苦瓜蛋白诱导K562细胞凋亡及其对Bcl-2、PCNA蛋白表达的影响

目的：观察苦瓜蛋白是否具有诱导K562细胞凋亡的生物学活性，探讨苦瓜蛋白对K562细胞Bcl-2及PCNA表达水平的影响及其作用的分子机制。方法：以一定浓度的苦瓜蛋白处理K562细胞12～72小时，CCK-8检测其对细胞生长的影响；流式细胞术（AnnexinV）、细胞形态学（光镜及电镜）等方法检测细胞凋亡；同时应用流式细胞术检测Bcl-2及PCNA蛋白表达的变化。结果：苦瓜蛋白对K562细胞生长具有明显的抑制作用；流式细胞术及形态学观察（光镜及电镜）证实一定作用浓度的苦瓜蛋白可诱导K562细胞发生明显的细胞凋亡，且随着作用时间的延长细胞凋亡率逐渐升高。苦瓜蛋白处理组K562细胞中Bcl-2及PCNA蛋白的表达分别为0．33％和98．36％，对照组分别为74．03％和97．63％。结论：苦瓜蛋白对K562细胞生长具有明显抑制作用，其作用主要通过诱导K562细胞产生细胞凋亡．而不是抑制细胞增殖。苦瓜蛋白诱导K562细胞凋亡过程中，Bcl-2蛋白表达的下调对调控细胞凋亡有重要作用。     

幼牛血去蛋白提取物对人白血病细胞系K562的作用

目的研究人白血病K562细胞在幼牛血去蛋白提取物(deproteinized extract of calf blood,DECB)中的生长情况,探讨DECB对白血病细胞生长方面的意义。方法应用形态学、细胞生长曲线绘制、细胞总蛋白质含量测定、流式细胞术对阴性对照组,阳性对照组和不同浓度的DECB组白血病细胞分别进行检测和观察。结果在DECB的培养基中人白血病K562细胞发生一系列形态学改变。不同浓度的DECB组的细胞数量、生长速度、蛋白质含量和细胞增殖指数较阴性对照组相比都显著增加,其中(0.1～1%)DECB对K562细胞的增殖作用有时间和浓度依赖性,2%和5%DECB随着作用时间的延长,抑制K562细胞的增殖。与阳性对照组相比,不同浓度DECB组细胞数量、生长速度、蛋白质含量、细胞增殖指数均有所下降。在10%CS存在的条件下,加入1%DECB各项指标结果均无显著变化。结论DECB在一定浓度范围内有利于人白血病细胞系K562的生长与增殖。     

RNA-21为靶标的反义寡核苷酸对人白血病K562细胞的抑制作用

目的： 探讨以microRNA-21为靶标的反义寡核苷酸对白血病K562细胞的生长抑制效应及可能的作用机制。方法：依据与microRNA-21序列互补的原理,设计反义寡核苷酸,人工合成并全硫代修饰,在LipofectamineTM 2000介导下,转染K562细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选最佳作用浓度,台盼蓝拒染法检测其对细胞生长抑制的作用,姬姆萨染色观察细胞的形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期的变化。利用荧光定量PCR技术检测反义寡核苷酸作用后细胞内microRNA-21表达水平的改变。结果：MTT结果显示反义寡核苷酸有效抑制细胞生长,分别与随机组、空白对照组进行比较有显著差异（P<0.05）,反义寡核苷酸作用的最佳浓度是0.6 μmol/L。台盼蓝拒染法结果显示从转染K562细胞24 h开始,反义寡核苷酸组细胞生长明显受到抑制,抑制效应持续到72 h。姬姆萨染色显示反义寡核苷酸作用K562细胞24 h后,可在细胞中见凋亡小体。流式细胞仪检测结果显示反义寡核苷酸组出现明显的亚二倍体峰,细胞周期无发生明显变化。荧光定量PCR结果显示,反义寡核苷酸可有效抑制细胞内microRNA-21的表达水平。结论：以microRNA-21为靶标的反义寡核苷酸可有效抑制人白血病K562细胞的生长,并显著促进细胞凋亡。     

