去细胞周围神经移植物的制备及生物相容性评测

目的：制备去细胞周围神经移植物并评测其生物相容性。 方法：实验于2005-05／12在解放军第四军医大学口腔医学院组织病理教研室和组织工程实验中心完成。①将猪肋间神经经低渗、-80℃反复冻融和NaOH裂解等方法制备去细胞神经异体移植物；光、电镜观察其结构特征。②材料细胞毒性试验按照GB／T16886．5-2003《医疗器械生物学评价》体外细胞毒性试验的试验方法进行，毒性程度的评估标准参见美国药典。③大鼠皮下植入试验，取成年SD大鼠9只，于脊柱中线两侧约2cm处平行各取2点作为皮下植入点，植入1cm去细胞异体神经移植物。于手术后第1，2，4周时各取1只大鼠麻醉状态下处死，作组织切片检查。 结果：去细胞神经异体移植物的制备：①应用正常猪的周围神经，清除许旺细胞、神经外膜和束膜细胞以及神经纤维的髓鞘和轴突，保存由许旺细胞基底膜管以及神经外膜和束膜的细胞外基质构成的三维支架结构。②生物相容性测试结果：显示去细胞神经异体移植物细胞毒性试验为1级。③SD大鼠皮下植入试验结果：去细胞神经异体移植物无明显的免疫排斥反应。 结论：该方法所制备的去细胞神经移植物神经膜管结构保存完好，有良好的组织相容性，可能成为自体神经移植的替代材料。     

未经预处理同种活性生物脱细胞支架的免疫原性及支架张力

背景：提高生物材料组织相容性的主要办法目前主要采用预处理,但是诸多预处理方法都有缺点,如经预处理后生物组织材料常发生钙化、细胞毒性反应、抗张力强度降低等。目的：观察未经预处理的生物支架材料的免疫原性、支架张力、细胞生长因子对支架的影响,以及此条件下制备同种活性生物脱细胞支架的方法。设计：组织形态学层面的对比观察实验。时间及地点：实验于2006-06/2007-03在南通大学附属医院普通外科完成。材料：SPF级成年Wistar大鼠。十二烷基硫酸钠为美国BiotechGrade产品;碱性成纤维细胞生长因子,血管内皮生长因子为英国Peprotech Company产品;测力计为苏州电器元件一厂产品。方法：选取新鲜大鼠下腔静脉作为实验材料,用含十二烷基硫酸钠的Tris低渗缓冲液,以改进的Booth法脱去静脉壁的上皮细胞,固定剂固定后,分别行HE染色、胶原纤维染色的光镜和扫描电镜观察、摄片,并用测力计测量支架在脱细胞前后张力的改变。将支架材料进行同种异体间动物皮下埋置,观察脱细胞支架埋置局部有无红肿等免疫排斥反应。把脱细胞支架结合血管内皮生长因子和/或碱性成纤维细胞生长因子移植于同种大鼠皮下,2周后采用免疫组化法观察支架内血管的长入情况,使用测力计测量支架在埋置前后张力的改变。主要观察指标：支架经脱细胞处理和移植入大鼠皮下前后张力的改变。支架内新生血管长入情况。皮下植入的支架局部排斥反应。结果：用质量浓度为0.03%十二烷基硫酸钠的Tris低渗缓冲液与静脉壁共同孵育48h后,HE染色、胶原纤维染色的光镜和扫描电镜显示：静脉壁完全脱去了表面的上皮细胞,又较完整地保留了胶原纤维等细胞外基质主要成分：其形态学结构及支架张力在脱细胞前后差异无显著性意义（P〉0.05）。在支架植入部位无明显免疫排斥反应,局部切口愈合良好。支架植入2周后,血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子能在短期内促进新的血管长入支架内,碱性成纤维细胞生长因子＋血管内皮生长因子联合应用后新生血管长入最显著。移植前后支架的张力差异无显著性意义（P〉0.05）。结论：未经预处理,用含质量浓度为0.03%十二烷基硫酸钠的低渗Tris缓冲液对制备的脱细胞支架在同种异体动物皮下埋置无排斥反应,支架强度无明显变化。碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子可促进新生血管在支架内的生长,并具有协同作用。     

