RNA干扰技术抑制乳腺癌表皮生长因子受体的表达

目的 探讨采用化学合成小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰（RNAi）技术是否能有效抑制乳腺癌细胞株MDA-MB231、MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞表皮生长因子受体（EGFR）表达,以及抑制EGFR基因表达后乳腺癌细胞生物学特性的改变,以期为肿瘤治疗提供新的思路和实验依据.方法 （1）建立检测EGFR数量的方法,测定MDA-MB231、MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞株EGFR的表达.（2）观察dsRNA-EGFR/Lipofectamine 2000对EGFR表达的抑制作用.（3）采用流式细胞仪测定细胞周期,采用ELISA法观察抑制EGFR表达后,MDA-MB231,MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞生物学特性的改变.结果 MDA-MB231、MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞株存在EGFR高表达.转染dsRNA-EGFR后可将MDA-MB231、MDA-MB-453S细胞对5-Fu的敏感性提高约4倍.细胞周期分析结果表明dsRNA-EGFR组G0-G1期细胞百分数较对照组增加了17.48%,进入S期的细胞百分数较对照组减少了19.20%.转染dsRNA-EGFR后可将ZR-75-30、ZR-75细胞对5-Fu的敏感性提高约7倍.结论 （1）乳腺癌细胞株存在EGFR高表达.（2）dsRNA-EGFR可序列特异性下调乳腺癌细胞EGFR基因水平,显著降低EGFR蛋白表达.（3）dsRNA-EGFR通过抑制EGFR表达可显著抑制细胞增生和细胞迁移,降低配体EGF的含量,将更多的细胞阻滞在G0-G1期,增加细胞对5-Fu的敏感性,有效逆转乳腺癌细胞的恶性表型,从而为乳腺癌基因治疗提供了新策略.     

RNA干扰抑制CYP3A4基因表达的实验研究

目的 研究质粒表达型短发夹RNA（small hairpin RNA，shRNA）对CHL-3A4转基因细胞的细胞色素P450 3A4（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）基因表达的影响。方法设计并构建3条shRNA真核表达载体（CYP3A4Ⅰ、CYP3A4Ⅱ、CYP3A4Ⅲ）．脂质体转染CHL-3A4转基因细胞。转染48h后．TR-PCR和Western Blotting分别观察3条shRNA对CYP3A4mRNA和蛋白表达的影响；噻唑蓝（MTT）观察shRNA抑制环磷酰胺对CHL-3A4转基因细胞毒性作用。结果CYP3A4Ⅲ表达载体的shRNA分别能抑制CHL-3A4细胞的CYP3A4mRNA表达（70％）及蛋白表达（75％），抑制环磷酰胺对CHL-3A4细胞（75％）细胞毒作用。结论RNA干扰能显著抑制CYP3A4基因的表达，RNA干扰技术为肝细胞色素P450的研究提供了新的方法。     

ADAM17-siRNA抑制人MCF-7乳腺癌细胞体外侵袭能力的研究

目的:观察人MCF-7乳腺癌细胞中解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)的表达受抑制后对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响。方法:构建可以表达针对ADAM17的小干扰RNA(siRNA)的干涉载体,转染人乳腺癌细胞系MCF-7。利用real-time PCR法检测肿瘤细胞内ADAM17 mRNA的表达水平,Western blot法检测ADAM17蛋白的表达,Transwell方法检测肿瘤细胞的体外侵袭能力。结果:ADAM17 mRNA及蛋白在MCF-7细胞中呈高表达,转染特异性ADAM17-siRNA后,其表达显著被抑制,同时细胞的体外侵袭能力也明显受到抑制。结论:ADAM17及特异性的siRNA有望成为抗肿瘤侵袭治疗的新方法。     

RNA干扰致FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型的建立

目的 利用shRNA表达载体建立FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型.方法 将化学方法合成的特异性FRAT1基因siRNA,以人类结肠癌HT29细胞为实验对象,采用Lipofectamine将FRAT1基因的shRNA表达载体导入细胞后,用RT-PCR和Western blot检测目标基因FRAT1的表达水平.结果 稳定转染FRAT1 shRNA表达载体（pSINsi-FRAT1）后,FRAT1基因在mRNA和蛋白质表达水平分别下降92.63％、55.72％ （P＜0.05）.结论 成功地建立了FRAT1基因沉默HT29细胞模型,为研究FRAT1生物学功能打下坚实的实验基础.     

