.视神经及视网膜前膜均见小胶质细胞活化.结论小胶质细胞的活化是RP的一种独特的炎性反应方式,在感光细胞变性中发挥一定作用.     

NOX2基因缺陷对rd1小鼠感光细胞凋亡的保护作用

目的 观察NADPH氧化酶2(NOX2)基因缺陷对遗传性视网膜变性小鼠1(rd1)感光细胞的保护作用。设计 实验研究。研究对象 出生后14天的NOX2基因缺陷rd1小鼠(实验组)6只及同龄NOX2基因缺陷的C57BL/6N小鼠(对照组1)、无NOX2基因缺陷的rd1小鼠(对照组2)、C57BL/6N野生正常小鼠(对照组3)各6只(共24只)。方法 对照组1与对照组2小鼠多次交配获得实验组小鼠并进行基因型鉴定。取该实验鼠及对照组小鼠眼球,对视网膜进行HE染色并测量视网膜外核层厚度,TUNEL染色并计算凋亡细胞占外核层细胞总数百分比、免疫荧光法CD1 1b抗体标记小胶质细胞并检测NOX2主要亚单位gp91^pbox蛋白的表达。主要指标 视网膜外核层厚度,感光凋亡细胞百分比,gp91^pbox蛋白的表达量,小胶质细胞活化情况。结果 与同龄对照组2相比,实验组小鼠视网膜内外核层排列整齐,其外核层厚度(36.18±2.59)μm明显大于对照组2小鼠(21.45±1.33)μm(t=8.77,P=0.001)。实验组小鼠视网膜凋亡细胞主要出现于外核层,但数量...     

米诺环素对视网膜色素变性小鼠光感受器细胞的保护作用

目的 观察米诺环素对视网膜色素变性（RP）的rd小鼠［C3H/HeN (Pde6brd-/rd-)］RP过程的影响。方法 40只新生rd小鼠随机分为10组，5组为实验组，5组为对照组，每组4只小鼠。实验组，出生后每日腹腔注射米诺环素22.5 mg/kg；对照组，出生后每日腹腔注射生理盐水10 ml/kg。在出生后1、7、14、21、28 d各处死一组实验组和对照组小鼠，取眼球做组织学观察并行凋亡细胞检测，并对两组视网膜光感受器细胞数、外核层厚度以及凋亡细胞数目进行统计分析。结果 （1）rd小鼠出生后7 d光感受器细胞开始凋亡，14 d达高峰，28 d光感受器细胞完全消失；（2）出生后7 d实验组光感受器细胞数目和外核层厚度与对照组比较差异无统计学意义；（3）出生后14、21 d实验组光感受器细胞数目和外核层厚度多于对照组相应时间点，差异有统计学意义（14 d：t=-3.03、P=0.016，t=-4.469，P=0.004；21d: t=-8.782、P＜0.001，t=-3.497、P=0.004）；（4）出生后7、14 d实验组外核层凋亡细胞数目少于对照组相应时间点，差异有统计学意义（t=-3.497、P=0.004，t=-8.782、P＜0.0001）。结论 米诺环素在rd小鼠RP早期可以延缓光感受器细胞丢失，但不能完全阻止RP的发生。     

玻璃体腔注射VAS2870对小鼠氧诱导视网膜病变的保护作用

目的：观察玻璃体腔注射VAS2870对C57小鼠氧诱导视网膜病变的影响。方法：将新生C57 BL/6 J小鼠随机分为3组,分别为正常对照组、VAS2870注射 OIR 组和无菌 PBS 缓冲液注射OIR组。将后两组小鼠在出生后第7 d ( P7)至P12置于体积分数为75%±2%的恒定高氧氧箱中以构建OIR模型,在 P12时给予幼鼠双眼玻璃体腔注射 VAS2870(0.5μL),另一组幼鼠双眼注射同等剂量的无菌PBS缓冲液。三组小鼠均在 P17时取右眼行视网膜铺片和Lectin染色,观察视网膜中央无血管区及病理性新生血管的情况;取右眼行视网膜组织定量检测 ROS/RNS 含量;取左眼应用RT-PCR检测Nox4 mRNA含量,并应用Western-blot测定视网膜组织中VEGF的表达。结果：VAS2870注射OIR组小鼠视网膜中央无血管区面积较无菌PBS缓冲液注射OIR组明显减少( P<0.05),病理性新生血管数目明显减少( P<0.05);VAS2870注射OIR组小鼠视网膜组织Nox4 mRNA的表达量明显低于无菌PBS缓冲液注射组;VAS2870注射OIR组小鼠视网膜组织ROS含量较无菌PBS缓冲液注射组明显降低( P<0.05);VAS2870注射OIR组小鼠视网膜组织VEGF的表达明显低于无菌PBS缓冲液注射组( P<0.05)。结论：在小鼠OIR模型中, VAS2870可抑制Nox4 mRNA的表达,减少ROS/RNS,下调VEGF的生成,在视网膜病变进程中具有保护作用。     