脱细胞软骨生物支架材料与大鼠骨髓间充质干细胞共培养及体内埋植后的降解

背景：动物体内埋植实验被认为是最常用有效的检测生物相容性的方法。目的：拟观察脱细胞软骨生物支架材料与细胞共培养及体内埋植实验时的生物降解性。时间及地点：观察性实验,于2007-06/08在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。材料：SD大鼠,体质量60-80g;6月龄猪由山西畜牧研究所提供。方法：①分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取猪膝关节软骨制备脱细胞关节软骨支架材料,将两者进行复合培养。未经与无细胞胶原基质联合培养的细胞作为正常对照。②将备好的生物支架材料植入大鼠背部皮下,于14,28d取材,对其进行大体及组织染色。主要观察指标：①对复合细胞的无细胞胶原基质进行石蜡切片常规染色,倒置显微镜下观察24,72h细胞与无细胞胶原基质共培养情况。②通过炎性细胞反应及纤维囊形成级别评定标准、材料降解结果评定合格标准分析植入材料在动物体内降解情况。结果：①倒置显微镜下观察与无细胞胶原基质共培养24h细胞多呈长梭形和多角形;72h后与无细胞胶原基质联合培养和未与无细胞胶原基质联合培养的2种细胞形态相似,均呈多角形和圆锥形。苏木精-伊红染色可见细胞嵌入软骨支架材料中,呈圆形和椭圆形,部分细胞可见细胞核,材料呈颗粒状,染色均一。②组织学观察可见试样周围存在少量淋巴细胞和嗜中性粒细胞,致密纤维囊壁将复合细胞的材料包裹,材料被降解为细小颗粒,细胞均匀散在材料中呈椭圆形,可见分裂相。结论：支架材料在与细胞共培养及体内埋植实验中均生长正常,经过4周材料顺利降解为细小颗粒。     

脱细胞膀胱黏膜下层支架材料的生物学评价

背景:脱细胞膀胱黏膜下层是一种天然的细胞外基质生物材料,主要由Ⅰ、Ⅲ型纤维胶原蛋白构成,是一种理想的生物支架材料.目的:脱细胞猪膀胱组织作为组织工程支架材料的生物学评价.方法:取适量健康猪膀胱置于PBS和叠氮钠的混合溶液,浸泡过夜,刮去膀胱黏膜层.用低渗、-80℃反复冻融、DNase和RNase混合液消化和NaOH裂解连续方法制备脱细胞膀胱黏膜下层.通过观察其组织学结构特征、DNA残留、细胞毒性、细胞黏附效果及皮下炎症反应等来综合评价脱细胞膀胱黏膜下层的生物相容性.结果与结论:正常猪的膀胱经改进的脱细胞方法处理后,绝大部分细胞组分被去处,细胞外基质结构保持完好.细胞毒性试验结果显示脱细胞膀胱黏膜下层细胞毒性为1级,DNA提取结果中未见有DNA残留,细胞黏附结果显示猪平滑肌细胞能在脱细胞支架上较好的贴附生长,SD大鼠皮下植入试验显示无明显的炎症反应.结果证实所制备的脱细胞膀胱黏膜下层结构保存完好,有良好的组织相容性,可能成为组织工程修复的替代材料.     

