外源性干扰 PVT1表达对结直肠癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的：外源性干扰PVT1表达对结直肠癌（CRC）细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法体外转染小干扰RNA（siRNA）干扰RKO和HCT116细胞PVT1表达（si‐PVT1组）;另设阴性对照siRNA（si‐NC）组。MTT实验和克隆形成实验检测 RKO和 HCT116细胞增殖力,Transwell实验检测RKO和HCT116细胞侵袭力,qRT‐PCR及Western blot检测相关抑癌基因SMAD4的表达。结果与si‐NC组相比,si‐PVT1组RKO和HCT116细胞增殖力抑制（P＜0．05或P＜0．01）,细胞克隆数减少（P＜0．01）,细胞侵袭数目减少（P＜0．05或P＜0．01）,且SMAD4 mRNA和蛋白表达水平均升高（P＜0．05）。结论 PVT1能促进CRC细胞增殖和侵袭,抑制CRC细胞凋亡。     

人长链非编码RNA基因H19克隆、表达载体构建及对MCF-7细胞增殖的影响

目的克隆人长链非编码RNA H19基因,构建表达载体,研究H19表达对MCF-7增殖的影响作用。方法制备乳腺癌MCF-7细胞总RNA,RT-PCR扩增长链非编码RNA H19全长序列,分子克隆至pc DNA3.1(-)真核表达载体;分别转染HEK-293T和COS 7细胞并行Real-time q PCR验证载体构建是否成功;转染H19表达载体入MCF-7细胞株,转染0、24和48 h后行MTS检测H19表达,同时设计siRNA小分子片段干扰H19的表达,观察对MCF-7细胞增殖活性的影响。结果成功克隆和构建了h H19-pc DNA3.1(-)表达载体;转染入MCF-7细胞48h后,H19过表达,MTS检测H19表达载体组吸光度明显高于空载体组和空白对照组;而转染H19 siRNA小分子片段后能干扰其表达,同时抑制细胞增殖。结论 H19过表达能够促进乳腺癌MCF-7细胞增殖。     

肿瘤相关钙信号传导蛋白-2基因对乳腺癌细胞转移能力的影响

目的探讨TROP-2基因小干扰RNA（siRNA）对乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响。方法培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA—MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测TROP-2基因mRNA表达;筛选出TROP-2表达最高者。采用TROP-2基因小干扰RNA转染乳腺癌细胞,分别以荧光实时定量RT-PCR和免疫荧光方法观察TROP-2基因mRNA和蛋白水平,然后以四唑蓝（MTT）比色法检测细胞黏附性,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力。结果7株乳腺癌细胞中,TROP-2均有不同程度的表达,以MCF-7细胞最高;以TROP-2siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞TROP-2基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;黏附试验结果显示,5、10、20nMsiRNA组黏附率分别为（52．9±2．5）％、（25．6±2．3）％、（12．8±2．2）％（P〈0．01）;Transwell试验结果显示,5、10和20nMsiRNA组穿过滤膜的细胞分别为（78±17）、（39±15）、（19±16）,而对照组分别为（136±25）、（139±21）（P〈0．01）。结论TROP-2基因在乳腺癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞黏附和侵袭能力。     

ADAM17-siRNA抑制人MCF-7乳腺癌细胞体外侵袭能力的研究

目的:观察人MCF-7乳腺癌细胞中解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)的表达受抑制后对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响。方法:构建可以表达针对ADAM17的小干扰RNA(siRNA)的干涉载体,转染人乳腺癌细胞系MCF-7。利用real-time PCR法检测肿瘤细胞内ADAM17 mRNA的表达水平,Western blot法检测ADAM17蛋白的表达,Transwell方法检测肿瘤细胞的体外侵袭能力。结果:ADAM17 mRNA及蛋白在MCF-7细胞中呈高表达,转染特异性ADAM17-siRNA后,其表达显著被抑制,同时细胞的体外侵袭能力也明显受到抑制。结论:ADAM17及特异性的siRNA有望成为抗肿瘤侵袭治疗的新方法。     