应用 RNA 干扰技术下调 ANXA3表达的 MDA-MB-231乳腺癌细胞株的建立

目的：建立针对膜联蛋白A3（Annexin A3, ANXA3）的shRNA稳定转染的乳腺癌细胞株MDA-MB-231,为后续进一步研究奠定基础。方法荧光定量RT-PCR及western blot方法检测两种乳腺癌细胞株（ MDA-MB-231及MCF-7）中ANXA3 mRNA及蛋白表达水平。构建沉默ANXA3基因的shRNA质粒3个（ ANXA3-sh1-3）及阴性对照质粒,脂质体法转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231;选出ANXA3沉默效果最好的干扰质粒做后续实验。嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞;Western blot 方法检测转染后细胞中ANXA3蛋白表达水平。结果 MDA-MB-231细胞中 ANXA3 mRNA及蛋白表达水平显著高于MCF-7中的表达（ P ＜0 k．05）;成功构建3个针对ANXA3基因的shRNA质粒;转染ANXA3-sh1～3及阴性对照质粒后MDA-MB-231细胞中ANXA3 mRNA表达水平分别为（0．0196±0．0002）、（0．0085±0．0002）、（0．0220±0．0035）、（0．0661±0．0057）,未转染的MDA-MB-231细胞中ANXA3 mRNA表达水平为（0．0692±0．0050）,脂质体组MDA-MB-231细胞中ANXA3 mRNA表达水平为（0．0652±0．0118）,ANXA3-sh2对MDA-MB-231细胞中ANXA3 mRNA沉默效率最高,达87．72％,因此后续实验选择ANXA3-sh2;嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞分别命名为MDA-MB-231-Sh及MDA-MB-231-NC细胞。 Western blot检测结果显示,MDA-MB-231-Sh细胞中ANXA3蛋白显著低于MDA-MB-231及MDA-MB-231-NC细胞中的表达（ P ＜0．01）。结论 MDA-MB-231细胞较MCF-7细胞高表达ANXA3,成功的建立了稳定下调ANXA3表达的乳腺癌细胞株MDA-MB-231,为后续进一步研究ANXA3的表达及特性打下基础。     

长链非编码 RNA Linc00461干扰慢病毒的构建与鉴定

目的:制备shRNA干扰人长链非编码RNA Linc00461的慢病毒载体（shRNA- Linc00461）,为深入研究长链非编码RNA功能奠定基础。方法：利用在线干扰设计网页进行干扰引物设计,根据小干扰RNA的设计原则,选取三对针对Linc00461特异性干扰引物送由公司合成。合成的片段连接到慢病毒载体质粒pSIH1-H1,形成pSIH1-H1-shRNA- Linc00461质粒。用PCR及测序对其进行鉴定,之后与慢病毒包装质粒混匀,由脂质体转染至HEK293T细胞进行包装,产生慢病毒shRNA- Linc00461,并收集上清液使其感染乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过RT-PCR鉴定重组慢病毒干扰效果。并选取干扰效果最好的Linc00461感染MDA-MB-231,MTT和流式细胞术检测细胞增殖和周期改变。结果： SIH1-H1-shRNA Linc00461质粒经PCR验证和测序后,证实其构建成功。shRNA- Linc00461在HEK293T细胞中重组成慢病毒,并成功感染MDA-MB-231,感染效率约为70%。shRNA-Linc00461感染乳腺癌MDA-MB-231细胞后Linc00461的表达下调65.32%; 感染shRNA-Linc00461第3天MTT 结果显示：实验组吸光度值（0.232±0.032）明显低于实验对照组（0.398±0.037）。流式结果提示实验组G2M 期细胞（47.55±5.063）％高于实验对照组（8.876±3.565）％。结论：成功构建了shRNA- Linc00461慢病毒载体,并能有效抑制Linc00461表达,为深入研究人Linc00461基因功能奠定了基础。     

