人原发性肝癌中多种基因CpG岛甲基化研究进展

在表观遗传学(epigenesis)这个发展非常快的领域，DNA甲基化，组蛋白去乙酰化和RNA介导是基因沉默(silencing)的三大主要原因。在人类基因组DNA中，约3％～4％的胞嘧啶碱基以5-甲基胞嘧啶形式存在，结果导致在人类正常组织细胞DNA中，5-甲基胞嘧啶占所有核甘酸碱基的0．75％～1％。大约70％～80％的5-甲基胞嘧啶存在于CpG序列中，CpG二核甘酸集中的区域称之为CpG岛，这部分通常是未甲基化，     

人肠癌RKO细胞周期依赖性激抑制因子基因启动子区甲基化状态的研究

目的 探讨人结肠癌RKO细胞周期依赖性激酶抑制因子(CKIs)家族启动子区CpG岛甲基化状态及其甲基化可逆性特征.方法 应用特异性DNA甲基转移酶(DNMTs)抑制剂5-Aza-2]-deoxycytidine(5-Aza-CdR)处理肠癌细胞,甲基特异性聚合酶链反应(Methylation-Specific PCR,MSP)、T-A克隆及DNA测序法分析RKO细胞CKIs家族抑癌基因p15ink4b、p16ink4a/CDKN2、p21/cip、p27/kip启动子CpG岛甲基化状态.结果 未经5-Aza-CdR作用的肠癌RKO细胞,其p15ink4b、p16ink4a/CDKN2基因组DNA胞嘧啶(C)保持不变,这提示在其单链DNA中胞嘧啶呈甲基化状态;而经5-Aza-CdR作用的肠癌RKO细胞,其p15ink4b、p16ink4a/CDKN2、p21/cip和p27/kip基因组DNA胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶,表明在DNA单链中胞嘧啶已呈去甲基化状态.结论 肠癌RKO细胞周期INK4家族(p15ink4b和p16ink4a/CDKN2)基因的启动子区处于异常的高甲基化状态,而KIP/CIP家族(p21/cip和p27/kip)基因未处于高甲基化状态;5-Aza-CdR能较好地逆转肿瘤细胞INK4家族基因DNA高甲基化状态.     

结直肠癌DNA甲基化研究的现状

DNA胞嘧啶甲基化的改变包括基因组DNA低甲基化和基因启动子区域CpG岛过甲基化。我们曾经对肿瘤DNA甲基化作过较详细的综述[1] 。结直肠癌的DNA甲基化研究较深入 ,进展较快。现对近年来结直肠癌DNA甲基化的一些研究现状作一简介。1.结直肠癌基因组DNA低甲基化 :有研究表明 ,与正常结肠黏膜相比 ,结直肠癌基因组DNA低甲基化[2 ] 。低甲基化可引起癌基因如c myc活化 ,也可导致核型不稳定 ,参与肿瘤的发生。结肠息肉和侵袭性结肠癌的低甲基化程度无明显差别 ,似乎表明肿瘤低甲基化并未参与肿瘤的进展[3 ] 。但另一方面 ,在小鼠肠肿瘤…     

结直肠癌环氧化酶-2、错配修复酶-1微卫星不稳定与基因调控的关系

目的 检测临床手术切除42例结直肠癌及相应正常组织环氧化酶-2(COX-2)、错配修复酶-1(hMLH1)微卫星不稳定状态(MSI)及二种基因启动子甲基化,探讨它们与结直肠癌发生的关系.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术检测5个位点的MSI状态;甲基化特异性PCR(MSP)方法检测结直肠癌及正常组织COX-2、hMLH1二种基因启动子CpG岛甲基化状态.结果 42例结直肠癌中MSI总检出率为42.86%(18/42),5个位点的MSI检出率差异无统计学意义(P＞0.05).COX-2和hMLH1基因启动子CpG岛甲基化在42例结直肠癌中分别有13例和15例.MSI-H组中COX-2基因启动子CpG岛甲基化8例,且有6例结直肠癌同时出现hMLH1和COX-2基因启动子CpG岛甲基化.结论 MSI结直肠癌hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率高于MSS结直肠癌,hMLH1基因启动子CpG岛甲基化有助于判断肿瘤类型.     

