宫颈癌单克隆抗体-葡聚糖-氨甲喋呤偶合物的制备及其体外抗肿瘤作用

以葡聚糖(Dex)氧化产物多醛基葡聚糖作为中间载体,将氨甲喋呤(MTX)共价偶联于抗小鼠宫颈癌单克隆抗体AU_(14-1)(IgG)上,制得AU_(14-1)-Dex-MTX偶合物;其中IgG与MTX摩尔比为1:20。间接膜免疫荧光试验表明,偶合物中AU_(14-1)对靶肿瘤U_(14)细胞的特异结合活性在3.75×10~(-8)M水平,与未偶合的AU_(14-1),相似。体外抗肿瘤实验表明,偶合物不仅获得了由单克隆抗体导向的选择性药物抗肿瘤作用,且对HeLa细咆的生长抑制作用强于U_(14)细胞,进一步证明了“进化抗原”理论。本研究提示AU_(14-1)-Dex-MTX偶合物具有临床应用的潜在性。     

宫颈癌单克隆抗体-葡聚糖-氨甲喋呤偶合物的制备及其体外抗肿瘤作用

以葡聚糖(Dex)氧化产物多醛基葡聚糖作为中间载体,将氯甲喋呤(MTX)共价偶联于抗小鼠宫颈癌单克隆抗体AU_(14-1)(IgG)上,制得AU_(14-1)-Dex-MTX偶合物;其中IgG与MTX摩尔比为1:63。间接膜     

胃癌单克隆抗体-羟基喜树碱免疫偶合物的制备及其细胞毒特征

采用共价交联法将胃癌单克隆抗体RSF_9与羟基喜树碱进行交联,交联物中每分子抗体可引入13±4.2分子的药物,而抗体活性保持85％以上。体外细胞毒试验显示交联物RSF_9-HCPT对胃癌细胞的杀伤是游离药物的4.7倍,而对非靶细胞的杀伤只有游离药物的1/11,表明交联物对胃癌靶细胞具较强的选择性杀伤作用。     

抗SARS冠状病毒单克隆抗体的制备及其体外中和活性鉴定

2002年11月在我国广东省的南部出现了严重急性呼吸综合征(severacuterespiratorysyndrome,SARS)病例,并迅速传播到其他地方。在世界卫生组织(WHO)的统一组织和协调下,通过各国科学家的共同努力,在较短的时间内完成了确定其病原体和控制流行的工作,但许多问题仍有待回答,此次疫情的病原体来自何处,会不会再次暴发流行仍不能确定。本研究的目的是获得该病毒的单克隆抗体,为SARS的早期诊断治疗和病原追踪提供技术支持。1材料和方法1.1病毒株SARS CoV P11病毒株是从确诊SARS患者咽拭子中分离所得[1]。将其感染VeroE6细胞,待80%以上细…     

分泌抗急性非淋巴细胞白血病M_2型单克隆抗体细胞株的建立及其特异性

应用细胞杂交瘤技术建立了分泌抗急性非淋巴细胞白血病M_2型单克隆抗体1D_1、1C_2和1D_6细胞株,连续传代11个月,稳定地分泌单克隆抗体。用间接免疫荧光方法检测,这三株细胞分泌的单克隆抗体与急性非淋巴细胞白血病M_2型病人的白血病细胞呈阳性反应;与急性非淋巴细胞白血病M_1、M_3、M_4、M_5型病人白血病细胞呈阴性反应;与慢性粒细胞白血病、慢粒急变,急性淋巴细胞白血病病人白血病细胞呈阴性反应;与正常人白细胞也呈阴性反应,说明建立的细胞株分泌的单克隆抗体具有型的特异性。     

分泌抗急性非淋巴细胞白血病M_2型单克隆抗体细胞系的建立及其特异性

应用细胞杂交瘤技术建立了3株分泌抗急性非淋巴细胞白血病(急非淋)M_2型单克隆 抗体McAb 1D1,1C_2和1D_6细胞系,连续传代11个月稳定地分泌单克隆抗体。3株均分泌IgG_1抗体。用间接免疫荧光的方法检测,3株分泌的McAb与急非淋M_2型病人白血病细胞呈阳性反应;与急非淋M_1、M_3、M_4、M_5型病人白血病细胞呈阴性反应;与慢性粒细胞白血病慢粒急变、急性淋巴细胞白血病及正常人白细胞呈阴性,McAb具有较好的特异性。     