低浓度丰加霉素对人白血病K562细胞集落形成抑制作用的机制研究

目的 初步探讨低浓度丰加霉素对人白血病K562细胞集落形成抑制作用的机制.方法 甲基纤维素集落形成实验检测低浓度丰加霉素对人白血病K562细胞集落形成能力的影响;CCK-8法检测低浓度丰加霉素对K562细胞的生长抑制率;AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测低浓度丰加霉素作用下的K562细胞凋亡率;PI 单染流式细胞仪检测药物作用后细胞的周期分布改变;Western免疫印迹和实时定量PCR检测周期相关分子表达水平变化.结果 低浓度丰加霉素对人白血病K562细胞具有较强的集落形成抑制作用;可明显抑制K562细胞的生长,呈时间-剂量依赖性;尽管短时间(48 h)的药物处理仅出现轻度的细胞凋亡和周期阻滞,但10 nmol/L和30 nmol/L的丰加霉素长时间(7 d)作用后,K562细胞G0/G1期比例分别是(62.3±1.7)%和(76.9±0.7)%,与对照组(38.9±1.1)%相比差异具有高度统计学意义(P＜0.01);低浓度丰加霉素长时间作用后诱导K562细胞周期相关分子P16蛋白水平和转录水平的高表达.结论 丰加霉素在低浓度,长时间作用于人白血病K562细胞后,具有较强的集落形成抑制和生长抑制作用,此作用可能与诱导细胞周期相关分子p16高表达,导致细胞G0/G1期阻滞有关.     

西达本胺增加慢性髓系白血病耐药株K562/ADM细胞对柔红霉素的敏感性

目的 观察西达本胺（CDM）能否影响人慢性髓系白血病耐药株K562/ADM细胞对柔红霉素（DNR）的敏感性,并探讨其可能的分子机制。方法 体外常规培养K562细胞和K562/ADM细胞,给予不同剂量CDM和（或）DNR处理48 h后,采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测CDM与DNR对K562和K562/ADM细胞的毒性作用,采用Chou-Talalay中效分析法对两药的联合效应进行评价,采用流式细胞术检测细胞增殖、细胞周期和凋亡,采用Western blotting方法检测组蛋白2AX（H2AX）、γH2AX（Ser139）、共济失调毛细血管扩张征突变基因（ATM）、p-ATM（Ser1981）、乳腺癌易感蛋白l（BRCA1）和p-BRCA1（Ser1524）的蛋白表达水平。 结果 DNR可剂量依赖性地抑制K562/ADM细胞活力（P<0.05）,半数抑制浓度（IC50）为11.76 μmol/L,耐药倍数为18.09;CDM可协同增强DNR对K562/ADM细胞的抑制作用置信区间（CI）（CI<1）,反转倍数为8.11;与对照组相比,DNR组细胞增殖率显著降低（P<0.05）,G2/M期细胞比例和凋亡率明显升高（P<0.05）,而无毒剂量的CDM可协同增强DNR引起的细胞增殖抑制、G2/M期阻滞和细胞凋亡（P<0.05）;耐药株K562/ADM细胞中ATM和BRCA1蛋白表达水平显著高于其亲代K562细胞（P<0.05）;DNR可上调K562/ADM细胞中H2AX、ATM和BRCA1蛋白的磷酸化水平（P<0.05）;CDM与DNR联用可使γH2AX蛋白水平进一步升高,但p-ATM和p BRCA1蛋白水平的变化则相反（P<0.05）。 结论 CMD可反转K562/ADM细胞对DNR的耐药性,这可能与上调H2AX蛋白的磷酸化水平以及下调ATM和BRCA1蛋白的磷酸化水平有关。     

血管内皮生长因子基因反义核酸体外抑制K562细胞生长及机理研究

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸抑制K562细胞生长的机理;以及反义药物的量效和时效关系,揭示VEGF基因新的功能。方法:用反义核酸X7,20-mer,全硫代修饰;以脂质体介导进行转染,细胞培养72h,用MTT法计算细胞生长抑制率,采用台盼蓝拒染法每24h观察细胞存活情况并计数,用Giemsa染色观测细胞形态学改变,用流式细胞仪检测细胞凋亡百分数。结果:反义药物对K562细胞生长有明显抑制作用,呈剂量依赖关系,并且下调VEGF蛋白的表达,反义药物对K562细胞的凋亡无影响。结论:VEGF反义药物抑制K562细胞生长的机理是抑制细胞增殖,而不是促进细胞凋亡,内源性VEGF蛋白具有促进K562细胞增殖的功能。     