5-氮-2′-脱氧胞苷对RKO结肠癌细胞株maspin基因去甲基化的转录调节作用

目的探讨 DNA5′ CpG岛去甲基化对 RKO结肠癌细胞株 maspin基因的转录调控作用及对细胞株生长增殖的生物学影响 ,寻找抗癌治疗的新靶点.方法应用甲基化特异性 PCR(methylation specific PCR, MSP)检测 RKO结肠癌细胞株 maspin基因核心启动子区 CpG岛甲基化情况;用特异性 DNA甲基转移酶抑制剂 5-氮- 2′-脱氧胞苷 (5- aza- 2′- deoxycytidine, 5- aza- CdR)作用结肠癌细胞株 72 h后 ,逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)检测 maspin mRNA表达,四唑盐 (MTT)比色、流式细胞仪检测用药前后 RKO细胞株生长存活率和细胞周期的变化.结果 RKO结肠癌细胞株 maspin基因核心启动子区存在 CpG岛甲基化.与对照组相比, 3组不同浓度 5- aza- CdR作用后, maspin基因 mRNA表达分别增加了 10.89、 16.91和 23.97倍,明显抑制肿瘤细胞生长,阻滞细胞周期于 G0/G1期, 诱导细胞凋亡, 凋亡率分别为 5.17%、 8.71%和 11.23%.结论 RKO结肠癌细胞株 maspin基因 5′端核心启动子甲基化可能是导致该基因表达沉默的主要原因;特异性甲基转移酶抑制剂 5- aza- CdR能较好地逆转 RKO细胞 DNA异常甲基化,并有效地激活因高甲基化所致 maspin基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡.     

5-氮-2''''-脱氧胞苷对RKO结肠癌细胞株maspin基因去甲基化的转录调节作用

目的探讨DNA5'CpG岛去甲基化对RKO结肠癌细胞株maspin基因的转录调控作用及对细胞株生长增殖的生物学影响,寻找抗癌治疗的新靶点。方法应用甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR,MSP)检测RKO结肠癌细胞株maspin基因核心启动子区CpG岛甲基化情况;用特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-CdR)作用结肠癌细胞株72h后,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测maspinmRNA表达,四唑盐(MTT)比色、流式细胞仪检测用药前后RKO细胞株生长存活率和细胞周期的变化。结果RKO结肠癌细胞株maspin基因核心启动子区存在CpG岛甲基化。与对照组相比,3组不同浓度5-aza-CdR作用后,maspin基因mRNA表达分别增加了10.89、16.91和23.97倍,明显抑制肿瘤细胞生长,阻滞细胞周期于G0/G1期,诱导细胞凋亡,凋亡率分别为5.17%、8.71%和11.23%。结论RKO结肠癌细胞株maspin基因5'端核心启动子甲基化可能是导致该基因表达沉默的主要原因;特异性甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR能较好地逆转RKO细胞DNA异常甲基化,并有效地激活因高甲基化所致maspin基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡。     

散发性结直肠癌CpG岛甲基子表型和基因组遗传学不稳定性的关系

目的探讨散发性结直肠癌CpG岛甲基子表型和基因组不稳定性的关系。方法对采用甲基化特异性PCR的方法对71例散发性结直肠癌组织进行P14^ARF、hMLH1、P16^INK4a、MGMT和MINT1共5个基因启动子甲基化的检测,确定CpG岛甲基子表型;选择BAT25和BAT26两个位点进行微卫星不稳定检测和流式细胞术检测分析倍体类型;分析散发性结直肠癌中CpG岛甲基子表型和微卫星不稳定、染色体不稳定的关系。结果全组结直肠癌组织中CpG岛甲基子表型的阳性率为21.1%（15/71）;微卫星不稳定的阳性率为9.9%（7/71）;异倍体的阳性率为73.5%（50/68）。CpG岛甲基子表型阳性者,微卫星不稳定的阳性率高于阴性者（20.0%vs7.1%）,但差异无统计学意义（P=0.158）。hMLH1基因启动子甲基化阳性者微卫星不稳定的比例为57.1%,高于阴性者的4.7%（P=0.001）。CpG岛甲基子表型阳性者二倍体的比例高于阴性者（61.5%vs.18.2%,P=0.003）。结论CpG岛甲基子表型阳性的散发性结直肠癌具有显著的二倍体倾向,多基因同时甲基化和染色体不稳定可能是两种相互独立的基础性发病机制。     