骨桥蛋白siRNA在肝癌HepG2细胞中的沉默效应

目的 观察骨桥蛋白（OPN）RNA干扰（siRNA）在肝癌HepG2细胞中的沉默效应。方法 设计合成骨桥蛋白RNA干扰寡核苷酸片段,将之克隆至pGCsi真核表达载体上,并经测序分析鉴定。用脂质体法将质粒转染HepG2细胞筛选稳定转染OPNsiRNA的细胞,并经Westernblot鉴定。结果 成功构建3个pGCsi—OPN质粒,瞬时转染293T细胞后发现pGCsi—OPN2有干扰效应;进一步稳定转染肝癌HepG2细胞,筛选到4株阳性细胞克隆。结论 OPN-siRNA在肝癌HepG2细胞中有沉默效应。     

Survivin siRNA对卵巢癌细胞侵袭的影响

目的：探讨survivin靶向小分子干扰RNA（siRNA）对卵巢癌细胞侵袭的影响。方法：在survivin基因的编码区内根据干涉位点的设计原则,体外转录合成survivin siRNA,转染人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3细胞,用Westernblot方法鉴定干涉位点对survivin基因蛋白的干扰效果;细胞侵袭实验（transwell）检测细胞体外侵袭能力的变化。结果：survivin siRNA能有效抑制survivin蛋白的表达,siRNA组survivin蛋白的相对表达水平分别与空白对照组、非特异性组相比,差异均有统计学意义（P〈0.05）。特异性干涉组细胞的侵袭能力明显低于非特异性干涉组及空白对照组,差异均具有统计学意义（P〈0.001）。结论：特异性的survivin siRNA能有效降低卵巢癌细胞survivin的表达,抑制细胞侵袭能力,这为卵巢癌的基因治疗提供了一种新策略。     

SERPINB7对乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

目的 探讨丝氨酸蛋白酶抑制剂B7(SERPINB7)对乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用及其可能机制。方法 将人乳腺癌细胞系MCF-7分为sh-SERPINB7组、空白对照组(BC组)和阴性对照组(NC组);其中,sh-SERPINB7组和NC组分别转染SERPINB7 RNA干扰慢病毒和阴性对照慢病毒。采用qRT-PCR法检测SERPINB7 mRNA表达,CCK-8法、流式细胞术、细胞划痕实验和Transwell实验分别检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭,Western blot法检测SERPINB7、Bax、Bcl-2、Snail、Slug、转化生长因子β(TGF-β)、Smad3和磷酸化Smad3(p-Smad3)的蛋白表达。结果 MCF-7细胞中SERPINB7蛋白表达高于人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A(P<0.05)。与BC组和NC组相比,sh-SERPINB7组MCF-7细胞中SERPINB7 mRNA表达以及Bcl-2、Snail、Slug、TGF-β、p-Smad3蛋白表达降低,细胞凋亡率升高,细胞划痕愈合率和侵袭细胞数减少,Bax蛋白表达增加(P<0...     

骨桥蛋白对甲状腺癌细胞生物学效应的影响

目的 探讨骨桥蛋白（OPN）对甲状腺癌生物学行为的影响。方法 SW579细胞置于6孔板中培养,采用随机数字表法分成对照组、阴性对照组、OPN siRNA干扰组3组,每组3个孔,每个孔2 mL,细胞密度为1×10⁴/mL。对照组不作任何处理,阴性对照组转染OPN阴性序列,OPN siRNA干扰组转染OPN siRNA序列。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）测定并比较转染后3组细胞OPN、MMP-2、MMP-9、Caspase-3的mRNA水平,四甲基偶氮唑盐（MTT）测定转染后3组细胞的抑制率,流式细胞仪检测转染后3组细胞凋亡率,Transwell小室检测转染后3组细胞的侵袭力,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测3组OPN、MMP-2、MMP-9、Casepase-3的蛋白水平。结果 OPN siRNA干扰组的OPN mRNA的表达水平显著低于对照组和阴性对照组,细胞凋亡率显著高于对照组以及阴性对照组,侵袭能力显著低于对照组和阴性对照组,OPN、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白水平显著低于对照组和阴性对照组,Casepase-3mRNA和蛋白水平显著高于对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 OPN干扰后SW579细胞增殖和侵袭能力下降,凋亡率增加,其机制可能与凋亡蛋白caspase-3水平增加,MMP-2、MMP-9水平下降有关。     