三种组织工程鼓膜支架材料的生物相容性

背景：自体组织修复鼓膜穿孔存在增加手术创伤、取材有限等缺点，构建组织工程鼓膜是鼓膜穿孔治疗的发展方向。目的：构建3种不同材料的组织工程鼓膜支架材料，并评价其生物相容性。设计、时间及地点：随机对照动物实验，细胞学体内观察。于2004-08／2005-02在解放军第四军医大学组织工程中心完成。材料：将健康小猪的硬脑膜、真皮及人羊膜进行脱细胞处理。方法：将预先培养的豚鼠鼓膜成纤维细胞种植于3种材料表面，观察成纤维细胞的生长状态；18只豚鼠随机分为3组，于右侧背皮下分别埋植制备的脱细胞硬脑膜、真皮及人羊膜。主要观察指标：3种脱细胞生物支架材料的显微结构及组织相容性。结果：3种脱细胞材料均为网状结构，无任何细胞及细胞残核存在：豚鼠鼓膜成纤维细胞能够很好地贴附于3种脱细胞材料生长，无细胞毒性：将3种组织材料分别埋植于豚鼠皮下后，无埋植材料排出现象，1周时植入材料周围有较明显炎症反应，其中以脱细胞真皮周围组织反应较轻，4周时炎症反应消失。结论：通过脱细胞方法可以成功建立具有良好生物相容性的组织工程鼓膜支架材料：3种材料中以脱细胞猪真皮的生物相容性最佳。     

脱细胞枪乌贼神经的制备及其生物相容性

背景：脱细胞哺乳动物神经有有髓纤维直径小、细胞成分不易彻底清除、复合细胞不均匀的缺点。目的：制备脱细胞枪乌贼神经,并探讨其生物相容性。方法：用Hasse化学萃取法制备脱细胞枪乌贼神经,观察其脱细胞的效果、管道及基底膜的完整性,用MTT法检测脱细胞枪乌贼神经与细胞相容性,用皮下植入实验检测其组织相容性。结果与结论：制备的脱细胞枪乌贼神经细胞及髓鞘清除彻底、神经纤维膜管及基底膜保留完整,且膜管粗大。脱细胞枪乌贼神经皮下植入植入后1和2周材料周围有炎症细胞浸润。植入后4周材料周围有薄层纤维结缔组织囊,材料内部及周围只有少量炎症细胞。结果证实,采用Hasse化学萃取法制备的脱细胞枪乌贼神经,细胞清除彻底,神经纤维膜管及基底膜保留完整,与异种细胞及组织相容性良好。     

脱细胞血管基质制备及体内外生物相容性

背景:利用脱细胞血管基质作为血管支架具有以下优点:脱细胞血管基质保留了自然血管的复杂三维结构;脱细胞基质表面的生长因子和结构域有利于细胞的黏附和浸润.目的:制备脱细胞血管基质并对其体内外生物相容性进行评价.方法:采用胰蛋白酶、Triton X-100逐步处理猪颈动脉制备脱细胞血管基质.采用皮下植入实验、急性毒性实验和体外细胞毒性实验等评价其生物相容性.结果与结论:脱细胞基质材料具有良好的化学稳定性,未释放对红细胞产生破坏溶解作用的有害元素,未引起急性溶血反应,对细胞的生长无毒性影响.脱细胞基质材料在动物体内植入后早期有较多炎性细胞浸润,到实验观察的后期无明显炎性细脆浸润,脱细胞基质内可见成纤维细胞.另外,脱细胞基质材料对周边组织未产生毒性作用,伤口Ⅰ期愈合.同时组织学切片显示:支架材料与周边组织相容性好,未产生排斥反应.说明脱细胞基质材料在动物体内具有很好的生物相容性.     

去细胞周围神经移植物的制备及生物相容性评测

目的:制备去细胞周围神经移植物并评测其生物相容性。方法:实验于2005-05/12在解放军第四军医大学口腔医学院组织病理教研室和组织工程实验中心完成。①将猪肋间神经经低渗、-80℃反复冻融和NaOH裂解等方法制备去细胞神经异体移植物;光、电镜观察其结构特征。②材料细胞毒性试验按照GB/T16886.5-2003《医疗器械生物学评价》体外细胞毒性试验的试验方法进行,毒性程度的评估标准参见美国药典。③大鼠皮下植入试验,取成年SD大鼠9只,于脊柱中线两侧约2cm处平行各取2点作为皮下植入点,植入1cm去细胞异体神经移植物。于手术后第1,2,4周时各取1只大鼠麻醉状态下处死,作组织切片检查。结果:去细胞神经异体移植物的制备:①应用正常猪的周围神经,清除许旺细胞、神经外膜和束膜细胞以及神经纤维的髓鞘和轴突,保存由许旺细胞基底膜管以及神经外膜和束膜的细胞外基质构成的三维支架结构。②生物相容性测试结果:显示去细胞神经异体移植物细胞毒性试验为1级。③SD大鼠皮下植入试验结果:去细胞神经异体移植物无明显的免疫排斥反应。结论:该方法所制备的去细胞神经移植物神经膜管结构保存完好,有良好的组织相容性,可能成为自体神经移植的替代材料。     