低浓度氯喹保护成年小鼠视网膜神经节细胞抵抗N-甲基-D-天冬氨酸的兴奋性毒性作用

目的:观察不同浓度氯喹对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)损伤模型小鼠RGC的保护作用及可能调控机制。方法:健康雄性C57/BL6小鼠54只,随机分为氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组,每组均为18只。氯喹低浓度组、氯喹高浓度组小鼠分别按体重10、100 mg/kg剂量腹腔注射氯喹;PBS组小鼠腹腔注射等体积PBS。腹腔注射1次/d,连续2d后,氯喹低浓度组、氯喹高浓度组小鼠左眼玻璃体腔注射5 nmol/L NMDA,对侧眼注射等体积PBS。建模后7d,视网膜铺片RGC染色,计数RGC存活数目;建模后9、10d,分别行视动反应和ERG检查;建模后11 d,行视网膜免疫荧光染色检测各组小鼠视网膜胶质纤维酸性蛋白(GFAP)荧光表达和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组小鼠视网膜GFAP、TNF-α、IL-6 mRNA表达。各组间RGC密度、视敏度、光负性反应(PhNR)波振幅比较采用单因素方差分析。结果:建模后7d,与PBS对照组小鼠RGC密度比较,氯喹低浓度组显著升高,差异有统计学意义(F=54.41,P<0.01);氯喹高浓度组降低,但差异无统计学意义(F=1.18,P>0.05)。氯喹低浓度组小鼠视敏度、PhNR波振幅均高于PBS对照组,差异有统计学意义(F=9.10、17.60,P<0.05、<0.01)。氯喹低浓度组小鼠视网膜GFAP绿色荧光表达明显少于PBS对照组、氯喹高浓度组,差异有统计学意义(F=23.66,P<0.05)。低浓度氯喹组小鼠视网膜GFAP(F=110.20)、IL-6(F=167.60)、TNF-α(F=17.78)mRNA表达较高浓度氯喹组、PBS对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.010、<0.001、<0.010)。结论:低浓度氯喹对NMDA损伤所致RGC丢失有保护作用,其作用机制可能与抑制胶质细胞活化与炎症反应有关;高浓度氯喹会加重RGC凋亡。     

TLR-4/MyD88通路激活和小胶质细胞极化在氧化低密度脂蛋白导致的小鼠视网膜损伤中的作用

目的 探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)导致的视网膜损伤是否与Toll样受体-4(TLR-4)/MyD88通路激活和活化小胶质细胞使其极化为M1表型相关。方法 雄性C57BL/6小鼠分为两组,实验组小鼠视网膜下注射1μL ox-LDL,对照组小鼠注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS);2周后,采用免疫荧光染色检测视网膜小胶质细胞的离子钙结合适配器分子1(Iba-1)、iNOS的表达,TUNEL染色检测光感受器细胞凋亡,OCT检测视网膜外核层(ONL)和内核层(INL)厚度,ERG检测视网膜功能,qPCR检测视网膜Iba-1、TLR-4和MyD88的mRNA和蛋白表达。体外实验使用ARPE-19细胞,ox-LDL组细胞用100 mg·L^-1 ox-LDL处理24 h, PBS组细胞使用等体积的PBS处理24 h; TUNEL染色检测细胞凋亡,Western blot和qPCR检测细胞TLR-4和MyD88的mRNA和蛋白表达。结果 qPCR和Western blot检测结果均显示,与对照组相比,实验组小鼠视网膜中TLR-4、MyD88、Iba-1的mRNA和蛋白表达水...     