沉默T-cadherin对ox-LDL诱导人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo生物学行为的影响

目的 探讨沉默T-钙黏蛋白（T-cadherin）对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo生物学行为的影响。方法 将人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo分为空白对照组、ox-LDL组、Tcadherin小干扰RNA(siRNA)阴性对照组、T-cadherin siRNA组。各组细胞转染后,实时荧光定量PCR检测各组Tcadherin mRNA水平;MTT法检测HTR-8/SVneo细胞增殖情况;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Transwell小室实验、划痕实验分别检测细胞侵袭、迁移能力;蛋白免疫印迹实验检测细胞胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9蛋白表达水平。结果 与空白对照组相比,ox-LDL组和T-cadherin siRNA阴性对照组T-cadherin mRNA、细胞增殖抑制率、凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表达水平升高,克隆形成率、侵袭细胞数、划痕愈合率、Bcl-2、MMP-2、...     

靶向血管内皮生长因子-C的RNA干扰对裸鼠乳腺癌影响作用的实验观察

目的检测血管内皮生长因子-C（VEGF-C）的RNA干扰技术对裸鼠乳腺癌的影响作用，探讨RNA干扰对乳腺癌基因治疗中的有效性和相关机制。方法36只NOD-SCID小鼠随机分为空载体组12只，阴性短发夹RNA（ShRNA）对照组12只及VEGF-C ShRNA转染组12只。构建携带有绿色荧光蛋白报告基因的VEGF-C ShRNA质粒载体，并导入乳腺癌细胞MCF-7裸鼠皮下移植瘤，尾静脉注射VEGF-C ShRNA表达载体，观察其对乳腺癌生长的影响作用；酶联免疫吸附剂测定（ELISA）方法检测VEGF-C在肿瘤组织中的蛋白浓度；免疫组织化学分析肿瘤组织VEGFR-3阳性脉管密度。结果全身系统性给予VEGF-C ShRNA后，空载体组、阴性ShRNA对照组及VEGF-C ShRNA转染组肿瘤体积分别为（250±4）mm^3、（230±26）mm^3（P=0．2）、（97±25）mm^3（P〈0．05）；瘤组织中VEGF-C浓度在空载体组、阴性ShRNA对照组及VEGF-C ShRNA转染组分别为（496±7）pg／mg、（362±95）pg／mg（P=0．2）和（115±55）pg／mg（P〈0．05）；免疫组化分析VEGF-C ShRNA转染组肿瘤组织中VEGFR-3阳性脉管生成减少（P〈0．05）。结论VEGF-C的RNA干扰明显抑制了VEGFR-3阳性脉管的形成，抑制肿瘤的生长，有望通过RNA干扰技术实现乳腺癌的基因治疗。     

靶向沉默SSBP1基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响

目的 观察靶向沉默线粒体单链DNA结合蛋白(SSBP1)基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响.方法 设计并构建靶向SSBP1 基因的特异性siRNA,采用脂质体介导瞬时转染肝癌HepG2细胞,细胞分3组:对照组、空白转染组、转染组.Real time-PCR和Western-blot检测靶向干扰后SSBP1 mRNA和蛋白表达变化.CCK-8法检测细胞增殖.流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率及线粒体膜电位.划痕实验及Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭转移能力.Western-blot检测增殖、侵袭转移相关基因蛋白表达状况.结果 SSBP1 siRNA能够显著抑制SSBP1 mRNA和蛋白表达.与对照组和空白转染组比较,转染SSBP1 siRNA后HepG2细胞增殖能力、G2期和S期细胞比例、线粒体膜电位明显降低,G1期细胞比例、细胞凋亡率明显升高(P<0.05);同时细胞增殖相关基因PCNA、凋亡抑制基因Bcl-2、转移相关基因MMP-9蛋白表达显著下调,凋亡诱导基因Bax蛋白表达显著上调(P<0.05).结论 靶向沉默SSBP1基因能够通过线粒体途径抑制肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移,并诱导其凋亡.     