内皮祖细胞在膀胱细胞外基质上的生长及分化

背景：传统的组织工程膀胱支架材料本身无血管结构,植入体内后面临血管化不足的问题。目的：观察内皮祖细胞与膀胱细胞外基质的生物相容性。方法：分离培养兔内皮祖细胞,种植于兔膀胱细胞外基质上与其复合培养。将复合生长材料植入兔背部皮下检测其组织相容性。结果与结论：兔内皮祖细胞能够在膀胱细胞外基质表面正常黏附、生长、增殖,细胞形态良好。内皮祖细胞-膀胱细胞外基质植入兔体内后1周时,可见材料周围炎症反应明显,粘连严重,出血较多;苏木精-伊红染色可见组织中较多炎性细胞浸润,胶原及弹性纤维排列松散。植入后8周时可见材料已降解成碎细丝状,与周围组织融合生长在一起,但质地略脆,易出血;苏木精-伊红染色可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应,胶原及弹性纤维排列紧密并且有新生血管长入其中。结果表明内皮祖细胞与膀胱细胞外基质具有良好的相容性,复合培养物与体内组织具有良好的相容性。     

组织工程尿道在裸鼠皮下的埋置

背景：由于创伤、先天畸形、肿瘤或手术继发的尿道缺损、狭窄、憩室等病理状况下，需要采用自体组织修复其缺损。目的：验证构建组织工程化尿道的可行性。设计、时间及地点：观察性实验，于2005—01／2006-01在中山大学林百欣医学研究中心完成。材料：雄性新西兰兔10只，体质量3．0～3．5k，用于制备脱细胞尿道；4～6周龄BALB／cA—nude裸鼠20只，体质量18～20g，与细胞外基质材料复合体进行体内培育。方法：取新西兰兔完整尿道，脱细胞后形成细胞外基质材料，切取成体新西兰兔阴茎头约1／2大小，组织块法培养扩增兔平滑肌细胞：之后将尿道海绵体平滑肌细胞种植到脱细胞尿道基质上，将其植入裸鼠背部皮下进行培育。实验分为2组，实验组埋置细胞材料复合体，对照组埋置未接种细胞的单纯脱细胞尿道基质。主要观察指标：植入后1，2，4，6，8周取材，行大体和组织学及电镜观察细胞材料复合体的生长情况，免疫组织化学鉴定平滑肌细胞的表达。结果：①大体观察裸鼠背部切口愈合良好，饮食活动正常。植入后1，2周实验组脱细胞基质表面已有少量的组织膜形成；4周组织膜逐渐增厚，有小血管长入；6，8周脱细胞基质材料逐渐被新的细胞替代。②苏木精一伊红染色可见，随着时间延长，脱细胞材料逐渐被吸收，被各种细胞代替。其中平滑肌细胞最多，并可见大小不等的血管长入基质，部分有形成血窦的倾向；提示复合材料在裸鼠体内逐渐形成类似正常尿道的组织结构。③电镜观察从第4周有血管长入基质，可见较多的平滑肌细胞和内皮细胞及少量的成纤维细胞和巨噬细胞，并有部分平滑肌细胞凋亡。④α-平滑肌肌动蛋白抗体进行免疫组织化学染色后可见有平滑肌细胞生长。 结论：采用组织工程技术可再造出类似于正常尿道的海绵体组织。     