高三尖杉酯碱对HL60细胞凋亡的影响及机制的研究

目的:研究高三尖杉酯碱对HL60细胞凋亡的影响及其机制。方法:运用高三尖杉酯碱作用HL60细胞后撤药实验筛选其诱导HL60细胞凋亡启动时相,流式细胞和免疫组化技术检测高三尖杉酯碱诱导HL60细胞凋亡启动时相凋亡信号分子Bcl-2、Bax、Fas/FasL、caspase-3、ERK2和p38的表达状况。结果:在高三尖杉酯碱诱导HL60细胞凋亡启动时相,Bcl-2表达降低,Bax表达增高,Bcl-2/Bax比值降低,ERK2表达减低,p38表达增加,caspase-3表达增加,Fas/FasL分子的表达无显著变化。结论:Bcl-2、Bax、MAPK途径和caspase-3参与高三尖杉酯碱启动HL60细胞凋亡的信号转导。     

高三尖杉酯碱联合IFNα-2b可促进白血病源性树突状细胞成熟

目的： 研究高三尖杉酯碱（HHT）、干扰素α-2b（IFNα-2b）和两者联合（HHT+IFNα-2b）对白血病源性树突状细胞（DCs）的促成熟作用。方法: 在白血病多药耐药细胞K562/A02中加入细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4,7 d后Wright-Gimsa染色观察细胞形态的变化,流式细胞术检测细胞免疫表型的变化,同种混合淋巴细胞反应、CTL杀伤效应、细胞因子IL-12的分泌来评价此白血病源性DC的成熟程度,然后在上述白血病源性DC中分别加入HHT、IFNα-2b和HHT+ IFNα-2b,3 d后以上述同样方法检测它们对此白血病源性DC的促成熟作用。结果: K562/A02细胞在rhGM-CSF和rhIL-4作用7 d后,CD83、HLA-DR和CD86分子的表达分别为（65.50±8.40）％、（32.00±4.32）％和（18.65±3.20）％,经HHT作用后这3种分子的表达升高到（85.36±8.42）％、（39.58±7.68）％和（35.53±4.35）％;经IFNα-2b作用后升高到（87.15±7.59）％、（40.53±6.30）％和（38.45±6.42）％;经HHT+ IFNα-2b联合作用后升高到（94.38±6.59）％、（52.75±8.51）％和（42.98±9.87）％,与作用前相比差异均显著。经HHT、IFNα-2b和HHT+ IFNα-2b作用后具有典型DC形态的细胞增多。经HHT和 IFNα-2b作用的DC均可刺激T细胞产生较强的增殖效应,诱导产生的CTL对靶细胞K562/A02的杀伤率明显增强且当效靶比为20∶1时杀伤效率最强,IL-12分泌明显增高。结论: HHT和IFNα-2b对白血病源性DC有促成熟作用,且两者联用时作用最强。     

TREM2单克隆抗体的制备及应用检测

目的：制备TREM2特异性单克隆抗体并对其特异性、亲和力及在免疫学检测中的应用进行鉴定,为TREM2的抗体药物研发奠定基础。方法：表达并纯化TREM2胞外段GST融合蛋白,用其作为抗原免疫小鼠,筛选抗血清效价较高的小鼠,经过细胞融合和单克隆筛选,制备TREM2的特异性单克隆抗体。对获得的单克隆抗体的特异性、亲和力及其在免疫学实验中的应用进行检测。结果：获得了29株TREM2单克隆抗体,其中的24株可与TREM2特异性结合;29株单抗与TREM2结合的EC50均在nmol以上;它们可分别在Western blot、免疫沉淀、流式细胞术和免疫荧光中用于对TREM2的特异检测。结论：成功制备并获得了亲和力高、特异性好的抗TREM2单克隆抗体,为TREM2靶点的成药性抗体开发奠定了基础。     

