耳聋基因panel在耳聋基因诊断中的临床应用

目的探讨耳聋基因panel技术在耳聋患者基因诊断中的应用。方法40例耳聋患者首先采用荧光定量PCR结合Sanger测序法检测4个常见耳聋基因的25个位点突变,初检结果单杂合致病突变者行耳聋基因单基因测序或耳聋基因panel检测;初检结果未发现耳聋基因致病性突变者直接行耳聋基因panel检测。16例患者行父母耳聋基因溯源验证。结果40例患者中,耳聋基因筛查检出GJB2基因纯合或复合杂合突变8例、单杂合突变2例,SLC26A4基因纯合突变1例、单杂合突变2例。4例单杂合突变检出者接受进一步的耳聋单基因或耳聋基因panel测序,其中2例分别检出GJB2基因c.235delC/c.610delC及c.235delC/c.109G>A复合杂合突变,2例检出SLC26A4基因c.919-2A>G/c.1548_1549insC复合杂合突变。27例初检结果阴性患者接受了进一步的耳聋基因panel检测,检出GJB2基因c.109G>A纯合突变4例和c.571T>C/c.G109A复合杂合突变1例,MYO7A基因c.397dupC/c.3484A>T复合杂合突变1例,MYO15A基因c.4779+2T>C/c.5008-2A>G复合杂合突变1例,ACTG1基因c.118C>T单杂合突变1例,CDH23基因c.1765G>A/c.6504T>A及c.6049G>A/c.7225-1G>A复合杂合突变各1例。在16例行父母溯源的耳聋患者中,15例患者耳聋基因突变分别遗传自其父母。结论对于耳聋基因热点突变检测结果阴性的耳聋患者,应用耳聋基因panel能有效提高遗传性致病基因检出效率,为其遗传学诊断和临床治疗提供依据。     

GJB2单杂合突变非综合征型耳聋患者GJB2序列长度检测

目的检测GJB2单杂合突变非综合征型耳聋患者GJB2全序列中是否有大片段的碱基插入或缺失,研究GJB2全序列长链PCR方法和电泳方法。方法应用长链PCR方法对201例GJB2单杂合突变非综合征型耳聋患者进行GJB2全序列长度检测,对照组为111例听力正常的成年人。应用两步法PCR,调整加入DNA模板量、PCR延伸时间、循环次数等,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的长度和量,调整加样槽的宽度、加样量、电泳电压、电流、电泳时间得到清晰条带,若PCR产物存在大片段碱基插入或缺失,用限制性内切酶BamHI进行内切酶反应,初步判断插入或缺失的大致位置。结果 201例GJB2单杂合突变患者中,GJB2序列长度未见大片段碱基插入或缺失。对照组GJB2序列长度未见异常。结论 GJB2单杂合突变非综合征型耳聋患者中GJB2序列长度检测未见明显异常。     

非综合征型聋患者常见耳聋基因突变分析

目的分析重度和极重度非综合征型聋患者常见耳聋基因突变情况,从分子水平了解该人群聋病的遗传病因和特点,为临床防聋治聋提供策略、依据。方法应用遗传性耳聋基因芯片对179例非综合征型聋患者GJB2、GJB3、SLC26A4、线粒体12SrRNA基因中9个热点突变进行检测,同时结合耳聋病因问卷调查、纯音听阈测试、听性脑干反应测试、声导抗、颞骨CT检查。结果 179例患者中,79例存在不同程度的被检测基因位点突变,其中3例同时携带二个基因突变:①42例存在GJB2基因突变,其中:176del16位点纯合突变1例、单杂合突变2例;235delC位点纯合突变17例、单杂合突变9例;299delAT位点纯合突变0例、单杂合突变2例;235delC/299delAT复合杂合突变7例,235delC/176del16复合杂合突变4例。②37例存在SLC26A4基因突变,其中:2168A>G位点单杂合突变4例;IVS7-2A>G位点纯合突变13例,单杂合突变17例;2168A>G/IVS7-2A>G复合杂合突变3例。③3例存在线粒体12SrRNA基因突变,其中2例1555A>G位点均质突变,1例1494C>T位点均质突变;④无GJB3基因突变。在基因水平,明确诊断遗传性聋者48例,占26.80%,遗传性耳聋基因突变携带者31例,占17.32%。结论 GJB2、SLC26A4突变是安徽地区重度和极重度非综合征型聋患者主要突变形式、其次是线粒体12SrRNA基因突变,通过筛查可以明确部分非综合征型聋的病因,可以为患者及其家族成员提供准确的遗传咨询和指导,为再次生育家庭提供产前诊断,从而为防聋治聋提供帮助。     