腺体组织损伤后体外分离下颌下腺干/祖细胞后的克隆化培养

背景:体外构建组织工程化人工涎腺需获得分化增殖良好、数量充足的种子细胞,但正常下颌下腺中很难分离出成体干细胞.目的:利用腺体组织损伤动物模型体外分离下颌下腺干/祖细胞,并进行克隆化培养.设计、时间和地点:细胞学体外观察,于2006-03/2007-01在遵义医学院贵州省细胞工程实验室完成.材料:8周龄雄性SD大鼠10只,由解放军第三军医大学动物中心提供.方法:10只大鼠采用结扎下颌下腺主导管、抑制腺体分泌来建立组织损伤模型,1周后切取腺体组织,酶消化法体外分离下颌下腺干,祖细胞,原代培养10-14 d后,挑取培养皿中形成的小的类圆形、类上皮细胞集落予以纯化,传代后进行单克隆培养.主要观察指标:下颌下腺干,祖细胞免疫细胞化学染色及免疫荧光染色结果,通过绘制生长曲线分析下颌下腺干,祖细胞体外增殖能力.结果:实验获得表达层粘蛋白的细胞具有干细胞特征,CD29呈阳性表达表明其具有高黏附、高增殖等组织干细胞特性,角蛋白19的阳性表达提示下颌下腺干,祖细胞呈上皮源性.其生长曲线近似"S"形,体外培养增殖活跃.结论:实验结果显示,下颌下腺干,祖细胞具有组织干细胞的特征,有望成为组织工程化人工涎腺构建的一类种子细胞来源.     

无细胞神经支架复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复坐骨神经缺损

背景:作者已经成功制备了无细胞神经移植物,并且复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损。目的:无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经修复大鼠坐骨神经缺损后运动功能的恢复。方法:成年雄性SD大鼠构建大鼠坐骨神经15mm缺损模型,分别应用组织工程人工神经、组织工程神经支架或自行神经桥接坐骨神经缺损。桥接后20周再生神经电生理学测定,手术侧胫骨前肌湿质量、腓肠肌组织学及透视电镜分析。结果与结论:桥接20周后,组织工程人工神经与自体神经移植组胫骨前肌湿质量比较,差异无显著性意义(P>0.05),神经干传导速度为(30.56±2.15)m/s。结果提示,无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建的组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损后,可以促进再生神经运动功能的恢复。     

脱细胞骨软骨支架的制备及形态学观察

目的：探讨脱细胞骨软骨支架制备的可行性，为关节软骨组织工程提供新的支架材料。方法：3月龄雄性新西兰大白兔，取膝关节髌股关节面的股骨侧，切取4mm×4mm×3mm大小（长×宽X深）骨软骨块，用去垢剂-酶法对骨软骨组织块进行脱细胞脱钙处理，冻干机冻干，制备脱细胞骨软骨支架，并对其进行形态学观察。结果：脱细胞骨软骨支架呈半透明状，弹性良好，组织学评价提示细胞成分已完全祛去，保留了纤维支架。结论：去垢剂-酶法可以祛去骨软骨块中的细胞成分，成为带有空隙的支架材料。[著者文摘]     

Antioxidant parameters and lipid peroxidation in salivary glands of streptozotocin-induced diabetic rats

BACKGROUND: There is evidence suggesting an unbalance between oxidant and antioxidant status associated with diabetes. Considering that salivary function is essential for the maintenance of oral and systemic health, this study was designed to examine the levels of reduced and oxidized glutathione and the activities of the antioxidant enzymes, such as superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase, in salivary gland of streptozotocin-induced diabetic rats. METHODS: The content of malondialdehyde was determined in the blood and in the salivary glands. The antioxidant status was investigated in the submandibular and parotid salivary glands. RESULTS: Diabetic rats showed an increase in the content of malonaldehyde in the blood and in the submandibular salivary gland, but not in the parotid gland. Both forms, reduced and oxidized glutathione content present higher values in the diabetic submandibular gland compared with controls. No difference in the activity of superoxide dismutase between the diabetic and control glands was observed in either gland. Catalase showed higher specific activity in the parotid gland of the diabetic rats than control; however, in the submandibular gland, only when expressed as unit per gland was it higher than control. The specific activity of glutathione peroxidase was higher in the diabetic parotid gland than control; however, in the submandibular gland, its activity per gland was lower than controls. CONCLUSION: The streptozotocin-induced diabetes in rats caused different results comparing the submandibular and parotid salivary glands.     