快速退变性视网膜组织内CD45分子的动态表达特点

目的探讨不同时期正常和变性视网膜内CD45动态表达特点。方法分别取生后（postnatal，PN）0、1、2、3、4周龄C57BL／6和rd小鼠各8只，处死后，立即摘出眼球，制备冰冻切片，进行免疫荧光染色，荧光显微镜观察摄片，图像分析软件进行半定量分析。结果C57BL／6小鼠PN旬周龄时视网膜下腔（subretinal space，SRS）内CIM5不表达，以后逐渐增加，PN-3、4周龄时趋于稳定；rd小鼠SRS内CD45表达强度从PN-O周龄开始增加，PN-2周龄达到高峰，以后开始减少，PN-4周龄不表达；rd小鼠PN-2周龄时SRS内CD45表达强度高于正常组，PN-3、4周龄低于正常组。C57BL／6小鼠PN-0周龄时内丛状层（inner plexiform layer，IPL）内CD45表达强度开始减少至PN-1周龄，PN-3周龄表达强度开始增高至PN-4周龄；rd小鼠PN-1周龄时IPL内CD45表达强度开始增加直至PN-4周龄；各周龄彪小鼠IPL内CD45表达强度均低于正常组。结论正常小鼠视网膜CD45的表达与发育过程有关。视网膜变性不同时期，小胶质细胞等抗原呈递细胞活化，从内层视网膜移行到SRS。     

氢离子对视网膜氧化应激损伤的保护作用机制研究

目的　探讨氢离子对氧化应激诱导的视网膜损伤的保护机制。方法　C57BL/6J 雄性小鼠30只,随机分为对照组、模型组和治疗组,其中治疗组给予氢离子水灌胃7 d、模型组给予蒸馏水灌胃7 d后均建立视网膜损伤动物模型,对照组仅用蒸馏水灌胃,之后按前述方法分别持续灌胃5 d后处死,HE染色观察视网膜形态;二氢乙啶染色观察视网膜中活性氧的含量;剥离视网膜,Western blot检测氧化应激标志性蛋白ogg1、Sirt3及衰老相关蛋白P53、P21和P16的表达。结果　视网膜HE染色结果显示,治疗组视网膜黑色玻璃膜疣沉积与模型组相比少且小;治疗组中氧化应激标志性蛋白ogg1相对表达量（0.63±0.04）明显低于模型组（0.96±0.02）,差异具有统计学意义（P＜0.05）,与对照组（0.42±0.05）相比差异无统计学意义（P>0.05）。二氢乙啶染色结果表明,治疗组的视网膜的活性氧含量较模型组低;治疗组中Sirt3蛋白相对表达量（1.02±0.05）较模型组（0.55±0.04）显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;治疗组中衰老相关蛋白P53、P21、P16的相对表达量（0.53±0.05、0.40±0.01、0.71±0.01）较模型组（1.06±0.04、0.70±0.03、1.29±0.05）均显著降低,差异均具有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　氢离子通过减少Sirt3表达的下调和抑制衰老对氧化应激诱导的视网膜损伤起保护作用。     

Retardation of photoreceptor degeneration in the detached retina of rd1 mouse

PURPOSE: To study the neuroprotective effect of experimental retinal detachment (RD) on photoreceptor degeneration in rd1 mice. METHODS: RD was produced in the eyes of rd1 mice at postnatal day (P) 9. These eyes were collected and compared to controls without RD. The effects of RD on retinal degeneration were evaluated by histochemical staining of nuclei in the outer nuclear layer (ONL), rod and cone photoreceptors, and retinal vessels at P30 in retinal sections and flatmounts. Apoptotic photoreceptors were detected by TdT-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) at P15. Mice with or without RD were also reared in darkness and evaluated immunohistochemically at P30. RESULTS: The numbers of rhodopsin-positive (rod), peanut agglutinin-positive (cone), and diamino-2-phenyl-indol-stained (rod-plus-cone) cells in the ONL were increased by 2.0-fold, 1.3-fold, and 1.2-fold, respectively, in the rd1 eyes with RD compared to those without RD at P30. In the detached retina, the cone photoreceptor inner/outer segment structures and the deep retinal vessels surrounding the inner nuclear layer and the ONL, but not the ganglion cell layer, were preserved. At P15, TUNEL-positive cell numbers in the ONL were significantly reduced in the eyes with RD. Light exposure had no effect on photoreceptor degeneration in the eyes with or without RD. CONCLUSIONS: RD mediates the preservation of cone and rod photoreceptors in the ONL and surrounding vascular structures by reducing the rate of apoptosis of photoreceptors in rd1 mice. Light deprivation does not appear to be one of the mechanisms of photoreceptor protection in the detached retinas in these mice.     

