体外转染KISS-1基因对SW480细胞系侵袭和迁移力的影响

目的 探讨人肿瘤转移抑制基因KiSS-1对人结肠癌SW480细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响.方法 将携有KISS-1基因的重组真核表达质粒pRc/CMV2-KISS-1转化大肠杆菌DH5et并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定,pRc/CMV2-KISS-1体外转染SW480细胞(SW480-FH1T),筛选稳定转染的细...     

克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体

目的探讨构建人骨形成蛋白2(human bone morphgenetic protein 2,hBMP 2)真核表达载体的方法.方法由人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用RT PCR方法扩增获得hBMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM T hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒.分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1( )真核表达载体,将克隆载体中hBMP基因重组到pcDNA3.1( )真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、PCR鉴定及DNA测序.结果人骨肉瘤细胞中经RT-PCR得到1.2kbp的hBMP 2扩增条带,重组质粒pGEM T-hBMP 2经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP 2条带和4.0 kbp的载体片断;pcDNA3.1 hBMP-2质粒经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP-2条带和5.0kbp的载体片断,重组质粒酶谱分析与预期一致;DNA序列分析测序结果校对后经BLAST分析,表明核酸序列与Gene Bank中和hBMP-2的mRNA序列完全吻合.结论通过此方法能成功克隆获得hBMP-2基因,并构建其真核表达载体.     

人巨噬细胞金属弹性蛋白酶基因真核表达载体的构建及其鉴定

目的　构建一个包含人巨噬细胞金属弹性蛋白酶 (HME)基因全部功能区的重组真核表达载体pcDNA3 .1(-) /HME ,为进一步研究人巨噬细胞金属弹性蛋白酶对体内肿瘤血管生成的影响奠定基础。方法　用Trizol试剂法从经体外纯化培养的人巨噬细胞中提取总RNA ,经逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增目的片段 ,PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接 ,并转化入大肠杆菌DH5α扩增以获得重组载体。结果　RT PCR获得预期大小的特异性DNA片段 ,经双酶切鉴定及测序证实已将人巨噬细胞金属弹性蛋白酶基因cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论　成功获得pcDNA3 .1(-) /HME重组真核表达载体。     

从体外培养的外周血单个核细胞克隆人白细胞介素-10 cDNA

目的从体外培养的外周血单个核细胞克隆人白细胞介素(hlL)-10cDNA。方法淋巴细胞分离液自静脉血中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)，含ConA的RPMI1640培养24h，提取总RNA，逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)扩增hIL-10cDNA，克隆入pUCm—T载体，转化感受态细胞DH5α，蓝白筛选，PCR及PvuⅠ、NotⅠ双酶切鉴定，重组DNA测序。结果RT—PCR扩增产物560bp，与预期片段大小一致，随机挑取白色菌落，小量提取的质粒经PCR、限制性内切酶酶切鉴定，目的条带与预期片段的大小均一致，测序结果与Genebank公布的hIL-10cDNA序列完全一致。结论从PBMC中扩增hIL-10cDNA，克隆至pUCm—T载体，方法较为简便，为进一步进行亚克隆及表达研究提供了可靠的前提条件。     

靶向人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建针对人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出对胰腺癌细胞系PANC-1基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法针对SIRT1基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切,PCR,测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测SIRT1 mRNA和蛋白的被抑制情况。结果经测序证实,成功构建SIRT1-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染PANC-1细胞后,SIRT1 mRNA和蛋白水平明显下调;其中以1号重组质粒效应最强。结论成功构建了携带以SIRT1为靶向的shRNA的重组质粒。其对胰腺癌PANC-1细胞SIRT1的表达具有显著抑制效应。该实验为进一步研究SIRT1的功能和肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

骨形态发生蛋白-2基因的克隆及重组真核表达质粒的构建

目的 克隆骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因,并构建重组BMP-2基因真核表达质粒.方法 从兔骨髓细胞中分离提取BMP-2的mRNA,RT-PCR扩增后,克隆入pGEM-T载体,PCR鉴定重组子;酶切下目的 基因BMP-2,再亚克隆入载体pEGFP-C3质粒,酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析.结果 经过RT-PCR扩增得到BMP-2cDNA条带:PCR扩增鉴定得到pGEM-T-BMP-2.酶切鉴定得到亚克隆重组子pEGFP-C3-BMP-2,经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致.结论 成功克隆兔BMP-2基因,构建出重组真核表达载体BMP-2,为进一步采用BMP-2基因治疗关节软骨缺损奠定了实验基础.     