改建脱细胞真皮基质作为软骨细胞移植载体修复兔软骨缺损

背景:脱细胞真皮(Acellular Dermal Matrix,ADM)具有良好的柔韧性、易丁修剪,制成微粉状皮内或皮下注射后,可见到成纤维细胞的移入及胶原的沉积,目前己被广泛应用于整形修复临床实践.目的:验证脱细胞真皮经改建后作为软骨细胞移植载体的可行性.设计、时间及地点:对比观察,于2003-08/2007-02在北京大学医学部和北京积水潭医院完成.材料:新生小牛的真皮层由北京元亨圣马生物研究所提供;体质量250 g的SD健康成年大白鼠24只,雌雄不限.3月龄的新西兰大白兔36只.方法:①取新生小牛背部真皮组织,进行脱细胞处理,分别用戊二醛和水溶性交联剂进行交联;再用生长因子对其进行纤维表面修饰.②取SD大白鼠,于大鼠脊柱两侧各设计3个长方形皮瓣,分别植入两组交联后的脱细胞真皮基质.术后2,6,12周取出植入物.③取新西兰大白兔,分为实验组和对照组,从其左侧关节面取原代软骨,分离软骨细胞并接种于复合后的ADM上进行培养.将实验组兔右侧后肢造成软骨缺损,植入含有自体软骨细胞的ADM,再将生物胶滴加于载体表面;对照组兔右侧后肢造成软骨缺损后分层缝合伤口.分别于第4,12,24周取材,对照组每次取2只,实验组每次取5只.主要观察指标:①交联效果的比较.②兔软骨缺损修复结果.结果:①经戊二醛交联后的ADM植入大鼠皮下后有强烈的炎症反应,并有组织出血坏死:而经水溶性交联剂交联的ADM的组织相容性较好.②在植入接种有自体软骨细胞的ADM24周后大白兔股关节的软骨缺损修复完好,附和的细胞能够存活且有增殖,ADM本身基本降解.结论:经脱细胞及纤维改建和交联及生长因子修饰的ADM孔隙均匀,组织相容性好,适于细胞黏附及长期生长.ADM胶原支架在兔体内可基本降解,未见排异反应,移植24周后见骨缺损修复.     