贵州省356例非综合征型聋患者常见致聋基因突变分析

目的：分析贵州省356例非综合征型聋患者常见耳聋基因突变特点,初步了解其耳聋基因热点突变谱系及频率。方法采集贵州省356例平均年龄为11．90±12．23岁的非综合征型感音神经性聋患者的外周血,提取基因组DNA,应用遗传性耳聋基因芯片检测试剂盒对GJB2、SLC26A4、GJB3及线粒体DNA12SrRNA基因的9个突变热点（GJB2基因35delG、176del16、235delC、299delAT 突变,SLC26A4基因 IVS7－2A＞G、2168A＞G 突变,GJB3基因538C＞T突变,12SrRNA基因1555A＞G和1494C＞T 突变）进行检测。结果356例非综合征型聋患者中,88例（24．72％）携带不同基因突变;1例携带 GJB2、SLC26A4双基因突变;GJB2基因突变40例（11．24％）（含前述1例双基因突变者）,其中纯合突变19例（5．34％）,复合杂合突变5例（1．40％）,单杂合突变15例（4．21％）;SLC26A4基因突变29例（8．15％）（含前述1例双基因突变者）,其中纯合突变9例（2．53％）,单杂合突变19例（5．34％）;线粒体DNA12SrRNA 基因突变19例（5．34％）,其中1555A＞G 均质突变10例（2．81％）,1555A＞G异质突变7例（1．97％）,1494C＞T 均质突变2例（0．56％）;1例患者携带GJB3基因538C＞T 杂合突变。结论贵州省NSHL患者以GJB2基因和SLC26A4基因为最主要的致病基因,其中235delC突变为最常见突变位点,其次为IVS7－2 A＞G突变。     

山东省滨州市特教学校耳聋学生分子病因学分析——GJB2235delC突变、线粒体DNA12S Rrna A1555G突变和SLC26A4ⅣS7-2A>G突变筛查报告

目的 对山东滨州市特教学校学生进行耳聋分子流行病学调查,了解耳聋的常见分子病因.方法 对山东省滨州市阳信、无棣、惠民三县特教学校年龄5～19岁的78名重度耳聋学生进行遗传性耳聋问卷调查、全面体格检查、耳鼻咽喉专科检查以及听力学评估(纯音测听和声导抗)等,应用限制性内切酶法分别对GJB2基因235delC突变、线粒体DNA 12S rRNA基因A1555G点突变进行分析,应用直接测序法检测SLC26A4基因ⅣS7-2A>G突变.结果 非综合征性耳聋74例.其中,10例(13.51%)携带GJB2基因235delC纯合突变,1例(1.35%)携带GJB2基因235delC和299DelAT复合杂合突变,3例(4.05%)携带GJB2基因235delC杂合突变,2例(2.70%)携带GJB2基因299DeLAT杂合突变;5例(6.76%)携带线粒体DNA 12S rRNA基因A1555G点突变;3例(4.05%)携带SLC26A4基因ⅣS7-2A>G纯合突变,1例(1.35%)携带SLC26A4基因ⅣS7-2A>G杂合突变.18.92%(14/74)的非综合征性耳聋患者携带GJB2基因235delC和SLC26A4基因ⅣS7-2A>G双等位基因突变(纯合突变+复合杂合突变);8.11%(6/74)的非综合征性耳聋患者携带GJB2基因和SLC26A4基因ⅣS7-2A>G单杂合突变.4例综合征性耳聋患者在所检测范围内均未发现突变.结论 山东省滨州地区特教学校耳聋患者存在较高的GJB2基因235delC、线粒体DNA 12SrRNA基因A1555G和SLC26A4基因ⅣS7-2A>G突变发生率,线粒体DNA 12S rRNA 基因A1555G突变发生率高于全国平均水平.聋病分子流行病学调查提示山东省滨州地区23.08%的特教学校耳聋患者在分子水平能够明确诊断,另有8.97%的患者有强烈的遗传倾向.准确的耳聋早期诊断、遗传咨询、及时干预和治疗在这一地区的聋哑人群中是非常重要的.     

