逆转录病毒载体介导的基因转移技术研究进展

逆转录病毒载体能稳定、高效率整合进入宿主细胞染色体基因组,并在宿主细胞内高效率的表达。这种基因转移技术为将外源基因导入哺乳动物和人细胞,从而为进行基因结构和功能,基因表达和调控,人类遗传病的基因治疗等当代分子生物学研究领域前沿问题的探讨提供了有力的手段。近年来,国外的一些实验室对逆转录病毒载体及包装细胞进行了一系列的深入研究,取得了许多重要成果。本文对了这些方面的主要进展进行了简述。     

哺乳动物细胞的基因转移

基因转移是借助于物理的、化学的或生物的手段将外源基因导入受体细胞并检查其在该细胞内表达情况的一种技术,是分子生物学手段和细胞生物学手段的结合。在生命科学发展到当今水平的时代里,基因转移是一项重要而应用广泛的技术。例如:在基础     

一种通过表皮生长因子受体介导的基因转移系统

目的发展一种针对表皮生长因子过量表达的肿瘤细胞的基因转移系统。方法人工合成了一种Ｎ端含多个赖氨酸残基，Ｃ端为人表皮生长因子（ＥＧＦ）的受体结合域的３３肽，此合成肽（Ｋ９Ｅ肽）既具有ＤＮＡ结合活性，又能为细胞表面ＥＧＦ受体所识别并内在化。Ｋ９Ｅ肽与萤火虫荧光素酶表达质粒ｐＥＢｌｕｃ按一定比例结合形成核酸复合物，以此为基础，利用受体介导的基因转移技术，组建了外源基因转移系统。结果核酸复合物直接加入于类上皮癌细胞Ａ４３１的培养液中，４８小时后可从细胞裂解液中测出荧光素酶的显著表达。结论该系统可特异性地将外源基因导入ＥＧＦ受体过量表达的肿瘤细胞。     

氯霉素乙酰转移酶检测(CAT assay)

本文介绍一种快速方便的外源基因在哺乳动物细胞中瞬间表达检测系统,即氯霉索乙酰转移酶检测系统。该项检测技术不仅对基因的调控顺序(Cis-acting elements)如启动子、增强子等检测提供了有效的工具,而且为真核基因在哺乳动物细胞表达体系中,质粒的构建及筛选提供了行之有效的手段。并介绍了该技术的全过程及其操作要点。     

体内电穿孔法转基因技术的应用

电穿孔法转基因是将外源基因通过电场作用导入动物目标组织或器官细胞中的技术.Neumann等[1]首次成功应用该技术,把外源DNA导人小鼠成纤维细胞.随后大最的实验证明,几乎所有类型的细胞,包括植物原生质体、动物初生细胞,以及不能用其他方法转染的细胞和组织,都可以成功地使用电穿孔技术进行基因转移.     

可调控型反义基质金属蛋白酶9表达抑制人黑色素瘤细胞侵袭转移表型的研究

目的 探讨基质金属蛋白酶(MMP)-9与肿瘤转移的相关性。方法 利用基因重组技术构建反义MMP—9 cDNA四环素可调控型表达载体,用脂质体法转染反义MMP—9至转移性人黑色素瘤细胞株WM451(高表达MMP—9)。检测转染后细胞MMP—9表达水平的改变以及体外生长、侵袭、裸鼠体内成瘤及自发转移能力的变化。结果 转染反义基因后,WM451细胞MMP—9的表达及活性明显下降,同时MMP—2的表达也受到一定抑制,细胞生长速度、体外侵袭能力及棵鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制;运用四环素可以抑制四环素负调控逆转录病毒载体上的外源基因的表达。结论 反义MMP—9基因下调MMP—9的表达,可使人黑色素细胞转移能力受到一定程度的抑制,说明MMP—9在人黑色素瘤细胞转移过程中起重要作用。同时,四环素负调控逆转录病毒载体可以调控外源基因的表达。     

MTS1／p16抑制基因的克隆及其对宫颈癌细胞系的影响

利用重组ＲＴ－ＰＣＲ方法从人胎盘中扩增多重肿瘤抑制基因（ＭＴＳ１）全长ｃＤＮＡ片断，克隆测序后，亚顾隆入哺乳动物高铲表达质粒ｐＣＥＰ中。将表达质业转染两种遗传背影不同的吕颈癌细胞系，发现外源基因ＭＴＳ１／ｐ１６基因的导入对ＨＰ〖Ｖ阳性的宫颈癌细胞系具有明显生长抑制作用，并出现细胞滞留Ｇ１期的特性。     

