人骨髓基质干细胞克隆对脐血造血干细胞体外扩增作用的研究

目的：探讨人骨髓基质干细胞的克隆化培养及其对体外造血干细胞扩增的影响。方法：取正常肋骨分离骨髓，制备单个核细胞贴壁培养，约5d后取集落样生长的梭形细胞扩增培养，传代、将分选的脐血造血干／祖细胞接种到克隆培养的人骨髓基质干细胞及其他培养条件液上，比较不同培养条件及不同代次骨髓基质干细胞对造血干／祖细胞扩增能力及集落形成能力的影响。结果：人骨髓基质干细胞能扩增达20代以上，经流式细胞仪检测证实基质干细胞，单纯细胞因子组和细胞因子加基质干细胞组能有效扩增造血细胞，而后者有维持长期造血的作用。结论：该克隆培养方法能有效扩增骨髓基质干细胞，培养的细胞有体外支持长期造血的作用。     

脐带血来源基质细胞培养及造血微环境的建立

目的：研究脐带血来源的基质细胞对脐血CD34⁺ 细胞体外扩增的促进作用。 方法：应用MACS磁珠分离系统分离脐血CD34⁺细胞，通过细胞因子对脐血前体基质细胞体外诱导，使其产生基质细胞和形成造血微环境。观察基质细胞的生长状态和细胞表面分子的表达，并建立以该基质细胞为滋养层的脐血造血干细胞体外扩增体系。结果：细胞因子联合培养对CFU-GM增长没有明显影响，但对于CFU-E的形成和细胞增长的影响细胞因子组和细胞因子+基质细胞组所培养的CPU-E与对照组比较差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01 ）。脐带血来源的基质细胞分泌细胞因子的时间-效应曲线显示，脐血基质细胞培养3、7、10、14和20 d后，TPO、SCF浓度在培养第7天时达到最高，而GM-CSF在第7天以后则逐渐降至最低。在脐血基质细胞作为滋养层的扩增体系中，加入相应的细胞因子可以使脐血造血细胞明显扩增，其中细胞因子(SCF+IL-3+EPO+TPO+GM-CSF)联合基质细胞培养体系的扩增作用最强。结论： 应用细胞因子可以体外培养脐血前体基质细胞产生脐血基质细胞,并可在该基础上形成造血微环境支持体外造血。     

人骨髓间充质干细胞对脐血干细胞体外扩增支持作用的研究

目的：探讨以人骨髓间充质干细胞(bone nlarrow-mesenchymal stem cells，BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(cord blood stem cells，CBSC)，研究BM—MSC支持造血的功能，以能最终用于临床。方法：用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、fit3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G—CSF)的无血清培养液，比较有或无MSC条件下，体外扩增脐血CD34^ 细胞两周后检测总细胞TC、CD34^ 细胞、集落形成单位(CFU)和长期培养-起始细胞(LTC—IC)增加倍数。结果：在TPO、FL、SCF、和G-CSF的作用下，经两周体外扩增后有MSC组的TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C和LTC—IC数较起始分别增加了427、39、125、104和16倍。单纯用上述4种细胞因子的无MSC组，TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C数分别增加了62、11、25、24倍，但LTC-IC只有扩增前的0．8倍。结论：以人BM—MSC为基质的无血清体外培养体系可以更有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值。     

脐血造血细胞的体外扩增及其意义

目的探讨脐血干细胞在体外扩增中的增殖效应，为脐血干细胞移植提供实验理论依据。方法用分离的脐血单个核细胞（ＭＮＣ）体外在细胞因子的作用下培养扩增，并用流式细胞仪对扩增前后的细胞增殖周期和ＣＤ３４＋细胞及亚群进行动态检测。结果脐血ＭＮＣ在体外培养５周，有核细胞数累计增加了２５２倍，ＣＤ３４＋细胞增加了５０倍，ＣＤ３３＋细胞增加２８０倍，ＣＤ１９＋、ＣＤ３＋细胞２周后便检测不出。细胞增殖周期分析显示，培养第一周，Ｇ０期细胞迅速减少，Ｓ期细胞比例很快增多。结论单只脐血在细胞因子的作用下体外扩增后完全可以满足体重５０公斤以上的成人移植之需，但选择恰当的扩增时间及制定更好的扩增策略将是非常重要的。     