小干扰RNA逆转人乳腺癌细胞MCF-7多药耐药的体外研究

目的研究以多药耐药相关蛋白(MRP)为靶标的小干扰RNA(siRNA)抑制相应蛋白表达,对人乳腺癌细胞MCF-7药物敏感性的影响。方法以MRP基因为靶标的siRNA转入MCF-7细胞,检测对MRP mRNA和蛋白表达水平的影响及其对抗肿瘤药物IC50的影响。结果经siRNA干扰后,MRP基因的mR-NA和蛋白的表达均有明显降低,肿瘤细胞对相关化疗药物的敏感性明显增加。结论以MRP基因为靶标的siRNA一定程度上逆转了肿瘤细胞的多药耐药性。     

SAHA-CTSV轴通过诱导过度自噬抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长

目的研究SAHA-CTSV轴通过诱导过度自噬抑制乳腺癌MCF-7细胞生长的作用和机制。方法以人乳腺癌MCF-7细胞为研究目标,Muse细胞分析仪检测SAHA对细胞活力的作用;Real-time PCR和Western blot检测SAHA对CTSV的mRNA及蛋白表达的影响,同时检测利用siRNA干扰技术敲除CTSV后的细胞CTSV表达水平;细胞免疫荧光法检测SAHA对LC3II分子的作用;Real-time PCR和Western blot检测SAHA诱导自噬过程中相关ATG分子和LC3的mRNA和蛋白的变化;Bafilomycin A1抑制自噬,随后利用Western blot和Muse细胞分析仪分别检测p62蛋白水平和SAHA作用后的细胞活力。结果SAHA可以抑制MCF-7细胞的增殖,并促进CTSV的表达。CTSV-siRNA转染细胞后,CTSV的mRNA和蛋白水平均显著性降低。SAHA增加了LC3免疫荧光点的分布,与CTSV-siRNA共同作用可恢复由CTSV-siRNA敲减引起的细胞自噬减弱。SAHA在增强ATG4C和Beclin1表达的同时,LC3B也随之升高而mTOR则下降。抑制CTSV表达后也同时逆转了SAHA的效应。Bafilomycin A1阻断自噬后,被SAHA抑制的p62蛋白的表达和细胞活力显著增强。结论SAHA-CTSV轴通过诱导过度自噬抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长。     

lncRNA FOXCUT调控Notch通路抑制结肠癌细胞增殖、侵袭的实验研究#br#

目的　研究长链非编码RNA（lncRNA）FOXC1启动子临近转录体（FOXCUT）对结肠癌细胞（HCT116）增殖、侵袭的影响及作用机制。方法　向HCT116细胞转染FOXCUT siRNA（FOXCUT siRNA组）,以转染阴性siRNA为阴性对照组（FOXCUT siRNA-NC组）,未转染组为正常对照组（NC组）,通过qPCR法确定FOXCUT干扰效果,并检测结肠癌及癌旁组织、人结肠癌细胞株（SW480、SW620、HCT116、HT29）和人正常结肠上皮细胞（NCM460）中FOXCUT mRNA表达水平;通过CCK-8、集落形成实验和Transwell实验检测沉默FOXCUT对HCT116细胞增殖、集落形成能力及侵袭能力的影响;qPCR检测沉默FOXCUT后HCT116细胞中Notch1、Hes1 mRNA表达变化;蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测HCT116细胞中Notch1、Hes1蛋白表达情况。结果　与癌旁组织比较,结肠癌组织中FOXCUT mRNA表达水平显著增高（P＜0.01）;与NCM460细胞比较,SW480、SW620、HCT116、HT29结肠癌细胞株中FOXCUT mRNA表达水平均显著增高（P＜0.05）,其中以HCT116细胞中表达水平最高;与FOXCUT siRNA-NC组比较,FOXCUT siRNA组HCT116细胞中FOXCUT mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）;NC组、FOXCUT siRNA-NC组HCT116细胞中FOXCUT mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）;沉默FOXCUT可显著抑制细胞增殖、集落形成能力及侵袭（P＜0.05）,并抑制Notch1、Hes1 mRNA及蛋白表达（P＜0.01）。结论　沉默FOXCUT可抑制结肠癌HCT116细胞增殖及侵袭,可能与抑制Notch通路有关。     