活细胞计数试剂盒在检测5-氮杂-2’-脱氧胞苷对慢性粒细胞白血病细胞的增殖抑制作用中的应用

目的探讨活细胞计数试剂盒(CCK-8)在检测5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-dc)对慢性粒细胞白血病细胞的增殖抑制作用中的应用。方法采用CCK-8检测不同浓度5-Aza-2’-dc对K562细胞的增殖抑制作用,并检测其半数抑制浓度对K562细胞的细胞周期和凋亡的影响。结果 5-Aza-2’-dc的半数抑制浓度为15.55nmol/L,采用该浓度处理K562细胞后,G2期发生阻滞,增殖抑制,并出现凋亡峰。结论不同浓度的5-Aza-2’-dc对K562细胞增殖的抑制作用不同,且呈浓度依赖关系。CCK-8检测法可运用于甲基化转移酶抑制剂对人慢性粒细胞白血病细胞增殖的影响。     

中药露蜂房蛋白对人红白血病K562细胞增殖的影响

目的研究中药露蜂房蛋白（NVP）抗白血病的作用,为中药露蜂房治疗白血病和开发新的抗白血病药物提供实验和理论依据。方法采用细胞培养和透射电子显微镜技术,观察NVP对人红白血病细胞（K562细胞）的生长抑制作用和形态结构的影响;运用免疫组织化学方法和图像分析系统,研究NVP对K562细胞凋亡相关信号转导蛋白NF-k Bp65、β-catenin及iNOS表达的影响。结果1．NVP处理组K562细胞生长饱和密度降低,表示细胞增殖减弱。2．透射电镜下发现,NVP处理组K562细胞呈典型的凋亡形态学改变。3．免疫组织化学和图像分析系统测定光密度值（A值）显示,NVP处理组K562细胞中NF—k Bp65、β-catenin细胞核内转导减少,iNOS表达减弱。结论NVP有明显抑制K562细胞增殖的作用,其作用机制可能通过调节凋亡相关信号传导因子NF—k Bp65、β-catenin及iNOS的表达,从而诱导白血病细胞凋亡。     

HLA-G3蛋白能够抑制多克隆NK细胞的杀伤功能

目的 研究HLA－G3蛋白对NK细胞杀伤功能的抑制作用。方法 用RT－PCR方法扩增HLA－G3和HLA－G1的cDNA，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中，采用脂质体转染法将其转入K562细胞，用免疫荧光法确定其在细胞表面表达，细胞毒试验研究其对NK细胞杀伤功能的抑制作用。结果 HLA－G3蛋白和HLA－G1表达在细胞表面，以PBL细胞为效应细胞的细胞毒实验表明K562－G1细胞和K562－G3细胞的细胞裂解率都比K562细胞裂解率低。结论 HLA－G3蛋白能够抑制多克隆NK细胞的杀伤功能。     

三氧化二砷对K562细胞端粒酶活性及P53蛋白表达水平的调节

目的：研究三氧化二砷(As2O3)诱导急性白血病K562细胞的凋亡机制。方法：以不同浓度的As2O3作用于体外培养的K562细胞，检测细胞生长抑制率，观察细胞凋亡时的形态学变化，对细胞端粒酶活性及P53蛋白的表达水平进行检测。结果：As2O3可显著地降低K562细胞端粒酶活性，升高P53蛋白的表达水平，抑制细胞的生长，诱导细胞发生凋亡。并呈现出明显的量-效与时-效关系。结论：As2O3能抑制K562细胞的生长并诱导细胞发生凋亡，降低细胞端粒酶活性及升高P53蛋白的表达水平是其重要作用机制之一。     