不同细胞因子对脐血CD34+细胞扩增的影响

目的探讨不同细胞因子促进脐血CD34 细胞扩增的效应,为下一步的临床应用奠定基础。方法采用EasySep免疫磁珠阳性选择系统分离脐血中CD34 细胞,在无血清、无基质细胞培养体系中添加不同细胞因子培养2周,分组:A组,SCF FL TPOB组,SCF FL TPO IL-3C组,SCF FL TPO G-CSF。结果CD34 细胞数目于培养后7d达到峰值,3组间差异无显著性;B组扩增至14d时细胞总数达(384.40±17.48)倍,显著高于另外2组。扩增7d后的脐血细胞经体外培养可形成造血集落。结论体外扩增脐血CD34 细胞理想的细胞因子组合为SCF TPO FL,以7d为宜。     

基质细胞对小鼠骨髓单个核细胞体外扩增的促进作用

目的 阐明基质细胞在造血细胞体外扩增中的作用。方法 采用骨髓基质细胞培养、骨髓单个核细胞（BMMNC）体外液体培养和各种造血相细胞集落培养技术,进行基质细胞支持条件下骨髓单个核细胞体外扩增的研究,并与单纯细胞因子支持下的细胞扩增进行比较。结果 在照射后细胞层存在的条件下,同时含有细胞因子组合的培养体系,对细胞总数和集落形成细胞数的扩增作用明显高于其它各组。结论 基质细胞对细胞因子作用下的造血细胞体外扩增有明显的促进作用。     

胎盘问充质干细胞对骨髓、脐血、胎盘不同来源造血干细胞的体外扩增支持作用比较

目的研究胎盘间充质干细胞（PDMSC）对骨髓、脐血、胎盘来源的CD34^＋造血干细胞体外扩增的支持作用。方法用酶消化方法从胎盘组织分离出贴壁细胞。流式细胞仪测定。用免疫磁珠法从骨髓、脐血、胎盘的单个核细胞里分离出CD34^＋细胞,建立以HPDMSC饲养层的CD34^＋细胞培养体系,并以无饲养层的培养体系作为对照。结果人胎盘中可以分离出hpdmscs,并可以证明其为间充质干细胞。以HPDMSCS作为以上三种来源的造血干细胞的滋养层,对胎盘来源的造血干细胞支持作用明显优于其他两组,脐血次之,骨髓来源的造血干细胞最差。结论胎盘间充质干细胞具有体外造血支持作用,可以作为骨髓、脐血、胎盘不同来源造血干细胞体外扩增的滋养层,尤其适于胎盘来源的造血干细胞。     

骨髓基质饲养层对精原干细胞体外培养的影响

目的以原代培养小鼠骨髓基质细胞为饲养层，探讨精原干细胞能否在该饲养层上生长及生长的影响因素。方法采用原代培养的小鼠骨髓基质细胞，待细胞长成单层后用丝裂霉素C处理并接种生精细胞共培养。结果原代的小鼠培养骨髓基质细胞能很好的维持精原干细胞的非分化性扩增。结论小鼠原代培养的骨髓基质细胞能作为饲养层支持精原干细胞体外非分化性扩增，该细胞有望成为干细胞培养的新的饲养层。     

精原干细胞体外非分化扩增的初步研究

目的探讨精原干细胞体外非分化性扩增的影响因素。方法采用昆明系小白鼠骨髓基质细胞原代培养,待细胞长成单层后经丝裂霉素C处理,作为精原干细胞培养的饲养层,细胞在37℃环境下培养。结果接种后2～4d,精原干细胞数明显增加,细胞单个、成双或成群,非精原干细胞开始出现崩解死亡;接种4～8d,精原干细胞增殖不明显,处于相对静止期;接种10d后,又开始出现明显的分裂增殖,15d已具有精原干细胞特征,继续培养25d,细胞形态未见明显改变,胞质桥仍明显。结论精原干细胞能在37℃环境温度下,在以骨髓基质饲养层上保持良好非分化性扩增。     