副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及其活性分析

目的 制备副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体(mAb)并建立双抗夹心ELISA.方法 采用差速离心法提取副溶血性弧菌ATCC 17802菌株的鞭毛蛋白,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠,抗血清效价达到1∶32 000时,取脾细胞与生长良好的对数期Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合.多次克隆化培养后获得杂交瘤细胞株并制备腹水,纯化后得到抗体.结果 获得6株持续、稳定分泌抗副溶血性弧菌鞭毛蛋白mAb的杂交瘤细胞株,命名为VpNo.1～VpNo.6,抗体效价高达1∶2×106.对抗体进行了Ig类和亚类检测以及Western blot法鉴定,其Ig亚类依次为IgGl、IgG1、IgM、IgG1、IgG2a和IgM.SDS-PAGE结果显示,提取出的鞭毛蛋白相对分子质量(Mr)为42 000并且纯度较高.采用VpNo.6抗体建立了副溶血性弧菌双抗夹心ELISA,该方法的检测灵敏度达到103 CFU/mL菌液,通过采用134株副溶血性弧菌和74株非副溶血性弧菌进行特异性实验,结果表明134株副溶血性弧菌呈阳性反应,74株非副溶血性弧菌呈阴性反应,VpNo.6抗体具有非常好的特异性.在基质添加试验中,最低检出限为21CFU/g样品.结论 成功制备了副溶血性弧菌鞭毛蛋白mAb,并将其应用于双抗夹心ELISA,该方法的检测灵敏度达到1×103 CFU/mL菌液,与所测试的非副溶血性弧菌没有交叉反应.     

大鼠抗小鼠重组Foxc2单克隆抗体的制备与检测应用

目的：为了研究叉头框c2(Foxc2)在骨骼和主动脉发育上的作用。方法：利用基因重组融合蛋白制作大鼠抗小鼠Foxc2单克隆抗体(抗-Foxc2 mAb)，并利用蛋白质印迹和免疫荧光分析了Foxc2蛋白在小鼠肌胚细胞C2C12的表达和在小鼠胚胎的表达部位。结果：用小鼠GST-Foxc2融合蛋白免疫大鼠制得的抗-Foxc2 mAb效价为1：5000，并特异地与转染了CX-Foxc2质粒的小鼠L细胞和人膀胱癌HTB9细胞产生的Foxc2蛋白结合。在骨成形蛋白-2(BMP-2)的诱导下，Foxc2蛋白在C2C12细胞中显著地增加，用反义Foxc2序列转染C2C12细胞可以明显地抑制Foxc2蛋白在这个细胞系中的表达。Foxc2蛋白表达主要定位于11．5-dpc小鼠胚胎的生骨节和主动脉周围的间充质组织。结论：应用大鼠抗小鼠基因重组Foxc2单克隆抗体研究Foxc2的作用，结果表明Foxc2蛋白在BMP-2的诱导下，在调节C2C12细胞向成骨细胞分化以及在胚胎中轴骨骼和心血管的形成过程中起重要作用。     

抗乳腺癌单克隆抗体MG_2的制备及其鉴定

用人乳腺癌组织及腋窝淋巴结转移癌单细胞悬液对BALB/c小鼠进行初次免疫,3周后改用人乳腺癌组织提取的抗原再次免疫。末次免疫后3d取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP 2/0进行融合,,经筛选及克隆化培养,建立了1株分泌抗人乳腺癌单克隆抗体MG_2。免疫组化染色表明MG_2与乳腺癌产生强阳性反应,而乳腺纤维腺瘤、良性增生及非乳腺来源肿瘤以及正常组织则为阴性或弱阳性着染。初步证明单抗MG_2对乳腺癌具有一定的特异性与敏感性,因而可为乳腺癌的放免显像及免疫导向治疗提供一个新的较理想的载体。     

高三尖杉酯碱通过上调casp3和casp8表达发挥对骨肉瘤细胞系的抑制作用

目的 探讨高三尖杉酯碱（HHT）对骨肉瘤细胞的杀伤作用,并探讨其可能的作用靶点和机制。方法 使用不同浓度的高三尖杉酯碱处理骨肉瘤细胞系（143b及U2-OS）,通过CCK-8实验检测HHT对骨肉瘤细胞的杀伤作用,集落形成实验检测骨肉瘤细胞的克隆能力,划痕实验检测骨肉瘤细胞的迁移能力,Transwell实验检测骨肉瘤细胞的侵袭能力,流式细胞学技术检测骨肉瘤细胞的凋亡率。并通过荧光定量PCR（qPCR）实验检测经过HHT处理后骨肉瘤细胞内基因表达情况的改变,并找出HHT作用于骨肉瘤细胞内可能的靶点和机制。结果 CCK-8实验证实HHT对骨肉瘤细胞143b和U2-OS具有明显的杀伤作用;集落形成实验、划痕实验、Transwell实验分别证实了HHT对骨肉瘤细胞143b和U2-OS的克隆能力、迁移能力、侵袭能力存在显著的抑制作用;流式细胞学技术证实了HHT能提高骨肉瘤细胞143b和U2-OS的凋亡率;RT-qPCR实验表明HHT可以显著上调casp3和casp8的表达,验证了HHT可能是通过调控casp3和casp8进而对骨肉瘤的增殖凋亡、侵袭及转移等发挥作用。结论 casp3和casp8是HHT作用于骨肉瘤细胞的靶点,HHT通过上调casp3和casp8的表达来发挥对骨肉瘤细胞的抑制作用。     

