甲型流感病毒PB1-F2蛋白功能的研究进展

PB1-F2蛋白是甲型流感病毒表达的第11类蛋白,含有87～90个氨基酸残基,主要定位在线粒体中,可以诱导宿主细胞线粒体途径的细胞凋亡。部分流感病毒毒株的PB1-F2蛋白可以提高流感病毒聚合酶活性,从而促进病毒在宿主细胞中复制。同时完整的PB1-F2蛋白上存在特异的抗原表位,能诱导宿主体内免疫T细胞的表达,引起其免疫水平的改变,这与二次细菌感染引发的肺损伤具有显著关联。甲型流感病毒有多种亚型,而且存在地区间差异。国内、外在关于PB1-F2蛋白的作用机制与功能方面的研究大多针对一个地区的一种亚型的流感病毒毒株,且很多都是建立在假设的基础上,因此,对于PB1-F2蛋白的作用机制及其对宿主的影响有待于开展进一步的研究。作者就甲型流感病毒PB1-F2蛋白的功能学研究进展作一综述。     

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达

目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

以流感病毒M2蛋白为靶点的通用疫苗的研究现状

流感病毒基质蛋白2（M2蛋白）是流感病毒结构蛋白,具有离子通道作用,其基因序列在不同亚型流感病毒中高度保守。M2蛋白细胞膜外区有24个氨基酸残基,简称＂M2e＂,是M2抗原决定簇的集中区域。设计M2e四分肽,将多个M2e分子和具有佐剂效应的蛋白偶联或将其嵌入减毒活疫苗载体,可增强M2基因的稳定表达。用M2蛋白免疫动物能诱导较好的体液免疫和细胞免疫应答,保护动物免受不同亚型流感病毒的致死性攻击。M2蛋白作为流感病毒通用疫苗的靶点,在预防不同亚型流感病毒的感染与流行方面具有重要的社会价值及实际应用意义。     

甲型流感病毒H9N2亚型毒株血凝素基因特性的研究

目的　了解人甲型流感病毒H9N2亚型毒株的来源及从分子生物学角度来弄清不同宿主来源的H9N2亚型毒株间相互关系。方法　病毒在鸡胚中传代 ,从收获的尿囊液中提取病毒粒RNA ,通过逆转录合成cDNA。cDNA通过PCR进行扩增 ,接着PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。而后 ,RNA序列测定是采用双脱氧链末端终止和克隆法。最后用MegAlign( 1.0 3版 )和Editseq( 3.69版 )软件进行种系发生学分析。结果　从中国所分离出的H9N2亚型毒株。它们的HA1与HA2间裂解部位的氨基酸序列均为R S S R ,除一株鸽病毒其HA蛋白分子上仅含 7个潜在的糖基化位点外 ,而其余的均含 8个。 6株H9N2毒株HA蛋白分子上氨基酸序列有 2 - 16个不同 ,这些不同分布在 2 4个不同的位点上。近来在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2亚型毒株。结论　人甲型流感病毒H9N2亚型毒株可能性最大来自鸡的H9N2毒株 ,而不是来源于鸽的H9N2毒株。但 ,H9N2毒株是否具有人传人能力 ,至今仍不清楚。在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2毒株。     

黄芪和秦艽提取物抗甲型流感病毒研究

目的:评价中药黄芪和秦艽提取物混合液抗甲型流感病毒的作用。方法:⑴复制小鼠肺部甲型流感病毒感染模型56只,随机分为病毒对照组(NS,n=9)、利巴韦林组(0.1g/kg,n=11)、黄芪组(0.5g/kg,n=12)、秦艽组(0.5g/kg,n=12)及混合提取物组(0.5g/kg,n=12),给药4d后处死计算肺指数和抑制率;⑵另40只模型,随机均分为病毒对照组、黄芪组、秦艽组及混合提取物组,给药14d后计算各组死亡保护率和延长生命率。结果:⑴利巴韦林组、黄芪组、秦艽组及混合提取物组肺指数抑制率均显著高于正常对照组和病毒对照组(P<0.05或P<0.01);⑵黄芪组和混合提取物组小鼠平均存活天数明显高于病毒对照组(P<0.05或P<0.01)。两项实验中均是混合提取物组效果最为明显。结论:黄芪和秦艽混合提取物具有明显的抗甲型流感病毒作用,效果优于单独的黄芪和秦艽。     