小鼠骨髓内皮细胞对脐血造血细胞体外扩增的作用

目的：观察骨髓内皮细胞对脐血造血细胞体外扩增的影响。方法：体外培养骨髓内皮细胞株细胞,收集无血清条件培养液（命名为ECM）。用MiniMACS磁珠法分离脐血CD34+细胞。检测CD34+细胞经ECM体外液体培养24 h后或与骨髓内皮细胞层(ECL)共培养24 h后脐血造血细胞的扩增倍数,并观察在加入bFGF的培养条件下收集的骨髓内皮细胞条件培养液（bFGF-ECM）是否能加强对脐血造血细胞的扩增作用。 结果：ECM,ECL 皆能显著扩增脐血早期或晚期造血细胞,且二者对早期造血细胞的扩增效果是类似的;bFGF-ECM对脐血造血细胞的扩增倍数明显高于用ECM扩增的倍数。结论：小鼠骨髓内皮细胞对脐血造血细胞有明显的体外扩增作用。     

Transwell培养体系中人AGM区基质细胞支持脐血CD34+细胞造血

[目的]探讨Transwell系统中人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐带血造血干/祖细胞的造血能力长期维持及扩增的作用.[方法]采用免疫磁珠方法分离人脐带血CD34 细胞,接种于底层铺有人AGM区基质细胞的Transwell培养板的Inserts中,非接触共培养7～35 d,每星期取样检测细胞总数,用半固体培养基分析CFU-C及HPP-CFU集落形成数,流式细胞术检测CD34 、CD34 CD38-细胞百分率.[结果]在Transwell中非接触共培养条件下,人AGM区基质细胞培养体系较胚胎躯干基质细胞和无饲养层培养体系对有核细胞总数、CFC和CD34 细胞均具有明显的扩增作用,共培养14 d的CD34 、CD34 CD38-造血干/祖细胞均获得峰值扩增(2.62±0.8和2.15±1.04,P<0.05),而MNC总数和CFC均在21 d获得最大扩增(32.5±4.3和4.2±0.6倍,P<0.05).克隆分析发现CFU-Mix、CFU-GM、BFU-E在共培养4～5星期后均仍然可见.原始祖细胞HPP-CFC在3星期也得到2.23倍的扩增,较空白及hFT对照组均有显著性差异(P<0.05),并在共培养35 d后仍可见HPP-CFU集落形成.[结论]人AGM区基质细胞hAGM-S3/hAGM-S4均具有造血支持作用,在非接触共培养条件下中可长期维持脐血中造血干/祖细胞的多系造血能力和高增殖潜能达21～35 d,对脐血CD34 /CD34 CD38-细胞数也有一定程度的扩增作用.     

重组人Jagged 1蛋白促进细胞因子对脐血干细胞的扩增

目的 探讨重组人Jagged 1蛋白对脐血干细胞体外扩增的促进作用。 方法 利用免疫磁珠法分离人脐带血CD34+细胞,并将其分为4组,分别在 ① 不加入任何生长因素、② Jagged 1蛋白、③ TPO、SCF和Flt-3以及④ Jagged 1蛋白、TPO、SCF和Flt-3条件下进行培养;培养6 d后,通过台盼蓝染色和MTT等方法检测各组细胞的生长状况;同时采用RT-PCR方法检测干细胞表面标志物CD34的表达情况。结果 以上4组细胞在体外增殖6 d后的细胞浓度分别为0.4±0.1、1.3±0.5、5.0±0.8和10.2±1.5（x104/ml）;RT-PCR检测显示,各组细胞扩增6 d 后均有CD34表达。结论 Jagged 1蛋白能够促进细脐血干细胞的体外扩增,而且Jagged 1蛋白与其他促进细胞增殖的因子配伍对脐血干细胞在体外的扩增作用更加明显。     

人类脐带血MSC和骨髓MSC分泌细胞因子的对比研究

目的比较人类脐带血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞支持造血干细胞分泌生长因子的能力。方法应用EUSA方法,测定两种细胞分泌的干细胞生长因子（Stem cell factor,SCF）,血小板生成素（Thrombopoietin,TPO）和白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）的浓度,并且进行对比。结果人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可分泌TPO、SCF和IL-6等支持造血生长因子。但是相同生长条件下,两种细胞分泌的因子浓度不同。人脐血基质细胞分泌SCF的量（575．7±40．2pg／ml）高于骨髓基质细胞（482．2±17．7pg／ml）,而人脐血基质细胞分泌IL-6（469．7±27．2pg／m1）的量（低于同期培养的骨髓基质细胞（935．19±35．4pg／ml）,人脐血基质细胞TPO分泌的量（195．5±7．3pg/ml）与骨髓基质细胞（172．2±9．3pg/ml）相近。结论人脐血基质细胞与骨髓基质细胞都具有分泌支持造血生长因子的能力,但是分泌量之间有差异。     