凋亡蛋白酶活化因子-1基因甲基化在骨肉瘤细胞株中的作用

目的 检测骨肉瘤细胞株中凋亡蛋白酶活化因子(APAF)-1基因启动子区域甲基化状态及该基因mRNA表达,观察APAF-1基因对骨肉瘤形成的影响.方法 以骨肉瘤细胞株MG63和Hs888T为研究对象,提取DNA,经重亚硫酸钠处理后,采用限制性酶切图谱分析(COBRA)检测APAF-1基因CpG岛的甲基化情况,使用不同浓度(0、1×10~(-7)、3×10~(-7)mol/L)的DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理骨肉瘤细胞株4、10、20d,采用实时定量聚合酶链反应(QT-PCR)检测Apaf-1 mRNA表达水平的变化.结果 在Hs888T细胞株中APAF-1基因存在CpG岛甲基化并且随着5-Aza-CdR浓度的增加Apaf-1 mRNA表达水平也在增加.3×10~(-7)mol/L的5-Aza-CdR处理Hs888T细胞株20 d与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 Hs888T细胞株中APAF-1基因异常表达与APAF-1基因启动子区域CpG岛甲基化有关,提示APAF-1基因甲基化可能参与某些骨肉瘤的发生.     

肝细胞癌抑癌基因和癌基因甲基化水平的检测及意义

目的:探讨DNA甲基化异常在肝癌发展中的作用.方法:应用甲基敏感的限制性内切酶及Southern杂交技术对18例肝细胞癌抑癌基因Rb、17p13.3位点基因CpG岛和癌基因c-myc3′端散在CpG的甲基化状态进行了检测.结果:1例肝透明细胞癌和41.7%(5/12)肝细胞癌分别存在Rb基因和17p13.3位点基因CpG岛的高甲基化;而c-myc基因3′端散在形式的CpG岛的甲基在61%的肝癌发生不同程度的丢失,这种高和低甲基化状态可同时存在于同一病例.甲基化异常可发生在早期肝癌并随肿瘤进展而加重.结论:本实验结果表明:肝细胞癌存在严重的DNA甲基化紊乱,可能是抑癌基因失活和癌基因激活的重要因素.     

乳腺癌WWOX基因表达缺陷的意义及其与CpG岛甲基化的关系

目的 研究WWOX蛋白在乳腺癌组织和细胞系中的表达变化,分析其与WWOX基因启动子和第一外显子CpG岛甲基化的关系.方法 应用免疫组织化学染色检测乳腺癌组织和细胞系中WWOX蛋白表达,采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)分析乳腺癌组织和细胞系中WWOX基因CpG岛甲基化状况.结果 32.2%的乳腺癌组织和5.4%正常乳腺组织中WWOX蛋白表达缺失,差异有统计学意义(P＜0.01).乳腺癌组织WWOX表达异常与绝经后状态(P＜0.01)关系密切.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者中WWOX蛋白表达缺失的比例分别为23.1%、28.6%和46.2%.55%的乳腺癌组织WWOX启动子CpG岛甲基化扩增,45%的乳腺癌组织WWOX第一外显子CpG岛甲基化扩增,癌旁组织中未出现CpG岛甲基化扩增.MDA-MB-231细胞WWOX基因CpG岛完全甲基化,而MCF-7细胞无甲基化产物扩增.结论 乳腺癌中广泛存在着WWOX基因CpG岛甲基化,是WWOX表达缺陷的重要机制,并且可能通过性激素受体信号途径在乳腺癌的发生、发展中发挥作用.     

肝癌患者E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究

目的探讨抑癌基因E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化与人原发性肝癌(简称肝癌)发生、发展的关系,及其在肝癌早期诊断中的意义。方法用巢式甲基化特异性PCR对34例肝癌患者的癌组织、距离癌灶边缘>3 cm的远癌组织及10例未发生肝癌的肝硬变患者的肝硬变组织中E-cadherin基因启动子区CpG岛的甲基化状态进行检测。结果 E-cadherin基因启动子区CpG岛甲基化阳性率,在34例肝癌组织中为61.76%(21/34),明显高于远癌组织中的29.41%(10/34),P<0.05;在10例无肝癌的肝硬变组织中为50.00%(5/10),与肝癌组织和远癌组织比较差异均无统计学意义(P>0.05);在4例正常肝组织中均为甲基化阴性。联合检测癌组织E-cadherin基因CpG岛甲基化与血清甲胎蛋白两种分子标志物,肝癌的检出率可达82.35%。结论抑癌基因E-cadherin启动子区CpG岛甲基化可能在肝癌的发生、发展中起到重要作用,并且可能是早期事件,其在肝癌的临床诊断及治疗中的意义值得进一步深入研究。     

脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态研究

目的 检测脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态,探讨其在肿瘤发生中的作用.方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法,检测51例脑胶质瘤标本及人脑胶质瘤U251细胞株的hMLH1、hMSH2基因启动子C_PG岛甲基化状态.结果 在7例正常脑组织中,用MSP法检测的hMLH1、hMSH2基因启动子区均未发现甲基化,51例脑胶质瘤组织中,hMLH1、hMSH2甲基化率分别为13.7%(7/51)、35.3%(18/51),且为甲基化和非甲基化共存,人脑胶质瘤U251细胞中未发生hMLH1启动子甲基化,而发生了hMSI-12启动子甲基化,hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化与性别、年龄、病理类型无明显相关.但hMLH1在低级别(Ⅰ～Ⅱ级)患者标本中甲基化率为0.0%(0/25),高级别(Ⅲ～Ⅳ级)患者标本中甲基化率为26.9%(7/26),差异有统计学意义(χ~2=5.69,P<0.05).结论 hMLH1、hMSH2基因启动子区甲基化状态与性别、年龄、病理类型无明显相关.hMSH2基因启动子区的CpG岛在脑胶质瘤中有中等频率的甲基化,是脑胶质瘤发生过程中的早期事件,可能与脑胶质瘤的发生相关;脑胶质瘤中hMLH1基因启动子区甲基化率较低,但hMLH1启动子区甲基化状态与病理分级有关;人脑胶质瘤U251细胞株中hMSH2基因启动子C_PG岛高甲基化.     

DNA甲基转移酶1、3b基因在肾癌的表达

肾细胞癌是我国泌尿系统常见的肿瘤之一.肿瘤的发生与抑癌基因的失活有关,研究发现,抑癌基因甲基化是其失活的重要机制之一.甲基化并不使基因序列发生改变,而是使抑癌基因转录失活,表达受抑制,导致肿瘤形成.DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(Dnmt)催化,将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶[1].人类Dnmt在CpG岛甲基化过程中至少有Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b参与[2,3].Dnmt1和Dnmt3b是DNA甲基化的关键酶,其表达直接影响着DNA甲基化状态[4].本研究采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Dnmt1、Dnmt3b mRNA在肾细胞癌组织及正常肾组织中的表达,并探讨其表达的临床意义.     

BNIP3基因甲基化与早期结直肠癌患者临床病理特征的关系

目的分析早期结直肠癌组织中BNIP3基因启动子区CpG岛甲基化与患者临床病理特征的关系,评价其在结直肠癌发生发展中的作用。方法用甲基化特异性PCR技术分析107例早期结直肠癌患者肿瘤组织中BNIP3基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果本组结直肠癌组织标本中BNIP3基因启动子区CpG岛甲基化阳性率为58.9%(63/107)。右半结肠组肿瘤组织中BNIP3基因甲基化明显高于左半结肠组(P<0.001);低分化组明显高于高中分化组(P=0.002)。BNIP3基因甲基化在患者性别、年龄、肿瘤大小和分期等分组间无明显差异。结论早期结直肠癌组织中存在BNIP3基因启动子区CpG岛甲基化。BNIP3基因高甲基化与早期结直肠癌部位和分化程度密切相关。     

先天性小耳畸形全基因组甲基化谱的研究

目的 筛查先天性小耳畸形患者整个基因组存在甲基化水平异常的CpG岛和CpG位点及其相关差异基因,进而探讨基因甲基化水平的异常与先天性小耳畸形发病之间的关系.方法 收集2009年7月至2010年12月先天性小耳畸形患者术中废弃的残耳软骨组织为研究对象共50例(实验组),非耳畸形(耳外伤)患者的正常耳软骨组织34例作为对照.应用Nimblegen CpG启动子芯片,对实验组3例及对照组3例样本的基因组DNA进行全基因组28 226个CpG岛扫描,筛选存在CpG岛甲基化水平差异的基因;应用SpectroCHIP芯片对实验组47例,对照组31例的差异基因的CpG岛进行各个CpG位点的检测,筛选出存在甲基化水平差异的CpG位点.结果 实验组与对照组在全基因组范围内存在36个具有甲基化水平差异的CpG岛,其中有29个与已命名的29个基因相关.经t检验分析,在COL18A1、MYH14、RBMY1A1、ZIC3这4个差异基因的6个CpG位点,2组甲基化水平差异具有统计学意义(P＜0.05),实验组和对照组甲基化水平分别为:COL18A1_2_CpG_17 0.978 3±0.023 5、0.952 6±0.058 9;MYH14_CpG_17 0.960 0±0.041 4、0.928 4±0.0655;RBMY1A1_1_CpG_3.4 0.996 6±0.005 5、0.991 4±0.006 9;RBMY1A1_1_CpG_13 0.964 8±0.011 8、0.975 7±0.012 7;ZIC3_3_CpG_15 0.086 7±0.021 2、0.054 3±0.039 9; ZIC3_2_CpG_270.377 5±0.181 6、0.472 3±0.043 9.结论 初步建立了先天性小耳畸形甲基化谱,COL18A1、MYH14、RBMY1A1、ZIC3基因甲基化水平差异可能与小耳畸形的发病相关.     