缺氧诱导因子-1α靶向siRNA重组表达载体的构建和鉴定

目的构建缺氧诱导因子-1α靶向siRNA重组表达载体。方法根据GeneBank提供的人缺氧诱导因子-1α的核苷酸序列选择设计4对发夹状结构的核苷酸序列,克隆到质粒PGenesil-1中,转化至DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析。结果经基因测序等证实缺氧诱导因子-1α靶向siR-NA重组表达载体碱基序列与设计完全一致。结论缺氧诱导因子-1α靶向siRNA重组表达载体构建成功,为进一步研究肿瘤生物学行为奠定了实验基础。     

人睾丸前列腺素D合成酶重组表达质粒的构建与鉴定

目的 :构建高效表达人睾丸前列腺素D合成酶 (htL PGDS)的重组表达质粒。　方法 :以经测序证实为人L PGDS的人睾丸L PGDScDNA为模板进行PCR扩增 ,得到编码L PGDS的基因片段 ,用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行酶切后 ,连接到经相同内切酶处理的原核表达载体pGEX 2T中。重组质粒pGEX 2T/htL PGDS被进一步转化感受态大肠杆菌JM10 3 ,转化物接种到含氨苄青霉素的LB平板 ,37℃培养 12～ 16h后 ,挑取氨苄青霉素抗性菌落 ,并接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中 ,37℃、16 0r/min培养 12～ 16h后 ,提取质粒DNA供PCR和双酶切鉴定。　结果 :共筛选出氨苄青霉素抗性菌落 10 9个 ,经PCR和双酶切鉴定出 10个重组质粒pGEX 2T/htL PGDS。结论 :重组表达质粒pGEX 2T/htL PGDS的构建及正确鉴定 ,为以后的重组抗原的表达、纯化及单克隆抗体的制备奠定了基础。     

大鼠肌细胞生成素基因真核表达载体的构建

目的 构建骨骼肌肌细胞生成素(myogenin cDNA)基因真核表达载体，深入探讨在骨骼肌损伤及骨骼肌失神经萎缩的发生、发展过程中的变化规律，以及病理过程。方法 含myogenin cDNA的克隆载体pGEMT—myogenin经限制性内切酶Hind Ⅱ和Xho I双酶切，得到含这两个酶切位点之myogenin cDNA片段，T4连接酶连接到含有这两个酶切位点的真核表达载体pcDNA3，构建出重组真核表达载体pcDNA3—myogenin，经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性。结果 经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实：pcDNA3—myogenin含大小正确的myogenin cDNA片段，DNA测序证实其DNA序列正确。结论 成功地构建了肌细胞生成家基因真核表达载体pcDNA3—myogenin。     

BMP2和TGFβ3双基因真核表达载体的构建

[目的]构建骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体.[方法]从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以pGEMT/BMP2和反转录的cDNA为模板,PCR扩增出BMP2和TGFβ3两个基因全长,将两个基因片段分别定向连入双基因真核表达载体pIRES;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定.[结果]酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确.[结论]成功构建pIRESBMP2/TGFβ3双基因真核表达载体.     