高增殖潜能内皮祖细胞促进脐血造血祖细胞体外扩增

目的：研究脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的能力。方法：利用第3代的HPP—EPC联合细胞因子培养脐血造血干／祖细胞,分因子组、非接触培养组和接触培养组。体外培养脐血CD34＋细胞10d后,从细胞总数,CD34＋细胞数,各系造血集落形成细胞数等比较各组的扩增效率。结果：接触组细胞总数扩增倍数（44．6±8．7）倍和非接触组（39．5±7．3）倍均高于因子组（24．8±5．6）倍,P〈0．01。接触组CD34＋细胞数扩增倍数（8．8±2．1）倍高于因子组（2．9±0．6）倍和非接触培养组（3．3±0．6）倍,P〈0．01。接触组集落扩增倍数和非接触组均分别高于因子组,P〈0．05,且接触组各造血集落扩增数均分别高于非接触组,各P〈0．05。接触组扩增后CD34＋CD38＋细胞（10．8％±2．7％）明显高于因子组（4．1％±0．9％）和非接触培养组（3．8％±0．8％）,P〈0．01。结论：脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞能支持脐血CD34＋细胞体外扩增。     

低能量激光与集落刺激因子对人脐带血造血细胞的增殖作用

目的研究低能量激光对人脐带血造血细胞的增殖效应,并探讨其与集落刺激因子（ＣＳＦ）效应的关系。方法用铜蒸气激光照射人脐带血造血细胞,体外培养扩增细胞并计数集落细胞数。结果激光加ＣＳＦ对造血细胞粒细胞巨噬细胞集落形成单位（ＧＭＣＦＵｃ）有协同增殖作用,与单用激光照射组、ＣＳＦ刺激组及对照组相比,差异有非常显著意义（Ｐ＜００１）。将经激光照射与未照射脐血造血细胞在液体培养基中培养２周,前者活细胞数较培养前增加５５～１１０倍,后者增加１１～２７倍,再次软琼脂接种培养,仍有集落形成,生长的集落绝对数较液体培养前显著增加,而且激光照射组比未照射组更明显。结论低能量激光照射脐血细胞是体外扩增造血细胞的一种有效方法。     

银杏叶提取物对兔外周血干细胞动员的影响

目的:探讨银杏叶提取物对兔外周血干细胞的动员作用。方法:30只26²8周龄新西兰大白兔,体重为2.528周龄新西兰大白兔,体重为2.5³.0kg,随机分三组:银杏叶提取物组(Egb)、G-CSF组、生理盐水组,给药方法为腹腔注射7d,1次/d;给药后23.0kg,随机分三组:银杏叶提取物组(Egb)、G-CSF组、生理盐水组,给药方法为腹腔注射7d,1次/d;给药后2⁸d,采用外周血WBC和MNC计数、造血干细胞体外培养、免疫细胞化学等检测各组外周血WBC、MNC、CD34+细胞、CD49d阳性细胞、CFU-GM、CFU-MK、CFU-E的产率及兔骨髓基质细胞中VCAM-1阳性细胞百分率。结果:Egb组给药第7天外周血WBC、MNC数量达到高峰,分别为给药前的3倍和3.5倍;Egb组CD49d阳性细胞、外周血CD34+及骨髓基质细胞的VCAM-1阳性细胞百分率分别为(9.37±3.01)%、(0.63±0.37)%和(48.13±9.84)%,均高于生理盐水组;其中CFU-GM、CFU-MK和CFU-E产率分别为(12.94±3.03)%、(11.49±2.93)%和(24.52±8.62)%,均高于生理盐水组。结论:银杏叶提取物(Egb)对兔骨髓造血细胞有一定的增生作用,同时对外周血干细胞有一定的动员作用,这可能与其上调兔骨髓基质细胞和外周血粘附分子的表达有关。     