兔骨髓间充质干细胞及聚羟基乙酸支架材料构建人工软骨的可行性

背景:选择适合的生物支架与骨髓间充质干细胞作为新型的种子细胞复合能否构建出理想的组织工程化软骨?目的:观察将扩增的兔骨髓间充质干细胞接种于聚羟基乙酸构建人工软骨的可行性。设计:单一样本观察。单位:泸州医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科。材料:实验于2004-10/2005-10在泸州医学院完成。选用8只日本大耳兔,雌雄不拘,清洁级,二三个月龄,体质量1.5～2.0kg,常温常湿环境饲养。聚羟基乙酸由美国Albany公司生产。方法:分离、获取、扩增实验兔骨髓间充质干细胞,将聚羟基乙酸剪成1cm×1cm×1cm大小,并以多聚赖氨酸包被,通过将扩增的骨髓间充质干细胞接种于聚羟基乙酸上,按4mL/cm3多点播散的方式均匀地接种在预湿的聚羟基乙酸支架上,体外诱导培养3周,作为实验组。将不加入骨髓间充质干细胞的聚羟基乙酸支架作为对照组。将实验组和对照组的标本分别植入4只自体兔腹腔内,进行体内培养6～12周后,分别取出实验组与对照组的标本,对其进行大体观察。同时以100g/L中性甲醛固定,行5μm切片,采用苏木精-伊红染色观察标本的组织形态学特点,进行阿新蓝染色以观察酸性粘多糖形成,进行甲苯胺蓝染色以观察异染性基质的形成,进行免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白的表达。主要观察指标:两组支架植入实验兔体内后6,12周时标本大体观察结果、不同染色观察结果及Ⅱ型胶原蛋白的表达。结果:纳入8只实验兔均进入结果分析。①支架植入实验兔体内后6及12周标本大体观察结果:支架植入兔腹腔6周后,实验组标本均仍被腹腔大网膜包裹,剥去大网膜后,有3个标本成淡黄色,光滑,质地中,外形与植入前基本一致,1个标本呈灰黑色,质地很软,标本不能成形。12周后,实验组标本的外形仍与植入前基本一致,呈灰白色,光滑,但质地明显较硬。而第6,12周的对照组的标本大部分均被吸收,以第12周的标本更明显,且均未见软骨样组织形成。②支架植入实验兔体内后6及12周不同染色观察结果及Ⅱ型胶原蛋白的表达:苏木精-伊红染色结果显示:6周时,有软骨陷窝样结构开始形成,聚羟基乙酸支架开始降解;12周时,复合物呈现软骨组织样的形态,有较明显的软骨陷窝样结构形成,细胞排列规则,成群存在于软骨陷窝样结构内,边缘的细胞小,中央的细胞大,聚羟基乙酸基本完全消失。阿新蓝染色结果:6周时,组织内有部分区域被染成淡蓝色;12周时组织的基质被广泛染成蓝紫色,说明有大量的酸性粘多糖形成。苯胺蓝染色结果:6周时,组织内可见蓝色异染性基质;12周时组织内呈现很强的蓝色异染。免疫组织化学染色结果:6周时,胞浆内可见棕黄色阳性颗粒,基质内有少量的Ⅱ型胶原蛋白表达;12周时,胞浆、基质内均有较强的阳性表达。Ⅱ型胶原蛋白的表达:6周时,胞浆内可见深棕黄色阳性颗粒,基质内有少量的Ⅱ型胶原mRNA表达;12周时,胞浆、基质内均有强的阳性表达。对照组标本基本上已被吸收,没有成形的组织工程化标本。结论:兔骨髓间充质干细胞在诱导剂作用下,经体外和体内培养后,可生成组织工程化类软骨。     

无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞修复大鼠坐骨神经缺损

背景:作者前期试验已成功制备了天然可生物降解的无细胞神经移植物并证明其可促进周围神经再生.目的:无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞构建组织工程人工神经并观察其修复大鼠坐骨神经缺损促进运动功能恢复的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-06/2009-02在辽宁医学院附属第一医院医学组织工程实验室完成.材料:180～200 g成年健康雄性Wistar大鼠,用于制备无细胞神经移植物,100～120 g成年健康雄性Wistar大鼠,用于制备骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞植入并与无细胞神经支架联合培养构建组织工程人工神经.方法:180～200 g成年健康雄性SD大鼠60只构建坐骨神经15 mm缺损模型,随机分成3组,每组20只.①实验组采用组织工程人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损.②空白对照组采用组织工程神经支架桥接大鼠坐骨神经缺损.③自体神经对照组采用自体神经移植桥接大鼠坐骨神经缺损.主要观察指标:术后12周通过大体观察、电生理检测、组织学和小腿三头肌湿质量等方法分析评价运动功能恢复情况.结果:①术后12周,实验组大鼠手术侧足趾可以分开,并且可以支撑着地;实验组大鼠再生神经传导速度与自体神经对照组相比,差异无显著性意义.②术后12周,实验组组织化学染色可见腓肠肌内有呈AchE阳性的运动终板整齐地排列于腓肠肌的中上部形成终板带,经结合镀银染色后可见再生的神经束及发出的分支与运动终板相连.③实验组与自体神经对照组胫骨前肌湿质量比差异无显著性意义.结论:无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞桥接大鼠坐骨神经缺损具有促进其运动功能恢复的作用.     