RNA干扰质粒抑制富含半胱氨酸蛋白61在大鼠血管平滑肌细胞中的表达

目的观察RNA干扰质粒对大鼠血管平滑肌细胞中富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)表达的抑制作用。方法构建Cyr61RNA干扰质粒(pCyr61-shRNA)转染大鼠血管平滑肌细胞,采用半定量反转录聚合酶链反应及Western blot检测Cyr61 mRNA和蛋白表达。结果测序证实成功构建Cyr61RNA干扰质粒;转染pCyr61-shRNA组mRNA及蛋白表达均明显降低,与正常对照组和转染无关序列对照组(p-HK)相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论RNA干扰质粒抑制Cyr61在大鼠血管平滑肌细胞中的表达。     

RNA组合干扰技术及其在肿瘤基因治疗中的应用

RNA干扰(RNAi)为基因治疗提供了一个全新的思路。但单一的RNAi治疗只针对单个基因,因而最终无法治愈多基因变异引起的肿瘤。为了克服RNAi单基因治疗的不足,研究人员提出了RNA组合干扰(combinatorial RNA interference,coRNAi)的治疗策略。coRNAi通过联合应用针对单个或多个靶基因的RNAi诱发物以及其他RNA或蛋白沉默因子实现沉默靶基因、抑制肿瘤生长和促进肿瘤细胞凋亡。本文重点介绍了coRNAi的主要联合方式以及在肿瘤基因治疗中的研究进展。     

骨桥蛋白siRNA在肝癌HepG2细胞中的沉默效应

目的 观察骨桥蛋白（OPN）RNA干扰（siRNA）在肝癌HepG2细胞中的沉默效应。方法 设计合成骨桥蛋白RNA干扰寡核苷酸片段,将之克隆至pGCsi真核表达载体上,并经测序分析鉴定。用脂质体法将质粒转染HepG2细胞筛选稳定转染OPNsiRNA的细胞,并经Westernblot鉴定。结果 成功构建3个pGCsi—OPN质粒,瞬时转染293T细胞后发现pGCsi—OPN2有干扰效应;进一步稳定转染肝癌HepG2细胞,筛选到4株阳性细胞克隆。结论 OPN-siRNA在肝癌HepG2细胞中有沉默效应。     

靶向hTERT的特异性siRNA抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖机制研究

目的筛选有效抑制肝癌细胞hTERT表达的小干扰RNA(siRNA)序列,并检测其对hTERT蛋白表达、细胞凋亡的影响。方法设计并合成针对hTERT的6条siRNA双链及一条阴性对照siRNA,以LipofectaminTM2000转染至肝癌SMMC-7721细胞。用磺基罗丹明B法(sulforhodamine B法,SRB法)测定干扰后细胞增殖的变化,RT-PCR测定hTERTmRNA的表达,筛选出有效序列。有效序列转染后,进一步采用Western blot法检测hTERT蛋白水平的变化,AnnexinV-FITC/PI双染、流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果以SRB和RT-PCR法筛选出的两条有效siRNA:siRNA-2和siRNA-6,能明显抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖,对细胞的抑制率分别为45.3%、38.2%,能高度沉默hTERT mRNA的基因,沉默率分别为80%、75%。二者还能明显下调hTERT蛋白表达(P<0.05),明显增加凋亡,凋亡率分别为20.23%、17.94%。结论 siRNA-2和siRNA-6能特异性沉默肝癌SMMC-7721细胞hTERT基因表达,抑制增殖,降低hTERT蛋白水平,诱导凋亡,为肝癌基因治疗提供了有力的实验依据。     