p16基因甲基化在乳腺癌发展中的作用

目的 研究p16基因甲基化在乳腺癌中的分布情况,并探讨其与乳腺癌发生、发展的关系.方法 采用甲基化特异的PCR技术检测四川省肿瘤医院乳腺科2008年3～9月期间收治的38例原发性乳腺癌组织及距离肿瘤>5 cm以远的正常乳腺组织中p16基因启动子区CpG岛甲基化频率.结果 乳腺癌组织中p16基因启动子区CpG岛甲基化频率[31.6%(12/38)]明显高于其正常乳腺组织[5.3%(2/38)],差异有统计学意义(P=0.003).有淋巴结转移的乳腺癌患者中p16基因甲基化频率[45.5%(10/22)]高于无淋巴结转移患者[12.5%(2/16)],差异有统计学意义(P=0.044).结论 p16基因启动子区CpG岛甲基化可能在乳腺癌发生、发展过程中起着重要作用.     

散发性肝外胆管癌中RASSF1A基因启动子甲基化状态的研究

目的　检测肝外胆管癌组织中RASSF1A基因启动子甲基化及各CpG位点甲基化发生率。方法　采用甲基化特异性聚合酶链反应 (MS PCR)和半巢式PCR对RASSF1A基因启动子区域进行扩增 ,并对扩增产物克隆测序。结果　在全部 48例肝外胆管癌组织中 ,RASSF1A基因启动子区域存在CpG位点甲基化现象的共 2 8例 ,16个CpG位点甲基化平均发生率为 42 .45 % ,明显高于对照组 (χ2 =11.77,P <0 .0 1)。结论　RASSF1A基因启动子区域CpG岛甲基化是RASSF1A失活的主要机制 ,在肝外胆管癌的发生过程中发挥重要作用。     

5-氮-2’-脱氧胞苷对RKO结肠癌细胞株maspin基因去甲基化的转录调节作用

目的 探讨DNA5’CpG岛去甲基化对RKO结肠癌细胞株maspin基因的转录调控作用及对细胞株生长增殖的生物学影响，寻找抗癌治疗的新靶点。方法 应用甲基化特异性PCB（methylation specific PCR，MSP）检测RKO结肠癌细胞株maspin基因核心启动子区CpG岛甲基化情况；用特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2＇-deoxycytidine，5-aza-CdR）作用结肠癌细胞株72h后，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测nlaspin mRNA表达，四唑盐（MTT）比色、流式细胞仪检测用药前后RKO细胞株生长存活率和细胞周期的变化。结果 RKO结肠癌细胞株maspin基因核心启动子区存在CpG岛甲基化。与对照组相比，3组不同浓度5-aza-CdR作用后。maspin基因mRNA表达分别增加了10．89、16．91和23．97倍。明显抑制肿瘤细胞生长，阻滞细胞周期于G0／G1期，诱导细胞凋亡，凋亡率分别为5．17％、8．71％和11．23％。结论 RKO结肠癌细胞株maspin基因5’端核心启动子甲基化可能是导致该基因表达沉默的主要原因；特异性甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR能较好地逆转RKO细胞DNA异常甲基化，并有效地激活因高甲基化所致maspin基因沉默的再转录，诱导该基因表达，从而抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡。     

RASSF1A基因在肝癌中表达失活的研究

最新研究进展揭示，抑癌基因功能的抑制或失活，除了与基因片段的丢失，DNA序列的错位、缺失、重组、变换、点突变等机制相关外，还与DNA序列中CpG岛（CpG island）中胞嘧啶（C）碱基环上发生的甲基化（^mCpG）有极其重要的相关性。RASSF1A基因（RAS association domain family 1 Agene）这一由Dammann等发现并命名的基因，在原发性肝癌中的表达情况则未有报道。     

先天性小耳畸形EYA1基因启动子区域甲基化初步研究

目的 探讨先天性小耳畸形EYA1基因启动子区域CpG岛甲基化状态.方法 应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术,检测了64例先天性小耳畸形患者和36例健康对照的EYA1基因启动子区域CpG岛甲基化情况.结果 先天性小耳畸形患者EYA1基因的CpG_Unit3和CpG_Unit5甲基化程度分别为0.092 58±0.033 846和0.092 2±0.023 79,与健康对照相比明显降低,其差异具有统计学意义(P=0.001和0.019).结论 先天性小耳畸形存在EYA1基因低甲基化情况,可能与该病的发生发展相关.