盐霉素抑制耐格列卫的人慢性粒细胞白血病细胞株K562/Glv增殖并诱导其凋亡

目的: 探讨盐霉素对耐格列卫的人慢性粒细胞白血病细胞株K562/Glv抑制增殖和诱导凋亡的作用及其机制。方法: 采用CCK-8的方法检测盐霉素对K562/Glv细胞生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡、活性氧、细胞内Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_i)和线粒体膜电位(ΔΨ_m);比色法检测caspase-3、-8和-9活性;Western blotting 分析细胞色素C、Bcl-2、Bax、β-catenin和磷酸化低密度脂蛋白受体相关蛋白6(p-LRP6)蛋白水平。结果: 盐霉素对K562/Glv细胞生长具有剂量依赖性抑制作用,0.2 μmol/L时细胞增殖抑制率为(36.70±2.31)%,细胞凋亡率为(19.66±2.43)%;0.2 μmol/L盐霉素作用于K562/Glv细胞,ΔΨ_m显著下降,24 h时下降至对照组的(19.8±2.4)%,细胞内活性氧和[Ca²⁺]_i在短期显著升高。Caspase-3、-8和-9活性均显著增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。Bcl-2 的表达下调,Bax 的表达明显增加,Bcl-2/Bax 比值显著降低。同时,盐霉素也减少K562/Glv细胞内β-catenin和p-LRP6蛋白水平。结论: 盐霉素不仅通过Bcl-2/Bax途径和线粒体凋亡途径诱导耐格列卫人慢性粒细胞白血病细胞K562/Glv的凋亡,而且通过抑制Wnt信号途径抑制K562/Glv细胞增殖。     

索拉非尼联合柔红霉素对白血病K562细胞的抑制作用

目的:探讨小分子Raf激酶抑制剂索拉非尼(sorafenib)联合柔红霉素(DNR)对白血病细胞K562及U937的抑制作用及可能的分子机制。方法:MTT法测定索拉非尼和柔红霉素单独作用于K562和U937细胞的抑制率及DNR IC10联合不同浓度索拉非尼作用于K562及U937的联合抑制率;流式细胞AnnexinⅤ/PI法测定单药及联合用药后K562细胞的凋亡率以及Hoechst33258染色法观察单药及联合作用后细胞凋亡形态的改变;West-ern blotting法测定索拉非尼、DNR及U0126对K562及U937p-ERK1/2的影响;根据金氏方程证明2种药物联合抑制率及凋亡是否有协同作用。结果:MTT法测定索拉非尼联合DNR对K562及U937均有协同抑制作用(q1.15,P0.01);流式细胞AnnexinⅤ/PI和Hoechst33258染色法,均证明索拉非尼联合柔红霉素能联合诱导K562细胞凋亡(q1.15,P0.05),两者有明显的一致性;K562细胞的基础pERK1/2蛋白水平明显高于U937细胞(P0.01),索拉非尼和U0126都能够显著抑制K562细胞p-ERK1/2水平;U0126联合DNR存在协同抑制K562细胞的作用。结论:索拉非尼联合DNR作用于白血病细胞K562、U937存在协同抑制及凋亡诱导作用;DNR对U937的抑制作用明显高于K562;索拉非尼对K562的敏感性高于U937细胞;索拉非尼可能通过下调p-ERK1/2水平增加柔红霉素抗白血病细胞的效应。     

应用RNA干扰技术抑制K562细胞BCR-ABL基因表达及诱导细胞凋亡

目的运用RNAi技术,设计针对BCR-ABL基因融合位点的。iRNAs,研究其干扰后细胞变化。方法针对BCR-ABL基因的融合位点设计siRNAs,用脂质体法转染K562细胞,进行MTY法、RT-PCR及流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果转染组与对照组相比细胞增殖减少,BCR-ABL mRNA表达量降低,并有明显的细胞凋亡。结论运用RNAi技术,可以有效地抑制BCR-ABL的表达,诱导细胞凋亡,为白血病的分子机制研究和基因治疗奠定基础。     

慢病毒介导RNA干扰血管内皮生长因子基因增强K562细胞对STI571敏感性

目的： 探讨慢病毒载体介导RNA干扰（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响。 方法： 构建靶向VEGF基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,与慢病毒包装质粒通过脂质体转染至293T细胞,包装产生的病毒液感染K562细胞。采用实时荧光定量PCR、Western blotting、ELISA等方法检测RNAi对K562细胞VEGF mRNA和蛋白表达的影响;台盼蓝拒染法和MTT法分析转导VEGF-shRNA对K562细胞增殖的影响;流式细胞术检测经STI571(甲磺酸伊马替尼)作用后细胞凋亡变化情况。 结果： 构建VEGF基因shRNA慢病毒载体(pRNAT-shRNA),并成功将其导入K562细胞。与K562和K562-con（转导空载体）组细胞相比,转导pRNAT-shRNA的K562-shVEGF细胞VEGF mRNA和蛋白表达均显著下降;生长曲线提示K562-shVEGF细胞增殖速度减慢;在STI571作用下,K562-shVEGF细胞凋亡率较K562和K562 -con组细胞明显增高(P<0.05)。结论： 慢病毒载体介导的VEGF基因RNA干扰可有效抑制K562细胞增殖,并能够增强细胞对STI571的敏感性。     