骨桥蛋白mRNA在卵巢癌中的表达及其临床意义

目的探讨骨桥蛋白(OPN)mRNA在卵巢癌中的表达并分析其临床意义。方法利用实时荧光定量RT-PCR技术检测35例卵巢癌及正常卵巢组织中OPNmRNA的表达,并结合卵巢癌的临床病理特征进行分析。结果OPNmRNA在卵巢癌组织中表达明显升高,其表达与卵巢癌临床分期及是否存在淋巴结转移显著相关(P<0.01),临床分期较晚、有淋巴结转移的卵巢癌组织中表达水平显著升高。OPNmRNA与CA125在卵巢癌中的表达没有相关性(P>0.05)。结论OPN可能在卵巢癌的发生发展以及转移中起着重要作用,OPN和CA125的联合检测可提高卵巢癌的阳性诊断率。     

SiRNA沉默 HBx对 HepG2.2.15细胞人端粒酶逆转录酶基因表达的影响

目的探讨应用RNA干扰技术沉默HBx对HepG2．2．15细胞中hTERT基因表达的影响。方法（1）将pSIHBV／X质粒转染HepG2．2．15细胞,RT-PCR法评估沉默效率。（2）MTT法检测转染24h、48h、72h后细胞增殖情况。（3）Real-timePCR和Westernblot检测hTERT表达情况。结果测序结果显示pSIHBV／X质粒构建正确;RT-PCR检测HBVX基因的沉默效率为53．6％;MTT检测结果显示转染24h、48h、72h后H印G2．2．15细胞的增殖受抑制,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;Real-timePCR和Western blot检测结果均显示,转染pSIHBV／X质粒后HepG2．2．15细胞中hTERT基因的mRNA水平和蛋白水平表达分别有不同程度的下调,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论siRNA沉默HBx基因可抑制HepG2．2．15细胞中癌症标志基因hTERT的表达。     

特异沉默人核糖核苷酸还原酶M2基因对人骨肉瘤细胞生物学特性的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)沉默核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)基因表达对入骨肉瘤细胞Saos-2生物学影响及分子机制.方法 利用小干扰RNA技术,观察沉默Saos-2细胞中RRM2基因的表达,用实时荧光定量PCR(Real time-PCR)及Western blot技术检测人骨肉瘤细胞Saos-2和人正常成骨细胞hFOB1.19的mRNA及蛋白的表达;用CCK-8方法检测si-RRM2对Saos-2细胞增殖的影响;用Transwell细胞迁移系统检测si-RRM2对Saos-2细胞迁移能力的影响;用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测Saos-2细胞凋亡;采用Western blot技术检测细胞周期调控因子细胞周期素D1(Cyclin D1)和抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白水平变化.结果 Saos-2细胞RRM2 mRNA和蛋白比hFOB1.19细胞高表达;用si-RRM2转染Saos-2细胞后,Real time-PCR结果证实能时间及剂量依赖性下调RRM2基因表达;CCK-8方法结果显示下调RRM2基因会时间及剂量依赖性抑制Saos-2增殖,而人正常成骨细胞增殖抑制没有显著变化;Transwell细胞迁移系统检测显示下调RRM2基因后,显著抑制了Saos-2的迁移能力;si-RRM2联合化疗药物阿霉素促进Saos-2细胞凋亡;Western blot结果显示沉默RRM2后细胞周期调控因子Cyclin D1和抗凋亡蛋白Bcl-2均下调.结论 RRM2的过表达与人骨肉瘤细胞Saos-2的高增殖和迁移能力有关,抑制RRM2的功能是治疗人骨肉瘤的一个潜在的治疗策略.     

骨桥蛋白在肝癌患者外周血和癌组织中的含量及其临床意义

目的 检测骨桥蛋白(OPN)在肝癌患者外周血和癌组织中的表达水平,分析其与肝癌临床病理特征之间的关系,并探讨OPN作为肝癌标志物的可能性.方法 应用免疫组织化学法检测34例肝癌和14例癌旁组织中OPN的表达;并应用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测51例肝癌患者的外周血OPN的表达水平,并结合临床病理特征进行分析.结果 (1)肝癌组织中OPN的阳性表达率(73.5%),明显高于癌旁组织中的(21.4%)(P＜0.05).(2)肝癌患者血浆中OPN的表达水平与肿瘤的淋巴结转移、血管浸润和肝包膜浸润等病理特征有明显相关(P＜0.05).(3)肝癌患者血浆OPN水平显著高于正常对照组(P＜0.01),对肝癌检测的敏感性为90.2%,特异性为90.6%.结论 OPN在肝癌组织中呈过度表达.血浆OPN可以是肝癌诊断的一种较为特异的标志物,其表达水平与肝癌的淋巴结转移、血管及肝包膜浸润等多项临床病理特征有相关性.     