赤峰市特教学校耳聋患者GJB2和GJB3及GJB6基因突变分析

目的:利用基因诊断的方法调查内蒙古自治区赤峰市特教学校非综合征耳聋患者的常见分子病因,对GJB2、GJB3、GJB6基因编码区突变进行分析.方法:调查对象来自赤峰市特教学校非综合征耳聋患者134例(耳聋组),对照组为中国北方地区(北京、河北、内蒙、山西)听力正常者100例.所有受检者均采集外周血并提取DNA,首先进行GJB2基因编码区测序,对携带GJB2单杂合突变的患者进一步检查GJB6 del(GJB6-D13S1830)突变并进行GJB6编码区测序.对除GJB2基因、线粒体A1555G突变相关性耳聋及前庭水管扩大综合征外的分子病因不明的91例非综合征耳聋患者进行GJB3基因编码区测序.结果:134例非综合征耳聋患者及100例正常对照中共检测到6种GJB2基因新的突变方式.耳聋组41例携带GJB2病理性突变,其中双等位基因突变22例,单等位基因突变19例,在GJB2单等位基因突变的耳聋患者中未检测到GJB6 del(GJB6-D13S1830)及编码区其他突变;对照组4例携带GJB2基因病理性突变.在91例分子病因不明的耳聋患者及100例正常对照中共检测到3种GJB3基因新的突变方式.耳聋组2例携带GJB3基因病理性突变,均为杂合子,其中1例同时携带GJB2单等位基因突变235delC;对照组1例携带GJB3基因病理性突变.结论:通过GJB2、GJB6、GJB3基因编码区突变分析为赤峰市特教学校16.42%(22/134)的非综合征耳聋学生明确了分子病因;新发现的突变和多态丰富了中国人GJB2、GJB3基因突变及多态性图谱,为深入开展耳聋基因筛查奠定了基础.     

新疆维吾尔族及汉族常见耳聋基因热点突变调查结果分析比较

目的探讨新疆地区维吾尔族和汉族常见耳聋基因流行病学的差异。方法本文针对新疆地区2731例非综合征型重度、极重度感音神经性耳聋患者,应用晶芯耳聋基因试剂盒,对GJB2、SLC26A4、线粒体12Sr RNA、GJB3常见耳聋基因的10个突变位点(GJB2c.235del C、c.35del G、c.176del16bp、c.299_300del AT,SLC26A4 IVS7-2、c.2168A>G,GJB3 c.538C>T、c.547G>A,mitochondrial 12Sr RNA m.1555A>G、m.1494C>T)进行常见已知耳聋基因的抽样调查;结果 2731例新疆地区非综合征型重度、极重度感音神经性耳聋患者中,GJB2基因突变率7.84(214/2731),汉族10.56%(131/1241)、维吾尔族5.57%(83/1490),普遍低于全国其他研究报道,GJB2 c.235del C是汉族和维吾尔族突变热点;检出携带有SLC26A4基因突变的有132例,SLC26A4汉族、维吾尔族耳聋人群检出率分别9.51%(118/1241)、0.94%(14/1490);检出携带有12Sr RNA基因突变的有149例,汉族120例,维吾尔族29例,占各自耳聋人群检出率的9.67%(120/1241)、1.95%(29/1490)。结论 GJB2基因、SLC26A4、线粒体基因12Sr RNA为新疆非综合征型耳聋常见致病基因,GJB2c.235del C是汉族和维吾尔族突变热点,携带杂合突变的耳聋患者可能有其他基因突变致聋的可能。     

重庆市永川地区青少年耳聋患者耳聋基因热点突变筛查分析

目的筛查重庆市永川地区非综合征型青少年耳聋患者中我国耳聋基因热点突变,初步了解该地区耳聋基因热点突变谱系及发生频率。方法收集重庆市永川区特殊教育学校的永川籍非综合征型青少年耳聋患者60例,经监护人知情同意,抽取外周静脉全血并提取基因组DNA,应用晶芯R九项遗传性耳聋检测试剂盒(微阵列芯片)检测中国人群中常见的4个耳聋基因的9个突变位点,包括GJB2(235delC、176del16、299delAT和35delG)、SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)、线粒体12SrRNA(1494C>T、1555A>G)、GJB3(538C>T)。结果 60例受检者全部为重度或极重度非综合征型耳聋,共检出耳聋基因突变22例,其中GJB2235delC纯合突变型2例;GJB2235delC/176del16复合杂合突变型1例;GJB2235delC/299delAT复合杂合突变型1例;GJB2235delC杂合突变型8例;GJB2299delAT纯合突变型1例;GJB235delG/SLC26A4IVS7-2A>G复合杂合突变型1例;SLC26A4IVS7-2A>G杂合突变型2例;线粒体12SrRNA1555A>G均质型突变型6例。60例受检者中47号与55号为亲兄妹,后续统计仅纳入先证者,所以只将47号纳入统计,样本总量计为59例。59例耳聋患者中我国耳聋基因热点突变的携带率是37.29%(22/59),其中GJB2基因突变是该人群首要的致病因素,携带率为23.73%(14/59),线粒体12SrRNA基因突变检出率为10.17%(6/59),高于SLC26A4基因的5.08%(3/59),未检出GJB3基因突变。结论重庆市永川地区非综合征型青少年耳聋患者耳聋基因突变携带率较高,对该地区耳聋患者及高危人群进行耳聋基因突变的筛查是防控永川地区遗传性耳聋的首要步骤,在此基因诊断的基础上再结合用药指导、产前诊断、临床干预可有效减少该地区耳聋的发生。     

339例非综合征型耳聋患者致病基因突变分析

目的通过分析东北地区339例非综合征型耳聋患者的常见耳聋基因序列,初步了解其耳聋热点基因突变特点及频率,为临床耳聋的预防及治疗提供参考。方法收集东北地区在中国医科大学附属盛京医院就诊的非综合征型耳聋患者339例,采集外周血并从中提取DNA,应用DNA测序法对中国人群中常见的4个致聋基因GJB2,GJB3,SLC26A4及线粒体12srRNA进行检测。其中GJB2,GJB3基因采用全基因组测序;SLC26A4,及线粒体12srRNA基因则采用对其常见的热点突变位点进行检测。结果 339例患者中,共检测出基因突变患者114例,检出率为33.63%(114/339),其中66例GJB2基因突变(19.47%, 66/339);7例GJB3基因突变(2.06%,7/339);39例SLC26A4基因突变(11.50%,39/339);4例12srRNA基因突变(1.18%, 4/339);其中2例为复合基因突变。114例耳聋基因突变患者中有62例单杂合突变为携带单个致病基因的耳聋患者;52例为由基因突变致聋的患者,其中30例纯合突变,6例单杂合突变和16例复合突变。结论 GBJ2和SLC26A4基因为东北地区非综合征性耳聋患者中的最为常见致病基因。c.235delC为GJB2基因突变主要形式,c.919A>G为SLC26A4基因突变主要形式。c.580G>A为GJB3基因突变主要形式,1555A>G为12srRNA基因突变主要形式。     

河北涿州、高碑店市特教学校非综合征性聋分子病因学分析——GJB2 235delC突变、SLC26A4 IVS7-2A＞G突变和线粒体DNA12SrRNA A1555G突变筛查报告

目的 对河北涿州、高碑店地区重度耳聋患者进行分子流行病学调查，了解耳聋的常见分子病因。方法 对河北涿州、高碑店市特殊教育学校64名耳聋学生进行遗传性耳聋问卷调查、全面的体格检查、耳鼻咽喉专科检查以及听力学评估（包括纯音测听和声导抗）。对64名非综合征型感音神经性耳聋患者分别进行GJB2基因235delC突变、线粒体DNA 12SrRNA基因A1555G点突变的限制性内切酶分析。应用直接测序法检测SLC26A4基因IVS7—2A〉G突变。结果7例（10．93％）携带GJB2基因235delC纯合突变；9例（14．06％）携带GJB2基因235delC杂合突变；6例（9．37％）携带SLC26A4基因ⅣS7—2A〉G纯合突变，12例（18．75％）携带SLC26A4基因IVS7—2A〉G杂合突变：未发现携带线粒体DNA 12SrRNA基因A1555G点突变者。结论 河北涿州、高碑店地区非综合征型耳聋患者存在较高的GJB2基因235delC和SLC26A4基因ⅣS7—2A〉G突变发生率，而线粒体DNA 12SrRNA基因A1555G突变发生率低于全国平均水平。聋病分子流行病学调查提示河北涿州、高碑店地区20.3％的非综合征型耳聋患者在分子水平能够明确诊断．另有32．81％的患者有遗传倾向。进行准确的耳聋早期诊断、遗传咨询、及时干预和治疗在这一地区的聋哑人群中非常重要。     

基因芯片法检测21例耳聋患者基因突变的研究

目的探讨基因芯片在耳聋基因筛查中的应用价值。方法对扬州市聋哑学校21例8～18岁的耳聋患者中4个耳聋相关基因上的9个热点突变进行检测,包括GJB2(35 delG、176 del16、235 delC及299 delAT)、GJB3(C538 T)、SLC26 A4(IVS7-2 A>G、A2168 G)以及线粒体12 S rRNA(A1555G、C1494T)。结果 SLC26A4突变阳性率为38%(8/21),其中IVS7-2A>G杂合突变7例,IVS 7-2 A>G与A 2 1 6 8 G杂合突变1例;GJB 2突变阳性率为1 9%(4/2 1),其中1 7 6 del 1 6杂合突变1例,299 delAT杂合突变1例,176 del 16与235 del C杂合突变1例,235 del C纯合突变1例。结论基因芯片是一种筛查耳聋基因的高效、经济、简便、灵敏及特异性方法。     

Gene therapy and nasopharyngeal carcinoma

In 2003, a non-replicating adenoviral gene therapy product received the world`s first government licence for the treatment of head and neck cancer. Two years later approval was granted to a replication-selective adenovirus for the treatment of nasopharyngeal carcinoma in combination with chemotherapy. This review introduces the reader to gene therapy as an emerging treatment modality, and outlines its application to the management of nasopharyngeal carcinoma by examining recent pre-clinical and clinical research.     

Gene therapy for laryngeal paralysis

OBJECTIVES: The surgical options for laryngeal paralysis only achieve static changes of vocal fold position. Laryngeal reinnervation procedures have had little impact on the return of dynamic laryngeal function. The development of a new treatment for laryngeal paralysis, aimed at the return of dynamic function and neurologic restoration and regeneration, is necessary. METHODS: To assess the possibility of gene therapy for laryngeal paralysis aiming for the return of dynamic laryngeal function, we investigated the therapeutic effects of gene therapy using rat laryngeal paralysis models. RESULTS: In a rat vagal nerve avulsion model, we transferred glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) gene into the nucleus ambiguus using an adenovirus vector. Two and 4 weeks after the GDNF gene transfer, a significantly larger number of surviving motoneurons was observed. These neuroprotective effects of GDNF gene transfer were enhanced by simultaneous brain-derived neurotrophic factor gene transfer. In a rat recurrent laryngeal nerve crush model, we transferred GDNF gene into recurrent laryngeal nerve fibers after crush injury. Two and 4 weeks after GDNF gene transfer, we observed significantly faster nerve conduction velocity and better vocal fold motion recovery. CONCLUSIONS: These results indicate that gene therapy could be a future treatment strategy for laryngeal paralysis. Further studies will be necessary to demonstrate the safety of the vector before clinical application.     

基因突变与耳蜗微环境

随着分子生物学的发展,对遗传性聋的调查和研究逐渐深入.据报道,1/2000-1/1000的儿童出生时为极重度耳聋[1],其中50%～60%为遗传性聋.     

An Inner Ear Gene Expression Database

Microarray technology has provided an unprecedented opportunity to study gene expression profiles at a whole-genome level. As a first step toward a comprehensive understanding of inner ear gene expression, mouse cochleas were examined at two developmental stages (P2 and P32) using GeneChip oligonucleotide arrays. A large number of genes and ESTs (>10,000) were found to be expressed in the cochlea. Expression profiles derived from duplicate samples at the same developmental stages showed general agreement and indicated the reproducibility of the assay. The expression of many known hair-cell genes was detected in the whole-cochlea samples, demonstrating the relatively high sensitivity of the assay. Genes highly expressed only at P2 or P32 were also identified and their expression patterns correlate with their functions in the cochlea. A web-based database with external links was set up for public access, which should facilitate the discovery of genes important in the development and function of the inner ear and should aid the identification of additional deafness genes.     

AIF基因的能量代谢功能分析

目的量化AIF基因在细胞能量代谢中的功能特性,探讨该基因相关听神经病的分子致病机制。方法选择第三代基因编辑工具CRISPR-Cas9技术结合阳离子脂质体转染技术,快速实现对HELA细胞的AIF基因进行敲除,并通过Western blot进行蛋白表达分析,Sanger测序进行基因型的分析,然后利用Oxygraph-2K对多个AIF基因敲除细胞系以及野生型细胞系进行氧化供能的检测,最后采用Graph Pad prism5.00进行数据分析。结果通过该方法获得了多株AIF基因敲除细胞系,并发现野生型细胞系耗氧功能明显强于AIF基因敲除细胞系。结论通过CRISPR-Cas9技术的应用,本研究快速实现了AIF蛋白表达缺失细胞系和野生型细胞系在氧化呼吸方面的差异比较,间接量化了该基因缺失所导致的能量损失,能量供应障碍可能是听神经病的致病机制之一。     

Gene localization by linkage analysis.

Traditional genetic approaches have led to the identification of defects underlying an impressive array of diseases. Genetic terminology, Mendel's laws, chromosomes and linkage, statistical methods for linkage analysis, genetic markers, multilocus mapping, strategies in linkage studies, linkage heterogeneity, and the future of linkage analysis are discussed in this article. The molecular basis for most disorders, however, cannot be gleaned because there is no identifiable primary metabolic disorder.