不同时期H1N1甲型流感病毒H1血凝素蛋白的特征比较

目的比较2007—2014年分离的H1N1甲型流感病毒H1血凝素蛋白与分离于1934年的H1N1甲型流感病毒H1血凝素蛋白的差异性,以了解近几年流行的H1N1甲型流感病毒H1血凝素蛋白的变异特征。方法从Genebank的基因数据库中获取16株H1N1甲型流感病毒H1血凝素蛋白的核苷酸和氨基酸序列,采用在线软件SignalP4.1预测信号肽,运用Clustal X,Bioedit等国际通用软件进行氨基酸和核苷酸的序列比对,计算核苷酸及氨基酸的同源性。在线软件Antheprot分析二级结构。结果 H1血凝素蛋白编码框架长约1701bp,编码含566个氨基酸组成的多肽。16株H1N1甲型流感病毒H1血凝素氨基酸同源性为92.4%~99.8%,核苷酸同源性为91.8%~99.6%。H1血凝素蛋白aa1-aa17区域为潜在信号肽,血凝素蛋白A1和A2裂解序列为位于aa324-aa330序列IQSR↓GLF。H1血凝素蛋白富含潜在α螺旋(25%~32%)、β折叠(27%~28%)和卷曲结构(23%~26%)等二级结构。2007—2014年的15株病毒的血凝素蛋白A1高变区位于羧基端aa278-aa321,有11个位点变异,变异率高达25%。参与二硫键形成的10个半胱氨酸位点未发生变异,3个受体结合区的氨基酸序列(PKTS、VLVLWAIHH和SRYSKKFK)比较保守,有2个序列出现毒力相关位点D222G突变。结论与1934年的H1N1甲型流感病毒H1血凝素蛋白比较,2007—2014年间分离H1N1甲型流感病毒H1血凝素蛋白的重要功能结构域的序列仍保守稳定,但在某些位点出现较高频率的替代变异。     

大青叶水提物抗甲型流感病毒活性研究

目的观察大青叶水提物的抗甲型流感病毒(IAV)活性。方法用热回流法提取大青叶水提物;用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测大青叶水提物对狗肾传代细胞(MDCK)的毒性作用;将流感病毒反向遗传八质粒病毒包装系统共转染进混养的人类胚胎肾细胞(293T)和MDCK细胞中制备IAV,并测定IAV的半数细胞培养物感染量(TCID50)。分3组进行大青叶水提物抗IAV活性检测:第1组先分别用0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g·L~(-1)的水提物作用细胞4 h,再分别加10×TCID50病毒吸附细胞2 h;第2组用0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g·L~(-1)的水提物和10×TCID50病毒同时作用细胞4 h;第3组先用10×TCID50病毒吸附细胞2 h,再分别加0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g·L~(-1)的水提物作用细胞4 h;然后用CCK-8法测定大青叶水提物对IAV的增殖抑制率。结果大青叶水提物的细胞对照组、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、3.00、4.00、5.00 g·L~(-1)组的细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(99.97±1.08)%、(99.95±4.34)%、(98.62±1.45)%、(98.81±2.04)%、(74.65±6.29)%、(49.71±2.14)%、(39.86±4.31)%、(19.75±2.26)%、(7.86±3.74)%、(2.77±1.76)%,大青叶水提物对MDCK细胞的半数细胞毒性浓度为1.75 g·L~(-1),大青叶水提物对MDCK细胞的最大无毒浓度为1.25 g·L~(-1);第1、2、3组大青叶水提物各浓度亚组的病毒增殖抑制率均高于病毒对照组(P<0.01)。第2、3组大青叶水提物各浓度亚组的病毒增殖抑制率均显著低于第1组对应的大青叶水提物亚组(P<0.05)。第3组大青叶水提物各浓度亚组的病毒增殖抑制率显著高于第2组对应的大青叶水提物亚组(P<0.05)。第1、2、3组对IAV的半数抑制浓度分别为0.75、>1.25、1.25 g·L~(-1)。3组不同干预方法的抗病毒活性排序为:第1组>第3组>第2组。结论大青叶水提物有较好的抗IAV活性,其作用机制可能与增强机体免疫力相关。     

甲型流感病毒DNA疫苗双表达载体的构建及表达

目的： 构建含有甲型流感病毒M2基因与GM-CSF基因的DNA疫苗双表达载体,为研究甲型通用流感疫苗奠定基础。方法： 将甲型流感病毒（H1N1）接种鸡胚后收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增M2基因;将微小病毒内部核糖体进入位点（IRES）基因插入到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将M2基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点,构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,酶切鉴定后测序;脂质体法转染COS7细胞并检测目的蛋白的表达。结果： 成功扩增出M2基因（约300 bp）、IRES基因(约580 bp)和GM-CSF基因(约400 bp),酶切鉴定结果表明构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,Western blotting检测证明流感病毒M2蛋白的表达。结论：成功构建出流感病毒DNA疫苗双表达载体pMIG。     