骨桥蛋白对甲状腺癌细胞生物学效应的影响

目的 探讨骨桥蛋白（OPN）对甲状腺癌生物学行为的影响。方法 SW579细胞置于6孔板中培养,采用随机数字表法分成对照组、阴性对照组、OPN siRNA干扰组3组,每组3个孔,每个孔2 mL,细胞密度为1×10⁴/mL。对照组不作任何处理,阴性对照组转染OPN阴性序列,OPN siRNA干扰组转染OPN siRNA序列。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）测定并比较转染后3组细胞OPN、MMP-2、MMP-9、Caspase-3的mRNA水平,四甲基偶氮唑盐（MTT）测定转染后3组细胞的抑制率,流式细胞仪检测转染后3组细胞凋亡率,Transwell小室检测转染后3组细胞的侵袭力,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测3组OPN、MMP-2、MMP-9、Casepase-3的蛋白水平。结果 OPN siRNA干扰组的OPN mRNA的表达水平显著低于对照组和阴性对照组,细胞凋亡率显著高于对照组以及阴性对照组,侵袭能力显著低于对照组和阴性对照组,OPN、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白水平显著低于对照组和阴性对照组,Casepase-3mRNA和蛋白水平显著高于对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 OPN干扰后SW579细胞增殖和侵袭能力下降,凋亡率增加,其机制可能与凋亡蛋白caspase-3水平增加,MMP-2、MMP-9水平下降有关。     

Inhibition of STAT3 expression by siRNA suppresses growth and induces apoptosis in laryngeal cancer cells

Aim: To determine the inhibitory effect of the synthetic STAT3 siRNA on the expression of STAT3 gene in human laryngeal cancer cell lines Hep2 and to investigate the effect of STAT3 siRNA on growth and apoptosis in Hep2 cells. Methods: A pair of DNA templates coding siRNA against STAT3-mRNA was synthesized to reconstruct plasmid of pSilencer1.0-U6 siRNA-STAT3. Hep2 cells were transfected with RPMI-1640 media (untreated), plasmid (empty), and STAT3 siRNA, respectively. Northern blot and Western blot analysis of STAT3 and pTyr-STAT3 expression in Hep2 cells and Western blot analysis of Bcl-2 expression in the Hep2 cell was performed 72 h after transfection. MTT, flow cytometry, and AO/EB assay were used for determination of cells proliferation and apoptosis in Hep2 cells. Results: pTyr-STAT3 was markedly expressed in untreated Hep2 cells and the vector-treated Hep2 cells, whereas pTyr-STAT3 expression was significantly reduced in STAT3 siRNA-transfected Hep2 cells, indicating that STAT3 siRNA inhibited the activity of STAT3. Transfection of Hep2 cells with STAT3 siRNA significantly inhibited STAT3 expression at both mRNA and protein level in Hep2 cells and the inhibition was characterized by time-dependent transfection. Treatment of Hep2 cells with STAT3 siRNA resulted in dose-dependent growth inhibition of Hep2, this significantly increased apoptotic cell rate, and decreased Bcl-2 expression level in Hep2 cells. STAT3 siRNA had an effect on induction of either early or late stage apoptosis. Conclusion: This study demonstrates that STAT3 siRNA effectively inhibits STAT3 gene expression in Hep2 cells leading to growth suppression and induction of apoptosis in Hep2 cells. The use of siRNA technique may provide a novel therapeutic approach to treat laryngeal cancer and other malignant tumors expressing constitutively activated STAT3.