Annexin A2基因沉默对肺癌细胞转移能力的影响

目的:研究膜联蛋白A2(Annexin A2)基因沉默对体外培养的肺腺癌细胞系转移能力的影响。方法:体外培养4种转移潜能不同的肺腺癌细胞,采用Transwell迁移模型观察细胞的迁移能力。采用RT-PCR和Western blot分析分别检测细胞中Annexin A2 mRNA及蛋白的表达。应用RNA干扰技术沉默细胞中Annexin A2表达,观察Annexin A2基因沉默前后细胞迁移能力的变化以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)表达的变化。结果:Annexin A2在高转移潜能的肺腺癌细胞系中呈高表达状态(P<0.01)。Annexin A2基因沉默后,高转移潜能的肺腺癌细胞的迁移能力下降(P<0.05)。p-mTOR在高转移潜能的肺癌细胞中呈明显高表达(P<0.01),Annexin A2基因沉默后,细胞中p-mTOR表达明显下降(P<0.01)。结论:Annexin A2基因沉默显著抑制肺癌细胞的转移能力,Annexin A2对肺腺癌细胞转移能力的调控可能与其激活mTOR信号通路有关。     

基因转移的DNA病毒方法

在基因治疗中,作为基因转移的载体,迄今几乎都用逆转录病毒,但是在某些情况下(例如将外源基因导入非分裂状态的细胞),DNA病毒作为载体具有明显的优越性。本文对腺相关病毒、腺病毒和疱疹病毒作为外源基因载体进行了简要的讨论。     

反义MCP-1转染兔平滑肌细胞及对其生长的影响

构建逆转录病毒载体反义单核细胞趋化蛋白1（LUCX-Anti-MCP－1）表达质粒,利用阳离子脂质体（Lipofectamine）将反义MCP－1导入体外培养的平滑肌细胞,通过PCR、Northern杂交检测外源基因的转染及其mRNA表达情况。应用3H胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）掺入法了解反义MCP－1基因对细胞生长的影响．结果显示：Lipofectamine可以成功的将反义MCP－1基因导入体外培养的主动脉平滑肌细胞中,并实现外源基因的转录表达。且反义MCP－1基因对体外培养的平滑肌细胞生长没有影响。     

乳酸乳球菌同时发送外源性蛋白质/DNA到哺乳动物细胞

目的:建立乳酸乳球菌同时发送外源蛋白/DNA到哺乳动物细胞的系统.方法:分别将红色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白真核表达框整合于乳酸菌穿梭载体pMG36e中相关部位.重组质粒电转乳酸乳球菌后,经甘氨酸消弱乳酸乳球菌细胞膜后与哺乳动物细胞293T细胞共培养.结果:红色和绿色荧光蛋白均能在293T细胞表达.结论:借助乳酸乳球菌成功实现同时发送蛋白质/DNA到哺乳动物细胞.     

影响外源DNA导入哺乳动物细胞有关因素的研究

本文采用磷酸钙-DNA共沉淀转化法将多种重组质粒导入Hela细胞，并对影响其转化效率的有关因素进行了观察，建立了适合本实验室的标准化转染方法。结果表明：1)待转化的细胞应为单层约稀疏的对效生长期细胞；2)重组质粒DNA的浓度为8～10μg/100ml培养瓶；3)磷酸钙-DNA共沉物与持转化的细胞共孵育时间为10h；4)G418是在转染后24h加入，浓度为200μg/ml，为最佳转化条件。本研究采用该方法将质粒pcDNA3，pcDNA3-MSP119，pcDNA3-SjESG，pcDNA3-CSP，pcDNA3-MSP1，pcDNA3-MSP2和pcDNA3-Pfs48/45导入哺乳动物细胞HaLa细胞均获得满意结果。每微壳DNA的平均克隆数高达9．6。重组质粒DNA导入哺乳动物细胞方法的标准化为外源基因在哺乳动物细胞中的高效表达创造有利条件。     

端粒酶RNA基因在白细胞中表达的研究

用RT－PCR的方法钓取端粒酶RNA（hTR）基因的cDNA，将hTR基因克隆到逆转录病毒载体（pLNCX）构建哺乳动物细胞表达质粒，然后经脂质体介导转染人体正常的外周血白细胞中表达。结果表明端粒酶RNA基因的表达，不能激活或重建白细胞的端粒酶活性，流式细胞技术分析结果显示，外源hTR基因的表达不能延长白细胞的寿命，反而抑制白细胞的增殖并促进其凋亡，这可能是因为外源hTR基因的表达一定程度上阻碍了细胞内端粒酶RNA同端粒酶催化亚基的结合，同时也阻碍了端粒酶RNA模板区与端粒DNA之间的结合，从而影响端粒酶活性，抑制了细胞的增殖。     