沉默RANK真核表达载体的构建及有效干扰序列的筛选

目的构建沉默小鼠RANK基因的真核表达载体pSuper-shRANK,筛选沉默RANK的最佳干扰序列。方法针对小鼠RANK基因设计并合成3对干扰序列,将其连接到真核表达载体pSuper上,酶切及测序鉴定正确后命名为pSuper-shRANK,后将其用脂质体瞬时转染小鼠骨髓巨噬细胞,用荧光显微镜观察转染情况,用Real-timePCR和Westernblot分析干扰效率。结果酶切分析与测序结果表明重组载体pSuper-shRANK构建成功,脂质体共转染后,Real-timePCR和Western blot分析结果显示shRANK-3干扰效果最好,干扰效率达88.7%,筛选出shRANK-3为最佳干扰序列。结论成功构建了沉默小鼠RANK基因的真核表达载体pSuper-shRANK;筛选出了沉默小鼠RANK的最佳干扰序列,为研究抑制该基因在破骨细胞分化及活化作用机制中奠定了基础。     

人Smad4克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的：克隆人抑癌基因Homo sapiens SMAD family member 4（NM_005359 1659 bp）mRNA构建人Smad4的真核表达载体。方法：从膀胱癌患者膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到Smad4基因开放阅读框架eDNA序列,并将其定向克隆到真核表达载体pcDNA3．0,构建含目的基因的pCDNA3．0-Smad4重组质粒。结果：经基因序列测定、PCR和酶切分析,证实插入载体pCDNA3．0的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列。结论：重组质粒pCDNA3．0 Smad4构建成功,为该基因的蛋白表达及其相关功能研究奠定了基础。     

野生型DPP Ⅳ真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建野生型DPP Ⅳ真核表达质粒.方法 将野生型DPP Ⅳ基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（＋）,构建成重组质粒pcDNA3 DPP Ⅳ;然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定.结果 经酶切和DNA序列测定鉴定证实重组质粒构建正确.结论 真核表达质粒pcDNA3DPP Ⅳ构建成功,为进一步研究DPP Ⅳ基因在卵巢癌细胞中的表达和生物学作用奠定了基础.     

Livin基因siRNA重组表达载体的构建

目的构建针对人抑凋亡基因Livin的小干扰RNA（siRNA）重组表达质粒载体。方法通过分子克隆技术,设计并合成具有基因特异性的3组寡核苷酸片段,克隆到pmU6质粒载体,并经菌落PCR鉴定及测序鉴定,Livin的siRNA序列成功克隆到重组表达质粒载体中。结果经菌落PCR鉴定及测序鉴定证实,人Livin的siRNA序列成功克隆到表达载体中,插入序列正确。结论成功构建了Livin siRNA质粒表达载体,为后续研究降低或沉默Livin基因表达后能否有效抑制膀胱癌细胞增殖和促进细胞凋亡奠定了基础。     

人 Orail基因真核表达载体的构建及在足细胞中的表达

目的构建重组人 Orail基因真核表达载体,观察其在小鼠肾小球足细胞株（MPC5）中的表达。方法根据GenBank数据库检索到的人 Orail基因序列,人工合成法合成Orail基因编码区（coding sequence,CDS）全长序列,克隆至质粒表达载体PG-CMV-IRES-EGFP,构建重组质粒载体PC-CMV-Orail,通过PCR、双酶切及基因测序等方法进行鉴定;以脂质体转染法将重组质粒转染至MPC5细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光检测转染效率,RT-PCR、Western blot法分别检测Orail基因的转录与翻译。结果PCR扩增的片段长度为906bp,双酶切出现两条带,其中约906bp处可见目的条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的人 Orail基因的CDS序列完全一致。转染后48h置荧光显微镜下观察,85％以上的足细胞中可见绿色荧光。RT-PCR及Western blot实验结果分别显示转染后的MPC5细胞在mRNA与蛋白水平表达Orail均有所增强。结论成功构建了重组人 Orail基因真核表达载体PG-CMV-Orail,并建立了过表达Orail基因的肾小球足细胞模型,为深入研究钙库操纵的Ca2’通道与足细胞病之间的关系奠定了良好的实验基础。     