NF-κB抑制剂PDTC抗白血病细胞增殖的实验研究

目的： 观察核转录因子NF-κB活性特异性抑制剂PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)对急性白血病细胞系K562细胞增殖的影响,并探讨其机制。方法: 利用Trans AMTM NF-κB/p65活性测定试剂盒,检测PDTC作用K562细胞12 h、24 h后NF-κB亚基p65活性的变化;采用WST-1细胞增殖试验观察不同浓度PDTC作用24 h、48 h、72 h对细胞增殖的影响;用单细胞凝胶电泳(彗星检测)方法检测PDTC对K562细胞DNA损伤的影响;利用免疫印迹法(Western blotting)检测PDTC对K562细胞中pro-caspase-3和活化型caspase-3蛋白表达的影响。结果: 与对照组相比,经PDTC处理的实验组K562细胞NF-κB/P65的活性受到明显抑制(P＜0.01);且PDTC能以时间和剂量依赖方式抑制K562细胞的增殖(P＜0.05);单细胞凝胶电泳显示实验组细胞DNA受损,浓度为25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/LPDTC处理后,实验组细胞DNA总损伤细胞百分率分别为43.50％、84.00％、95.63％,明显高于对照组(9.75％),P＜0.05,且存在明显的剂量依赖关系;Western blotting结果显示经PDTC处理后的K562细胞胞质中可检测到pro-caspase-3和活化型caspase-3蛋白的表达。结论: NF-κB参与白血病细胞的增殖与凋亡调控,PDTC抗肿瘤机制可能与抑制NF-κB活性,上调caspase-3表达,从而诱导细胞凋亡有关。     

稳定表达PRMT5蛋白的食管癌细胞株的建立及其对细胞增殖的影响

目的建立稳定表达蛋白质精氨酸甲基化转移酶5(Protein Arginine Methyltransferase,PRMT5)的食管癌细胞株,并探讨稳定细胞株对细胞增殖的影响。方法用脂质体介导的质粒或siRNA转染法,分别将真核表达载体pCMV和PRMT5以及siPRMT5导入人食管癌细胞株EC109,通过G418筛选导入目标质粒的阳性克隆,以有限稀释法连续克隆化,以Western blot法鉴定稳定株的PRMT5的表达;计数法绘制细胞生长曲线,计算倍增时间;用平板克隆法鉴定细胞的克隆形成能力,计算克隆形成率。结果有限稀释法连续克隆后,Western blot结果表明,EC109-9,EC109-46两株细胞高表达PRMT5,EC109-4、EC109-8细胞株低表达PRMT5;克隆形成实验结果表明,高表达株克隆形成能力显著增强,克隆形成率达到180%,低表达株降至40%。结论成功获得了稳定表达PRMT5蛋白的食管癌细胞株;稳定表达PRMT5细胞株显著影响食管癌细胞的增殖活力。     

氨基甾体H42649对K562白血病细胞的抑制增殖和诱导分化作用

目的观察氨基甾体H42649对人慢性粒细胞白血病K562细胞系的抑制增殖和诱导分化作用。方法采用液体培养实验,MTT实验,集落培养实验观察10-8～10-4mol/L浓度的H42649对K562细胞增殖能力的影响;采用Wright-Giemsa染色,联苯胺染色和流式细胞术评价10-6mol/L浓度的H42649对K562细胞的诱导分化作用。结果不同浓度的H42649连续作用K562细胞1～5 d后,细胞计数和集落计数明显减少;第5 d处理组的MTT值显著低于对照组,并呈剂量依赖关系;10-6mol/L浓度的H42649对K562细胞作用5d后,联苯胺染色A值升高(P<0.01),形态学观察其趋向成熟分化,流式细胞术检测药物处理4 d后K562细胞膜上CD71表面标记表达阳性率为84%。结论氨基甾体H42649能显著抑制K562细胞的增殖并诱导其向红系分化,提示该药可作为一种新型慢粒白血病细胞的诱导分化剂。