下颌下腺主导管结扎可激活损伤组织中的干/祖细胞

背景：成体干细胞的伦理学问题较少,而且某些操作技术比较成熟,利用成体干细胞进行组织工程化涎腺的构建具有十分诱人的吸引力和极其重要的应用前景。目的：建立下颌下腺主导管结扎的涎腺组织损伤大鼠模型,探讨涎腺组织损伤模型中成体干/祖细胞存在的可能性及可能位置。方法：SD大鼠统一行右侧下颌下腺主导管结扎,1周后处死大鼠取出两侧腺体,通过苏木精-伊红染色、PAS糖原染色及细胞角蛋白19、Bcl-2、Ki-67等指标的免疫组织化学测定,对正常涎腺组织与建立的损伤模型组织进行比较。结果与结论：同一只大鼠,结扎侧与对照侧体积、质量有明显的差异。对照侧下颌下腺组织呈卵圆形,色泽红润,表面光滑,有完整包膜,质地柔软;结扎后腺体萎缩,组织形态欠规整,色泽暗红,包膜充血,质地变韧,周围组织血管代偿性扩张。主导管结扎的组织损伤模型可导致PAS阳性腺细胞的消失和细胞角蛋白19阳性的小导管上皮细胞增殖,并有在未结扎的腺体中很少见到的小丛层粘连蛋白阳性细胞出现在导管周围,而抑制细胞凋亡的Bcl-2和提示增殖活跃度的Ki-67的表达均有所增强。可见下颌下腺组织中可能存在着定位于涎腺周围导管区的下颌下腺干/祖细胞;下颌下腺主导管结扎导致的组织损伤模型是一种能有效激活下颌下腺组织中干/祖细胞的方法。     

组织工程小血管支架应用于异种血管移植的可行性

背景:具有α半乳糖基末端的糖蛋白是引起超急性排斥反应的主要异种抗原.目的:观察脱细胞小血管支架与Wistar大鼠和日本大耳白兔两种种属实验动物血管壁内皮细胞和平滑肌细胞内α半乳糖基的分布特点,探讨经脱细胞处理后的小血管支架应用于异种血管移植的可行性.设计、时间及地点:观察对比实验,于2003-03/2004-12在中国医科大学解剖学教研室完成.材料:采集Wistar大鼠正常尾动脉30条,其中选择15条进行脱细胞处理得小血管支架(小血管支架组),剩余15条未进行脱细胞处理(尾动脉组);采集日本大耳白兔耳背面中央动脉,左右耳各1条,共取15条(中央动脉组).方法:采用亲和组织化学法,将16 mg/L植物凝集素加入组织片作DAB显色后,利用MetaMorth/C5050/BX41显微图像分析系统,检测α半乳糖基阳性反应产物.主要观察指标:光镜下血管壁细胞显色变化;α半乳糖基阳性反应产物的吸光度值.结果:中央动脉组α半乳糖基的表达主要集中于内皮细胞膜和细胞核;尾动脉组内皮细胞膜α半乳糖基表达呈极强阳性;小血管支架组呈弱阳性或阴性表达.3组血管细胞α半乳糖基表达的吸光度值中,尾动脉组内膜低于中央动脉组(P＜0.001);小血管支架组内膜低于中央动脉组、尾动脉组(P＜0.001);小血管支架组中膜低于中央动脉组、尾动脉组(P＜0.001).结论:①Wistar大鼠尾动脉内皮细胞膜异种抗原性比日本大耳白兔中央动脉的抗原性强.②Wistar大鼠脱细胞的尾动脉支架可作为异种组织工程血管材料应用于异种血管移植.     

去细胞坐骨神经天然支架的成分分析

背景：目前周围神经去细胞的方法较多,应用较多的是化学萃取法和液氮冻融法,但是化学萃取法耗时较长,而液氮冻融法则去除细胞不彻底。作者在查阅大量文献和多次实践的基础上,最终确定了冻融＋化学萃取＋机械振荡的优化法对坐骨神经进行脱细胞处理。目的：对优化法制备的去细胞坐骨神经天然支架进行形态学分析,并对其成分进行鉴定。方法：取Wistar大鼠双侧坐骨神经,随机分为2组,对照组不做特殊处理,实验组用冻融＋化学萃取＋机械振荡的优化法进行脱细胞处理。结果与结论：用优化法制备的去细胞坐骨神经天然支架呈三维管状立体结构,许旺细胞、髓鞘及轴突去除完全。经免疫组化鉴定,Ⅰ型、Ⅲ型胶原和层粘连蛋白等细胞外基质主要成分得到保留。