携带DNMT3b—shRNA干扰序列真核表达载体的构建及筛选

目的：构建携带针对靶基因DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferase 3b,DNMT3b）mRNA的shRNA真核表达载体,并从构建成功的重组质粒中筛选出沉默效应最强的干扰质粒。方法：以基因DNMT3bmRNA为靶序列设计三条shRNA序列,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil-1中,构建重组质粒pGensil-1-DNMT3b-shRNA1、pGensil-1-DNMT3bshRNA2、pGensil-1-DNMT3b—shRNA3;经酶切鉴定和测序分析后,将重组质粒分别转染T24细胞中,应用RT—PCR和Western—blot检测各组质粒对DNMT3bmRNA和蛋白的表达抑制情况,并筛选最有效的干扰序列。结果：各重组质粒经酶切鉴定和测序分析显示插入完全正确。RT—PCR结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3bmRNA的抑制率分别为20．44％、79．91％和54．48％;Western blot结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3b蛋白的抑制率分别为17．27％、77．74％和56．79％。结论：成功构建了质粒pGensil-1-DNMT3bshRNA（1,2,3）,并筛选出pGensil-1-DN—MT3bshRNA2为沉默效应最强的质粒。     

真核表达载体plRES2EGFP—Cadherin-11的构建及其在BMSCs内的表达

目的构建plRES2EGFP—Cadherin—11真核表达载体,并检测其在BMSCs中的表达情况。方法应用聚合酶链反应技术从人Cadherin-11 cDNA中扩增出Cadherin-11基因后,以内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切。将其插入用相同酶处理的载体pIRES2EGFP;将重组质粒转染BMSCs,应用Westernblot方法检测其在细胞中的表达情况。结果酶切和测序结果表明,扩增的Cadherin-11基因序列正确,大小为2390bp;Western blot表明,Cadherin-11蛋白在BMSCs中正确表达,大小约88kD。结论Cadherin—11蛋白能在BMSCs中高度表达,可望用于提高BMSCs与支架材料的粘附性。     

人p27^kip1基因腺相关病毒载体的构建

目的克隆人肿瘤转移抑制基因p27^kip1利用基因重组技术,构建其腺相关病毒载体,为进一步研究骨肉瘤的基因治疗建立一个平台。方法从人正常胎盘组织中提取总RNA,RT—PCR获取p27^kip1基因（ORF）cDNA序列,并将其克隆至腺相关病毒载体pAAV—MCS,构建人p27^kip1基因腺相关病毒载体。结果人胎盘组织抽提总RNA,并通过RT—PCR获得目的基因ORF,经TA克隆后,将目的基因连人pAAV—MCS中,送测序结果无误。结论成功构建的重组质粒pAAV—MCS—p27^kip1将为进一步研究p27^kip1蛋白的生物学效应提供基础,为p27^kip1基因应用于骨肉瘤的治疗提供实验依据。     

Wistar大鼠smad3 cDNA序列测定及其mRNA水平实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的：克隆和测定Wistar大鼠smad3基因部分序列,构建检测Wistar大鼠smad3基因表达的重组质粒标准品并建立实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）方法。方法：提取并培养Wistar大鼠皮肤成纤维细胞的总RNA,逆转录（RT）-PCR扩增,将扩增产物克隆到PMD-18T载体上,测序分析。用已测定序列的T载体作为标准品建立实时荧光定量PCR方法,并检测转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激对培养Wistar大鼠皮肤成纤维细胞smad3 mRNA表达的影响。结果：测定Wistar大鼠smad3基因cDNA序列长415bp,其与人、家鼠、小鼠具有较高的同源性,已被GenBank收录（DQ409172）。建立的实时荧光定量PCR方法在10^3-10^7拷贝数/μl的标准品梯度稀释范围内相关系数为0.98946。25ng/ml TGF-β1刺激后Wistar大鼠皮肤成纤维细胞smad3基因表达升高为PBS刺激对照组的1.5倍。结论：获得Wistar大鼠smad3基因序列并成功建立了smad3实时荧光定量PCR的方法,为Smad3作用的分子机制研究提供了实验基础。