转录因子JunB在肝癌细胞中的表达、定位及其转录作用研究

目的:构建表达转录因子JunB的真核表达质粒,观察外源JunB分子在细胞中的表达、亚细胞定位及其对下游分子的转录调控作用。方法:采用PCR方法从人源肝cDNA文库中扩增JunB基因片段,克隆入T载体进行测序鉴定。而后将测序正确的基因片段分别亚克隆入pcDNA3.1(-)和pEGFP-C3真核表达载体中,获得重组载体pcDNA-JunB和pEGFP-JunB。采用脂质体瞬时转染法分别将pEGFP-JunB和pcDNA-JunB导入肝癌细胞HepG2中,用Westernblot法观察外源JunB在肝癌细胞中的表达;用荧光显微镜观察其在细胞内的定位;用双荧光素酶报告基因检测法观察JunB对下游靶分子VEGF的转录调控作用。结果:分别构建表达转录因子JunB和增强型绿色荧光蛋白融合JunB分子的重组表达质粒,并经KpnI/BamHI双酶切鉴定正确。将重组表达质粒转染HepG2细胞后,经免疫印迹法和荧光显微镜检测,可见外源导入的JunB分子在细胞中成功表达并特异性定位定位于细胞核内。荧光素酶报告系统检测显示:JunB对VEGF分子在转录水平具有明显的激活作用。结论:成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因和转录因子JunB基因融合表达的重组质粒。在肝癌细胞中观察到外源瞬时表达的JunB定位于细胞核中,提示其可能发挥转录因子的活性。报告基因结果显示其对肿瘤血管生成密切相关的分子VEGF发挥转录激活的作用,提示JunB分子有可能成为抑制肝癌血管生成的新靶点。     

人CYP450 2E1异源性表达模型的建立及底物的表达诱导作用

目的:探讨化学致癌物二亚硝基哌嗪(DNP)对人CYP2E1异源表达的诱导作用。方法:脂质体介导法将外源人CYP2E1cDNA导入NIH3T3细胞,G418筛选后挑取克隆,Southernblot鉴定外源基因的整合,用不同浓度乙醇和DNP处理阳性克隆,RT-PCR和Westernblotting检测各组细胞CYP2E1表达水平。结果:获得二个具有外源基因CYP2E1cDNA整合及稳定表达的细胞克隆;随着乙醇和DNP处理浓度的提高,细胞CYP2E1mRNA和蛋白质水平的表达增强。结论:DNP与乙醇能稳定诱导CYP2E1异源表达,其作用可能与其mRNA转录增强有关;DNP致癌可能与CYP2E1对其原位代谢活化相关。     

影响外源性基因在体内表达的因素

将重组的外源基因直接注入血管、骨骼肌、心肌、肝脏等组织,或将导入外源基因的中介细胞回输体内都可以表达出所需要的蛋白质。重组基因的载体、组成、注入途径、溶液类型及用量,组织器官的状态,动物年龄等均影响外源性基因在体内的表达。了解这些影响因素,有助于控制基因在体内表达,为基因治疗应用于临床奠定基础。     

微小隐孢子虫Cpgp40/15基因DNA疫苗表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

将微小隐孢子虫Cpgp4015基因定向克隆到真核表达载体pVAX1中多克隆位点XbaⅠ和PstⅠ之间,经酶切鉴定,构建真核表达重组质粒pVAX1-Cpgp4015,用脂质体介导法将其转染Hela细胞,并用G418加压筛选,后经SDSPAGE和Westernblot方法检测外源基因Cpgp4015的表达情况,得到预期大小的蛋白带,表明该重组质粒能够在哺乳动物细胞中较好地表达。     

基因疗法的新载体

欧美的一些研究人员已研制出可以把外在克隆基因导入哺乳动物细胞的新载体,这些载体保证所导入的基因在宿主细胞内表达。该成就使基因疗法的前景得到改观。许多遗传病是单基因缺陷所致,基因疗法则是用正常基因的拷贝取代缺陷基因。某     

基因工程

基因工程（genetic engineering）是生物工程的一个重要分支,它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术,是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内,     

Ad-LIF-OSM双基因转染饲养细胞对脐血造血细胞体外增殖和分化的影响

目的 构建表达人白血病抑制因子(LIF)和抑瘤素M(OSM)双基因的WI-38人胚肺成纤维细胞,并以此细胞作为饲养层细胞观察其对CD34+.造血干/祖细胞体外增殖和分化的影响.方法 以双启动子转移载体pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoterΔ为基础,将OSM基因片段酶切后插入,构建出转移质粒pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoterΔ -OSM.将构建正确的转移质粒与腺病毒骨架质粒共转化,获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter△-OSM,通过包装,收获重组腺病毒(AdLIF-OSM).将重组腺病毒感染饲养层细胞,经RT-PCR、ELISA法检测外源基因在细胞中的表达;体外与CD34+造血干/祖细胞共培养后,通过Transwell法和细胞计数检测,比较各实验组干/祖细胞体外扩增与分化情况.结果 测序结果显示重组载体中的LIF和OSM基因序列正确;转基因饲养层细胞中能检测到外源LIF和OSM基因的转录和表达;外源LIF和OSM基因在造血干/祖细胞体外培养中能够发挥作用.结论 成功构建携带人LIF和OSM的双基因重组腺病毒载体(Ad-LIF-OSM),Ad-LIF-OSM在造血干/祖细胞体外培养的过程中能够有效地扩增CD34+造血干/祖细胞,并延缓其分化.