抗CMG2单克隆抗体的制备及其初步应用

目的制备鼠抗人毛细血管形态发生基因2(CMG2)单克隆抗体,并将其初步应用于胃癌组织和细胞系中CMG2表达的检测。方法重组表达CMG2胞外区肽段,免疫Balb/c小鼠,常规制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法筛选目标克隆,制备小鼠腹水并经蛋白A亲和纯化获得相应抗体。间接ELISA法鉴定抗体的亚类类型及亲和力;抗原竞争性抑制实验鉴定抗体的特异性。用候选抗体建立流式细胞术、免疫荧光、免疫印迹及免疫组织化学方法,初步应用于胃癌组织和细胞系中CMG2表达的检测。结果共获得3株针对CMG2胞外区的杂交瘤细胞株,其中以8F3单克隆抗体的亲和力和特异性最好,亚型为Ig G1。8F3单抗能用于胃癌细胞株CMG2表达的流式细胞术和免疫荧光检测以及胃癌组织的免疫组织化学检测。结论成功制备出高效价高特异性的鼠抗人CMG2单克隆抗体,为CMG2的基础和临床应用研究提供了有用工具。     

抑制白血病K562细胞FoxM1表达可增强细胞对高三尖杉酯碱的敏感性

目的:探讨抑制白血病K562细胞叉头框蛋白M1(Fox M1)是否增强细胞对高三尖杉酯碱(HHT)的敏感性。方法:HHT以不同浓度(0、0.015、0.030和0.045μmol/L)和最低起效浓度不同时间(0.015μmol/L,0、24、48和72 h)作用于K562细胞,real-time PCR和Western blot检测Fox M1 mRNA和蛋白表达;以0.015μmol/L HHT作用K562细胞后转染Fox M1 siRNA,观察沉默K562细胞Fox M1后细胞对HHT的敏感性、细胞增殖和凋亡效应以及Fox M1相关靶分子c-Myc和Sp1表达状况。结果:随着HHT浓度增加和时间延长Fox M1表达逐渐降低,说明HHT抑制K562细胞Fox M1表达;HHT处理K562细胞后转染Fox M1 siRNA,细胞生长和克隆形成显著下降,细胞凋亡增加,因此抑制Fox M1可增加K562细胞对HHT的敏感性;Fox M1 siRNA组c-Myc和Sp1表达显著降低,表明Fox M1可正性调控c-Myc和Sp1表达。结论:HHT可以抑制白血病K562细胞Fox M1表达,干扰Fox M1可增强细胞对HHT的敏感性。     

抗IL-2单克隆抗体中和活性及其特异性的分析

利用重组人IL-2(rhIL/2)和天然人IL-2(nhIL-2)介导的IL-2依赖细胞增殖反应,对本室制备的9种抗IL-2单抗的中和活性进行了研究,并用抗原竞争抑制法初步分析了它们的表位特异性。结果表明,在9种单抗中8H7能中和nIL-2活性;9B12既能中和nhIL-2活性也能中和rhIL-2活性,二者的抗原识别位点极相近。     

抗人CTLA-4单克隆抗体的制备及其生物学活性研究

以我室用基因工程表达的人CTLA 4蛋白[1,2 ] 作为免疫原 ,采用细胞融合、ELISA法和免疫印迹等方法制备并筛选到鼠抗人CTLA 4的单克隆抗体 ,并以单向混合淋巴细胞刺激反应 (MLR )测定了抗人CTLA 4抗体对淋巴细胞增殖的影响。结果表明我们得到了 4株单克隆抗体 (1H7、 2G2、 2F11、 3A7) ,它们均可与近似天然构象的人CTLA 4Ig融合蛋白结合 ,又可与大肠杆菌表达出的经复性后的人CTLA 4蛋白结合 ,并且可分别识别人CTLA 4Ig融合蛋白不同抗原决定簇。其中一株(3A7)既和近似天然构象的蛋白结合又可与变性的蛋白结合 ,并具有显著阻断CTLA 4的抑制性免疫信号传递 ,促进同种异体混合淋巴细胞增殖的功能