深圳地区新甲型H1N1（2009）流感病毒M基因特征分析

目的对深圳地区分离到的新甲型H1N1（2009）流感病毒的M基因分子特性进行详细分析,并从分子水平上了解其对金刚烷胺类药物的耐药性。方法选取深圳地区分离培养到的55株新甲型H1N1（2009）流感病毒,对其M片段进行全长测序,采用DNAstar与MEGA3．1生物软件对M基因序列进行比对并用NJ法构建系统进化树。结果通过对M基因的氨基酸序列进行进化分析,发现深圳地区分离培养到的新甲型H1N1（2009）流感病毒更接近欧洲猪流感病毒,与季节性HINI流感病毒差异很大。经过序列分析发现,深圳株的M基因与A／California／07／2009高度同源,显示该病毒M基因较保守。此外,还发现所有深圳株的M2蛋白均出现s31N突变,显示对金刚烷胺类药物可能耐药。结论深圳流行的新甲型H1N1（2009）流感病毒的M基因可能源于欧洲猪流感病毒,且均对金刚烷胺类药物有耐药倾向。应进一步加强对新甲型H1N1（2009）流感病毒的分子特征研究,并积极开展流感病毒耐药性监测。     

小鼠β-防御素6与甲型流感病毒M2e基因融合表达及其免疫特性研究

目的构建小鼠β防御素6（mBD6）与甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法（overlap-PCR）将M2e与mBD6通过一段多肽接头Gly4Ser融合成为mBD6-M2e。将其插入载体pcDNA3．1（＋）,构建成pcDNA3．1（＋）／mBD6-M2e。鉴定正确后,转染MDCK细胞,免疫荧光、MTT检测mBD6-M2e表达和分泌。免疫小鼠,半定量PCR检测脾细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、CCR7表达。结果融舍基因mBD6-M2e真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD6-M2e构建成功,在MDCK细胞膜上成功表达融和蛋白,转染细胞的培养上清刺激淋巴细胞增殖。免疫小鼠细胞因子表达改变。结论融合基因mBD6-M2e真核表达载体成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。     

甲3型流感病毒流行株金刚烷胺耐药性的初步研究

目的 调查流感病毒流行株对金刚烷胺的耐药情况。方法2003至2005年北京地区流感流行季节分离的流行株经提取RNA,RT-PCR一步法扩增流感病毒的M2基因片断,用凝胶电泳、核酸测序以及生物信息软件分析法对耐药性有关的氨基酸位点确定。结果41株流行株中30株对金刚烷胺类药耐药,其比例为75％（30／40）。耐药株变异表现为31位氨基酸被天冬酰胺置换。结论此变异现象值得我们高度关注,应在我国开展抗流感病毒耐药性的监测,进一步确定我国流感病毒耐药株的发生频率,为我国制定应对流感大流行措施提供参考。     

Emergence of truncated PB1-F2 protein of H3N2 influenza virus during its epidemic period in Jiangsu Province, China

Background PB1-F2 protein has been proven to increase the pathogenicity of influenza A virus （IAV） strains in primary infection and in secondary bacterial infection. It can also regulate the activity of viral polymerase. However, it was shown in another retrospective study that a portion of IAVs do not express full-length PB1-F2 protein during virus development; different kinds of stop codons cause exits in the open reading frames and form PB1-F2 gene products with the corresponding genotypes. Truncated PB1-F2 in human H3N2 IAVs has long been detected in North America but its evolution in China is still unclear. Methods Influenza-like illnesses （ILls） from the whole of Jiangsu Province were collected and inspected to determine the type and subtype of the viruses. A portion of isolates collected in the epidemic period were selected as samples for later whole-genome sequencing, and the exact sequences were determined and analyzed. Results H3N2 influenza virus was one of the epidemical strains which had been prevalent during 2009-2010, in Jiangsu. Five H3N2 isolates with truncated PB1-F2 protein （25aa） were detected in influenza samples from Nanjing and Xuzhou, while seven similar H3N2 isolates were also reported in Niigata, Japan. Conclusion This emergence indicates the possibility that there has been transmission of the H3N2 virus between the two countries.     

Characterization of hemagglutinin gene of influenza A virus subtype H9N2

Objective　To determine the origin of human influenza A (H9N2) virus and the relationship among H9N2 strains isolated from different hosts, on the basis of molecular biology. Methods　Viruses were passed in embryonated hen eggs, and virion RNA was extracted from allantoic fluid and reverse transcribed to synthesize cDNA. cDNA was amplified by PCR and the PCR product was purified with a purification kit. Afterwards RNA sequence analysis was performed by dideoxynucleotide chain termination and a cloning method. Finally, phylogenetic analysis of the sequencing data was performed with MegAlign (version 1.03) and Editseg (version 3.69) softwares. Results　The amino acid sequences at the cleavage site between HA1 and HA2 domains of H9N2 viruses isolated in China are R-S-S-R. One pigeon strain contains seven potential glycosylation sites on the HA protein molecule, while all others have eight. There are 2 to 15 differences of amino acid sequences distributed at 24 different positions on the HA protein molecules among six H9N2 viruses. The H9N2 viruses with multiple lineages of HA genes were co-circulating in China recently. Conclusion　The highest possibility is that human influenza A (H9N2) virus was derived from Chicken H9N2 virus, and not derived from pigeon H9N2 virus. However, it is still unknown whether the H9N2 virus could transmit from person to person. The H9N2 viruses with multiple lineages of HA genes are co-circulating in China.     