人脐血基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的作用

目的研究人脐血基质细胞(hUCBSCs)对脐血CD34+细胞体外扩增的促进作用. 方法应用MACS磁珠分离系统分离脐血CD34+细胞,按照DEXTER法行脐血基质细胞培养,观察hUCBSCs的生长状态及细胞表面分子的表达情况.建立以hUCBSCs为滋养层的脐血CD34+细胞体外扩增体系,并对脐血CD34+细胞短期扩增后行集落形成单位(CFU)-GM、CFU-E和CFU-Mg半固体培养. 结果脐血基质细胞为混合细胞群,包括CD68(+)、Fn(+)、CD31(+)和CD34(-);以hUCBSCs为滋养层的体外扩增体系对脐血CD34+细胞具有明显的扩增作用,体外液体扩增后的脐血CD34+细胞集落形成能力明显高于对照组,其中细胞因子(SCF+IL-3+EPO+TPO+GM-CSF)联合hUCBSCs体系的扩增作用最强,hUCBSCs在促进CFU-Mg集落形成的作用中具有明显优势. 结论hUCBSCs具有体外支持造血作用,与细胞因子联合对促进脐血CD34+细胞扩增作用更加明显.hUCBSCs对促进巨核细胞扩增可能具有特殊的意义.     

人脐血基质细胞自发分泌多种造血生长因子的实验研究

目的探讨体外培养的人脐血基质细胞分泌血小板生成素(thrombopoietin,TPO)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)的能力.方法留取不同培养时相点的培养液上清,ELISA法检测上清中TPO、GM-CSF、SCF的浓度,并与骨髓基质细胞的培养上清液对照比较其特点.结果人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可分泌TPO、GM-CSF和SCF等造血生长因子,二者造血生长因子的分泌随着培养时间的延长而逐渐下降,其中人脐血基质细胞分泌TPO和SCF的高峰期出现在第7天,而GM-CSF的分泌则无高峰期的出现;通过与骨髓基质细胞分泌三种造血生长因子量进行对比发现,人脐血基质细胞SCF和GM-CSF的分泌量低于骨髓基质细胞,而TPO的分泌高于同期培养的骨髓基质细胞.结论人脐血基质细胞与骨髓基质细胞一样具有分泌造血生长因子,支持调控造血的作用.     

人脐血CD34+细胞体外DEXTER基质细胞培养的动态观察

目的 动态观察人脐血CD34^ 细胞DEXTER基质细胞培养的情况。方法 应用MACS磁珠分离系统分离脐带血CD34^ 细胞，按照DEXTER法行脐血基质细胞培养，观察不同时间、不同细胞因子组合基质细胞的生长状态。结果 SCF及SCF BFGF组合可促进基质细胞集落的生成，脐血基质细胞在生长情况、组成成分、细胞形态等方面与骨髓基质细胞有不同的生物学特性。结论 脐血CD34^ 细胞在生长因子的辅助下能促进基质细胞集落的形成，有望成为新的基质细胞来源。     

单个核细胞绝对计数对恶性血液病患者自体外周血干细胞采集结果及时机选择的意义

目的探讨一种快速、简捷判断恶性血液病自体外周血干细胞最佳采集时机的方法。方法 37例次行自体外周血干细胞移植（auto-PBSCT）的不同类型恶性血液病患者,以化疗＋粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员,采集前进行外周血白细胞（WBC）、单个核细胞（MNC）比例测定及其绝对计数,以血细胞分离机进行外周血干细胞采集,应用流式细胞术（FCM）监测CD34＋细胞计数。结果采集产品的MNC中位数为1.76×108/kg,CD34＋细胞中位数为1.35×106/kg;MNC绝对计数是产品MNC和CD34＋细胞总量的唯一相关指标,而外周血WBC计数和MNC比例与采集产品MNC和CD34＋细胞总量无关。进一步分析提示MNC绝对计数达10×108/L单次采集效率提高,中位CD34＋细胞采集量达1×106/kg以上,可作为启动采集的阈值。结论外周血MNC的绝对计数能快速、简便地动态监测外周造血干细胞的变化,为外周血造血干细胞最佳采集时机的判断提供了一种快捷、经济的参考方法。