siRNA抑制人乳腺癌SK-BR-3细胞株VEGF基因表达的实验研究

目的研究siRNA(small interfering,RNA)对乳腺癌细胞SK-BR-3的VEGF基因表达的抑制作用,为RNAi技术在肿瘤生物治疗中的应用提供实验基础。方法体外合成一条针对VEGF基因的siRNA,使用脂质体转染的方法导入细胞,观察转染后乳腺癌细胞SK-BR-3的增殖变化,MTT法检测细胞存活率,RT-PCR检测转染后VEGFmRNA表达水平的变化,ELISA检测蛋白表达的下降效果。结果所设计的siRNA能有效抑制乳腺癌细胞的生长;降低了VEGFmRNA的表达;蛋白表达水平也显著降低。作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有这种效果,不起作用。结论 siRNA可以有效抑制细胞株SK-BR-3中VEGF的表达,从而抑制细胞生长。应用RNA干扰技术可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。     

Knockdown of FoxM1 by siRNA interference decreases cell proliferation, induces cell cycle arrest and inhibits cell invasion in MHCC-97H cells in vitro

Aim:

To investigate the effects of small interfering RNA (siRNA) knockdown of forkhead box M1 (FoxM1) on the proliferation and invasion capacities of human hepatocellular carcinoma MHCC-97H cells in vitro.

Methods:

The expression levels of FoxM1 in human hepatocellular carcinoma samples, adjacent non-hepatocellular carcinoma liver samples and MHCC-97 cell lines were detected by RT-PCR and Western blotting. FoxM1 siRNA was transfected into MHCC-97H cells with Lipofectamine 2000. Cell growth was evaluated by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, and cell cycle analysis was performed by flow cytometry. Protein expression levels were evaluated by Western blotting. Anchorage-independent growth and the invasive potency of MHCC-97H cells were measured by soft agar colony formation and a transwell cell invasion assay, respectively.

Results:

FoxM1 was over-expressed in hepatocellular carcinoma samples compared to adjacent non-hepatocellular carcinoma liver samples. FoxM1 siRNA was successfully transfected into MHCC-97H cells, resulting in the significant inhibition of FoxM1 mRNA and protein expression. Down-regulation of FoxM1 inhibited cell proliferation, caused cell cycle arrest, and decreased invasion of MHCC-97H cells. Compared with control and mock groups, the FoxM1 siRNA transfected cells showed decreased protein expressions of cyclin B1 and cyclin D1, whereas p27 protein expression was increased. Down-regulation of FoxM1 reduced the expression of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and urokinase plasminogen activator (uPA).

Conclusion:

FoxM1 is functionally involved in hepatocellular carcinoma cell proliferation and invasion and is a potential target for hepatocellular carcinoma therapy.     

Peripheral-type benzodiazepine receptor overexpression and knockdown in human breast cancer cells indicate its prominent role in tumor cell proliferation

The peripheral-type benzodiazepine receptor (PBR), an 18-kDa high affinity drug and cholesterol binding protein, is expressed at high levels in various cancers. Its expression is positively correlated with aggressive metastatic behavior in human breast cancer cells. To determine the role of PBR in tumor progression, two human mammary carcinoma cell lines were utilized: the non-aggressive MCF-7 cell line, which expresses extremely low PBR levels, and the highly aggressive MDA-MB-231 cell line, which has much higher PBR levels. We have generated stably transfected lines of the tetracycline-repressible MCF-7 cell line (MCF-7 Tet-Off) with inducible human PBR cDNA. Induction of PBR expression in MCF-7 Tet-Off cells increased PBR ligand binding and cell proliferation. Transfection of MDA-MB-231 cells with multiple siRNAs complementary to PBR (PBR-siRNAs) led to different levels of PBR mRNA knockdown. Lentiviral-mediated PBR RNA interference in MDA-MB-231 cells decreased PBR levels by 50%. Decreased PBR expression was associated with cell cycle arrest at G2 phase, decreased cell proliferation, and significant increases in the protein levels of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21(WAF/CIP1). These changes were accompanied by p53 activation seen as increased p53 phosphorylation (Ser15). In parallel, increased proteolytic activation of caspase-3 was also observed. Taken together these results suggest that PBR protein expression is directly involved in regulating cell survival and proliferation in human breast cancer cells by influencing signaling mechanisms involved in cell cycle control and apoptosis.