rd11小鼠视锥细胞变性过程中视蛋白的变化特点

背景视网膜变性11（rd11）小鼠是近年来新发现的一种自发突变的视网膜变性小鼠。研究证实,rd11小鼠出生后随着鼠龄的增长出现快速的光感受器变性,且视杆细胞变性早于视锥细胞变性,但对于视网膜不同区域视锥细胞变性的特点还不十分清楚。目的应用视网膜铺片免疫荧光染色技术观察不同鼠龄rd11小鼠M-视蛋白和S-视蛋白在视网膜的表达分布及变化特点,为相关疾病的基因治疗研究提供实验依据。方法取出生后14、28、42d的rd11小鼠各5只,制备视网膜铺片,采用免疫荧光组织化学法分别标记小鼠视网膜后极部颞上、颞下、鼻上和鼻下象限M-视蛋白和S-视蛋白的表达,观察随rd11小鼠鼠龄的变化视网膜各区域M-视蛋白和S-视蛋白的荧光形态和密度,并与相应鼠龄的C57BL／6J小鼠进行比较。结果出生14d的rd11小鼠视网膜M-视蛋白和S-视蛋白的红色荧光形态和密度与C57BL／6J小鼠接近,但出生28d的rd11小鼠视网膜后极部颞上、颞下、鼻上、鼻下4个区域M-视蛋白和S-视蛋白表达密度均明显降低,荧光形态由纺锤形逐渐变为点状,出生42d的rd11小鼠视网膜部分区域M-视蛋白和S-视蛋白表达消失。出生28d的rd11小鼠视网膜后极部颞上、颞下、鼻上、鼻下区域M-视蛋白的表达密度分别为（414±32）、（300±8）、（324±22）和（250±20）个／0．037mm^2,明显低于同龄C57BL／6J小鼠的（484±21）、（442±19）、（459±34）和（436±12）个／0．037mm^2,差异均有统计学意义（t=4．114、15．225、7．505、17．990,均P〈0．05）;上述4个区域S-视蛋白的表达密度下降更明显,分别为（8±4）、（175±16）、（74±13）、（315±20）个／0．037mm^2,明显低于C57BL／6J小鼠的（73±16）、（436±30）、（393±30）和（480±19）个／0．037mm^2,差异均有统计学意义（t=8．555、17．076、21．637、13．498,均P〈0．05）。结论rd11小鼠视锥细胞中的M-视蛋白和S-视蛋白均随着鼠龄的增长而急剧减少,以S-视蛋白更为明显。随着鼠龄的增长,rd11小鼠M-视蛋白变性从视神经周围区向鼻下方,再向颞上方逐渐进展,而S-视蛋白变性由颞上方向鼻下方逐渐进展。     

Delay of photoreceptor cell degeneration in rd mice by systemically administered phenyl-N-tert-butylnitrone

PURPOSE: To study the effect of systemic administration of phenyl-N-tert-butylnitrone (PBN) on the degeneration of photoreceptor cells in rd mice. METHODS: PBN was injected intraperitoneally into FVB/rd mice on postnatal days (P) 5 to 14 (group A), and P10 to 18 (group B). At days P14, 16, 18, 20 and 27, morphological changes and apoptosis were analyzed by staining with hematoxylin and eosin or DAPI. The effect of PBN on apoptosis was analyzed in retinal pigment epithelial (RPE) cells by the measurement of caspase-3 activity. RESULTS: In control and group B mice, the outer nuclear layer (ONL) of the retina was composed of 8-10 rows at P12, and rapidly decreased to one row at P18. In group A mice, the ONL was preserved with 5-7 rows at P18, and decreased to one row at P22. PBN inhibited caspase-3 activity in cultured RPE cells. CONCLUSIONS: PBN delayed, but did not block, the degeneration of photoreceptor cells in rd mice. PBN may exert its inhibitory effect during the early phase of photoreceptor cell degeneration.     

枸杞子提取物对光诱导视网膜损伤的保护作用

目的探索枸杞子提取物对人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞及C57BL/6J小鼠视网膜光诱导损伤的保护作用。方法 ARPE-19细胞分为正常细胞对照组,光诱导细胞损伤组,细胞低、中、高剂量组(0.1 g·L^-1、0.5 g·L^-1、1.0 g·L^-1枸杞子提取物+光诱导细胞损伤),测定各组细胞活力以及细胞内活性氧(ROS)含量的变化。40只C57BL/6J小鼠随机分为正常动物对照组,光诱导动物损伤组,动物低、中、高剂量组(280 mg·kg^-1、370 mg·kg^-1、460 mg·kg^-1枸杞子提取物+光诱导动物损伤组),每组8只。各剂量枸杞子提取物干预组小鼠在6周龄开始给予枸杞子提取物灌胃,8周后再给予10 000 lux光照射24 h;光照结束后ERG评估各组小鼠视网膜功能,OCT检测视网膜外核层(ONL)厚度,FFA检测视网膜血管渗漏情况,HE染色后对视网膜ONL细胞进行计数,同时检测血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽...