反式二羟环氧苯(a)芘相关新基因brg的全长克隆

背景与目的:在前期研究中发现,16HBE-C细胞表达变化的基因中有未知基因参与,因其与BPDE有关,所以命名为brg(anti-BPDE related gene)基因.本研究应用cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增此未知基因的全长,以进行下一步的基因功能研究.材料与方法:应用cDNA末端快速扩增法(RACE技术),对3'和5'端分别设计了梯度PCR,巢式PCR等优化程序,以获得特异的产物,然后对特异产物直接测序,将测序结果进行生物信息学分析,基因拼接等获得新基因brg全长.结果:3'和5'端均成功获得特异性产物,3'RACE测序为394 bp,有明显的PolyA加尾信号,有编码区的终止密码子;5'RACE测序为1 017bp,有起始密码子ATG,其中197 bp为3'和5'全长共有序列.将3'和5'序列拼接,结果全长1 214 bp,生物信息学分析brg基因阅读框1 032 bp,编码344个氨基酸.结论:所得结果与设计一致,说明所采用的技术路线是简便可行的,brg基因可能在反式二羟环氧苯并(a)芘的致癌机制中起重要作用.     

胃癌相关基因gcI的克隆及其功能预测

目的:应用生物信息学平台对胃癌相关基因表达片段进行cDNA全长克隆及序列分析和蛋白功能预测.方法:选用人胃癌、癌前病变及正常胃粘膜组织经mRNA差异显示技术筛选获得的差异表达片段,对所获得的1条功能未知基因表达片段"Ⅰ",利用5'cDNA末端快速扩增方法扩增全长cDNA,结合Northern杂交印迹方法进行验证分析;利用NCBI、EMBL数据库资源分析其编码氨基酸的生物学特征以及预测其编码蛋白的功能.结果:扩增得到序列Ⅰ的全长cDNA,命名为gcI.分析显示gcI含有2个跨膜区,定位于胞膜;含有3个蛋白激酶C磷酸化位点和3个N端豆蔻酰化作用位点.结论:克隆的胃癌相关基因表达全长序列gcI、编码与信号转导有关的跨膜蛋白,可能是参与胃癌发生过程中的相关基因.     

胃癌相关基因gcl的克隆及其功能预测

目的：应用生物信息学平台对胃癌相关基因表达片段进行cDNA全长克隆及序列分析和蛋白功能预测。方法：选用人胃癌、癌前病变及正常胃粘膜组织经mRNA差异显示技术筛选获得的差异表达片段，对所获得的1条功能未知基因表达片段“I”，利用5＇cDNA末端快速扩增方法扩增全长cDNA，结合Northern杂交印迹方法进行验证分析：利用NCBI、EMBL数据库资源分析其编码氨基酸的生物学特征以及预测其编码蛋白的功能。结果：扩增得到序列I的全长cDNA，命名为geI。分析显示gcI含有2个跨膜区，定位于胞膜；含有3个蛋白激酶C磷酸化位点和3个N端豆蔻酰化作用位点。结论：克隆的胃癌相关基因表达全长序列geI、编码与信号转导有关的跨膜蛋白，可能是参与胃癌发生过程中的相关基因。     

抗人小细胞肺癌单抗4B3重、轻链可变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

目的　获得抗人小细胞肺癌单抗 4B3的重 ,轻链可变区基因。方法　根据小鼠免疫球蛋白可变区骨架区的保守序列分别设计了 4B3单抗重 ,轻链的可变区基因体外扩增的两对引物 ,从体外培养的 4B3杂交瘤细胞中提取总RNA ,反转录成cD NA ,以cDNA为模板 ,分别用设计的两对引物进行PCR扩增 ,扩增出的重 ,轻链基因片段 ,分别插入载体 pT Adv中 ,筛选出阳性克隆 ,并测序、分析。结果　重链可变区基因全长 345bp ,编码 115个氨基酸 ,轻链可变区基因全长 315bp ,编码 10 5个氨基酸。结论　上述研究为 4B3单抗的进一步改造和利用提供了实验基础。     

在肝母细胞瘤中筛选XTP6的反式调节基因及其意义

目的: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建XTP6反式激活相关基因差异表达的cDNA文库,筛选XTP6蛋白反式激活相关基因.方法: 构建XTP6真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP6,并将其转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;48h后收获细胞后提取mRNA并逆转录成cDNA,tester cDNA经RsaI酶切消化后分成两组,分别与两种不同接头衔接,再与过量的driver cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR反应,第二次PCR产物与pGEM-Teasy克降载体连接,构建cDNA消减文库,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析.结果: 成功构建人XTP6蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA文库.扩增后得到70个200-1000bp插入片段的克隆,随机挑选其中20个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得11种已知功能编码基因.结论: 筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞周期调节、生物代谢和炎症修复密切相关的蛋白编码基因.     

新的与辐射诱导恶性转化相关全长基因Lcrp369克隆及生物信息学分析

背景与目的:辐射诱导细胞恶性转化过程中涉及到众多基因,其中包括大量未知的新基因,克隆新的辐射诱导相关全长基因,从基因水平认识细胞恶性转化过程中生长、分化、再生和癌变的分子机理,对于研究辐射致癌的发生、发展规律具有重要意义.对此,本文旨在克隆新的与辐射致癌相关的全长基因.方法:应用SMART RACE方法扩增T54EST片段的全长序列,测序后进行拼接及RT-PCR验证.并应用生物信息学方法对得到的新的mRNA序列进行生物信息学分析.结果:克隆了一条新的全长基因Lcrp369.经对其进行初步的生物信息学分析发现该基因是位于染色体14p22号臂上的一条功能尚不清楚的基因.其编码区域由7个外显子和6个内含子组成,mRNA全长1 038 bp,编码一244个氨基酸的蛋白,合成的蛋白位于细胞核内,具有DNA结合位点及N-糖基化位点、依赖于cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化作用位点、酪蛋白激酶磷酸化位点.该蛋白二级结构推测为含有α螺旋结构为主的蛋白,其分子量为28 000,等电点为6.19.数字化组织表达谱系分析结果发现,该基因表达广泛,可在多个组织中表达及在多种肿瘤中表达.该基因全长已经登录到GENBANK上,ID号DQ525179.结论:成功地利用SMART RACE技术克隆了一条新的全长基因Lcrp369,生物信息学分析结果提示其与辐射致癌有关,其具体作用及功能尚有待进一步的实验学研究.     

重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定共刺激分子融合基因上的应用

目的　将小鼠共刺激分子 B7- 1(m B7- 1)基因的胞外区与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,探讨其形成融合基因的作用。方法　利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PL AP- 1C末端信号肽序列和 m B7- 1基因的胞外区序列 ,然后将二段基因拼接起来 ,拼接后与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果　分别成功扩增出 h PL AP- 1C末端信号肽序列 15 5 bp和 m B7- 1基因的胞外区序列 76 4 bp,并将二段基因序列成功拼接 (891bp) ,经测序是正确的。结论　重叠区扩增基因拼接法能拼接 m B7- 1基因的胞外区与 h PL AP-1C末端信号肽序列 ,能形成融合基因     

肝癌组织中三个MAGE家族基因的克隆

目的:从肝癌组织中克隆肿瘤相关抗原基因MAGE-1的全长cDNA,为该基因及其编码抗原应用于肝癌的免疫治疗奠定基础.方法:根据MAGE-1编码区上、下游序列设计一对引物,用RT-PCR方法从肝癌组织中扩增该基因的全长cDNA,酶切产生粘性末端后连接入PUC19质粒.经初步酶切鉴定后,通过DNA序列分析获取所克隆基因片断的核苷酸序列.结果:成功地克隆了MAGE-1基因的全长cDNA,同时还获得一约750bp的MAGE-3基因片段及一与MAGE-6和MAGE-12高度同源的基因的克隆.此与MAGE-6,-12高度同源的基因可能为一未知MAGE家族成员.结论:肝癌组织中表达多种MAGE家族基因,甚至可能存在未知MAGE家族基因的表达,这将为寻找肝癌免疫治疗的攻击靶点开辟新的途径.     

LCRG1基因5′端调控区域的克隆及活性测定

背景与目的:LCRG1基因的调控机制至今不清楚,本研究拟克隆LCRG1基因的转录起始区上游序列,寻找与其表达有关的调控序列。方法:利用生物信息学技术预测LCRG1基因5′端调控区域的启动子活性区域,采用PCR方法从人基因组DNA中扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,并将其构建到荧光素酶报告基因pGL3basic载体中。与内参照质粒PhRL-SV40共转染COS7细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果:成功扩增LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp)片段,测序正确;pGL3-1776启动子活性大约为阳性对照组pGL3-control的0.16倍,为阴性组pGL3basic的35倍。结论:成功克隆LCRG1基因5′端调控区域1.776kb(-1191bp～ 585bp),该片段具有启动子活性。     

人肝癌细胞差异表达基因纤维蛋白原γ-多肽的克隆与鉴定

背景与目的：肝细胞癌(肝癌)的发生、发展与基因的异常表达有关,但详细机制还不清楚,原因在于目前所知的遗传学信息尚欠充分;本研究旨在探索新的人肝癌细胞差异表达基因。方法：应用抑制性消减杂交技术获得肝癌细胞消减cDNA,以T／A方法进行克隆,通过DNA测序分析、Norahem印迹杂交、cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE)和RT-PCR等方法加以鉴定。结果：在被克隆的消减cDNA之中,一个长度为787个核苷酸的差异表达cDNA片段经Northem印迹分析,发现其在两种人肝癌细胞株SMMC-772l和HepG2中的表达均明显高于正常肝细胞;经过RACE后获得一个长度为1597bp、具有3’端polyA结构的基因序列,它含有完整的开放阅读框,编码437个氨基酸,经同源性分析证实该基因为编码人纤维蛋白原γ-多肽(fibrinogen gamma polypeptide,FGG)的基因;RT-PCR分析证明癌组织中FGG mRNA表达水平较癌旁非癌组织明显增加,尤其是在肝癌转移灶中。结论：SMMC-772l和HepG2细胞中发现FGG高表达,FGG基因的上调表达是肝癌病理过程中一个重要分子事件。     

The cloning of hrnt-1 using a combination of cdna library screening with biotin-labeled probe and rapid amplification of cDNA ends

Although the physical map of human genome will come to an end and has assisted directly in identifying about 100 disease-causing genes, as well as providing an excellent framework for the complete sequencing of the human genome, one of the most difficult challenges ahead is to find and study genes involved in diseases that have a complex pattern of inheritance, such as those that contribute to diabetes, asthma, cancer and mental illness. It is still necessary to develop an effective method to c…     

鼻咽癌细胞中表达上调的新基因 NAG23 (FBXO 30) 的克隆与分析

目的：分离位于6号染色体长臂鼻咽癌高频等位基因不平衡位点D6S1581（6q25.3-27）附近与鼻咽癌相关的新基因。方法：运用差异RT－PCR检测定位于D6S1581附近的11个表达序列标签（expressed sequence tage,EST)在正常人鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞系中的表达水平,并对其中一个表达上调的EST在鼻咽癌组织和正常鼻咽组织中的表达情况进行分析。用Northern杂交验证其表达差异并检测其在多脏器中的表达及所代表基因的转录本大小。利用生物信息学资源克隆并获得其全长cDNA ,对该序列进行初步分析。结果：获得了一个位于6q25．3－27的在鼻咽癌中表达上调的新基因,命名为NAG23（FBXO30）(GenBank收录编号：AF248640）。该基因在68．9％的鼻咽癌活检组织中表达上调,cDNA全长3301bp,预测其开放阅读框编码一个含390个氨基酸的胞浆蛋白,该蛋白含一个F－box基序。结论：NAG23基因是一个在鼻咽癌中表达上调的新基因,很可能编码一新的F－box蛋白。NAG23可能参与了鼻咽癌的发生发展。     

IDENTIFICATION OF DRUG RESISTANT RELATED cDNA IN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINES

The mechanisms of multidrug resistance (MDR) in lung cancer are complicated, and have not yet been elucidated completely. Studies showed that clinical MDR in lung cancer can only be explained partially by known MDR related proteins1-3. Our previous study also supported this conclusion4. Therefore, in order to clarify the development mechanisms of drug resistance in lung cancer it would be helpful to identify new drug resistance genes and explore their structure and function. In this study,…     

抑制性消减杂交构建肺腺癌及同源正常组织cDNA文库

目的：分离肺腺癌及同源正常组织中的未知特异性基因片段，并建立相应的cDNA文库，为研究肿瘤基因疫苗打下良好的基础。方法：从肺腺癌及同源正常组织中分别提取总RNA，磁珠分离mRNA并逆转录为dsDNA，经RasI消化酶切将Adaptor-1和Adaptor-2R适配子分别与肺腺癌消化后的cDNA连接（作为tester），再与正常同源组织（作为driver）进行正向杂交和逆向杂交。具有上述2种不同适配子的杂交后cDNA分子，通过初次PCR和巢式PCR富集未知的cDNA片段，此PCR产物与TA克隆载体pGEM连接，转化Top10大肠杆菌，获得白色菌落并经菌液PCR扩增出未知基因片段。结果：经正向抑制性消减杂交和逆向抑制性消减杂交分别获取了肺腺癌组织及同源正常组织的特异性cDNA文库。结论：抑制性消减杂交是一种快速、方便、有效的建立cDNA文库的方法。     

细胞凋亡相关新基因Apr-3的一个转录剪接体的克隆、初步表达及纯化

目的克隆Apr-3基因的一个转录剪接体,进行原核表达,并进行初步纯化。方法培养HL-60细胞,提取HL-60细胞总RNA,应用RT-PCR获取Apr-3编码区cDNA序列的前366bp,将该cDNA与质粒pcDNA3.0连接,构建克隆载体,将其转化E.coliDH5α,进行测序,与GenBank中登录序列比对,结果正确后将该cDNA与质粒pET28a连接,构建原核表达载体,转化大肠杆菌,诱导表达获得Apr-3蛋白。结果对测序结果进行序列分析,与GenBank中登录的Apr-3编码区完全一致。Apr-3融合蛋白主要以包涵体形式存在。结论成功构建了Apr-3的原核表达载体,获得了较纯的Apr-3融合蛋白。     

一条新的人肺腺癌耐药相关基因全长cDNA片段的克隆及序列分析

背景与目的：肺癌细胞的多药耐药（multi-drug resistance,MDR)是药物治疗失败的重要原因,但其机制尚未完全清楚。我们已经通过SSH发现了1条新的耐药相关基因片段,经检索GenBank,发现其与2001年4月公布的一条新的基因序列BC006151同源性高达99%。本研究旨在克隆该基因的全长,并检验该基因在几种肺癌细胞株中的表达,为进一步研究功能和调控奠定基础。方法：根据BC006151基因序列设计引物,通过RT-PCR证实肺腺癌MDR细胞SPC-A-1/CDDP确实包含BC006151基因后,扩增该基因全长cDNA,通过测序对所得序列进行分析,并对其编码蛋白的氨基酸序列进行预测。应用半定量RT-PCR方法检验小细胞肺癌SH77、大细胞肺癌H460、肺腺癌SPC-A-1和SPC-A-1/CDDP等细胞株中该基因mRNA的表达。结果：成功克隆了BC006151基因的全长CDNA片段,长1298bp,它具有完整的阅读框和编码区,并与经SSH获得的片段有极高的同源性。该基因在MDR细胞株SPC-A-1/CDDP的表达明显高于其亲代细胞株;SPC-A-1表达高于H460,SH77未见表达。结论：BC006151基因是与cDDP致肺腺癌MDR密切相关的一条新基因。该基因全长CDNA片段的克隆将有助于阐明其在肺癌MDR发生中的作用。     

肺癌相关基因HLCDG1的克隆和表达分析

背景与目的：比较基因组杂交和微卫星多态性位点全基因组扫描结果显示肺癌患者在染色体3p、5q、6q、9p、10q、llp、13q、17p、19p等区域存在高频率的杂合性缺失,提示可能有多个未知的易感基因或抑癌基因与肺癌的发生、发展相关。本研究选用在mRNA差异显示研究中获得的在肺癌组织中表达下调且代表新基因的表达序列标签(expressed sequence tag,EST)LXDDl为进一步研究对象,克隆其全长cDNA。方法：采用Northern杂交验证LXDDl在肺癌中的表达差异。并用MTN(Multiple Tissue Northern Blots^TM)膜检测其在正常组织中的表达及其所代表基因的转录本大小;克隆其全长cDNA,并利用生物信息学对该序列进行初步分析;用差异RT-PCR检测新基因在肺癌组织、配对癌旁非癌组织、肺癌细胞系和其它肿瘤细胞系中的表达。结果：成功地克隆了一个在肺癌中表达下调的新基因。HLCDGl(human lung carcinoma deleted gene 1),GenBank登录号为AF447582,全长cDNA为3．113kb,预测其开放阅读框编码一个含166个氨基酸的跨膜蛋白质。通过电子-聚合酶链反应(electric-polymerase chain reaction,e-PCR)将该基因定位于5q33。结论：HLCDGl基因是一个在肺癌中表达下调的新基因。这提示HLCDGl可能与肺癌的发生、发展相关。     

编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

目的：获得编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列。方法：针对编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物，通过反转录PCR技术，从雌性成年牛蛙肝脏中，扩增出编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白的基因序列，并将其克隆入栽体pUCm-T中，通过酶切及序列测定鉴定重组栽体。结果：经序列测定证实，重组栽体含有正确编码牛蛙核糖核酸酶成熟蛋白基因的cDNA序列。结论：获得的阳性克隆含有374bp的重组片段，为进一步深入研究其生物学活性及其抗肿瘤功能莫定了基础。