全球甲型流感病毒H5A1序列的分子进化研究

目的应用生物信息学数据库和工具,对现有的H5亚型甲型流感病毒全球分离株的H5A1抗原序列进化规律进行研究。方法下载NCBI Genbank和美国洛斯阿莫斯国家实验室流感病毒数据库中全部的甲型流感病毒H5A1序列,采用快速极大似然法绘制进化树,并用SRDT模型估计各分枝的进化速度与出现时间。结果H5A1序列的进化树可被分为两个各自独立进化的世系:美洲世系和欧/亚世系,它们在地域分布、序列位点等方面区别明显,且可被进一步细分为几大进化枝,野生禽类分枝和家禽株系分枝的进化速度存在明显差异,所有的人及其他哺乳动物感染株系则均来自于欧/亚世系的亚洲禽/人分枝。结论H5A1序列在野生禽类中已达到相对稳定的状态,其自然变异速度为(1.990~2.535)×10-3/位点/年,而家禽中的高毒力变异株进化速度明显加快。目前威胁人类的主要是1996年之后出现的亚洲变异株,且进化树结构提示该株系出现过多次禽/人跨宿主传播事件,值得对其位点特征进行深入研究。     

H1N1流感病毒D151G突变株对奥司他韦的抗药性研究及药物筛选

目的:观察H1N1流感病毒D151G突变株对奥司他韦的抗药性,筛选对D151G突变神经氨酸酶具有抑制作用的化合物.方法:采用分子动力学模拟和MM-GBSA自由能计算方法判断H1N1流感病毒D151G突变株对奥司他韦的抗药性;应用分子对接软件Autodoek从ZINC数据库筛选与D151G突变神经氨酸酶结合能力较强的化合...     

甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与宿主蛋白的相互作用的初步研究

目的利用酵母双杂交技术研究甲型H3N2流感病毒截短型PB1-F2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用,为该病毒蛋白的功能研究和致病机制提供理论依据。方法以本实验室分离和鉴定的甲型H3N2流感病毒A/Guangdong/7028/2010为模版,构建pGBKT7-PB1-F2重组载体,利用Y2HGold酵母双杂交系统,从人类通用cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白。结果成功构建含诱饵蛋白基因的pGBKT7-PB1-F2重组载体,转化酵母自激活和毒性实验显示为阴性;酵母双杂交实验显示Y2HGold和Y187酵母的结合率为5.22%,符合实验要求;经筛选和验证后,得到3个与截短型PB1-F2蛋白有相互作用的阳性克隆,分别为钾/钠ATP酶β1亚基、热休克蛋白40和白介素-2受体γ亚基。结论初步推断截短型H3N2流感病毒PB1-F2蛋白可能影响流感病毒在宿主细胞中的复制功能和凋亡调控。     

Generation and characterization of a cold-adapted attenuated live H3N2 subtype influenza virus vaccine candidate

Background H3N2 subtype influenza A viruses have been identified in humans worldwide, raising concerns about their pandemic potential and prompting the development of candidate vaccines to protect humans against this subtype of influenza A virus. The aim of this study was to establish a system for rescuing of a cold-adapted high-yielding H3N2 subtype human influenza virus by reverse genetics, Methods In order to generate better and safer vaccine candidate viruses, a cold-adapted high yielding reassortant H3N2 influenza A virus was genetically constructed by reverse genetics and was designated as rgAA-H3N2. The rgAA-H3N2 virus contained HA and NA genes from an epidemic strain A/Wisconsin/67/2005 （H3N2） in a background of internal genes derived from the master donor viruses （MDV）, cold-adapted （ca）, temperature sensitive （ts）, live attenuated influenza virus strain A/Ann Arbor/6/60 （MDV-A）. Results In this presentation, the virus HA titer of rgAA-H3N2 in the allantoic fluid from infected embryonated eggs was as high as 1：1024. A fluorescent focus assay （FFU） was performed 24-36 hours post-infection using a specific antibody and bright staining was used for determining the virus titer. The allantoic fluid containing the recovered influenza virus was analyzed in a hemagglutination inhibition （HI） test and the specific inhibition was found. Conclusion The results mentioned above demonstrated that cold-adapted, attenuated reassortant H3N2 subtype influenza A virus was successfully generated, which laid a good foundation for the further related research.