ANG-1基因重组腺相关病毒获取及转染猪骨髓干细胞的研究

目的：构建携带血管形成素-1（ANG—1）基因腺相关病毒（AAV）载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础。方法：利用PCR技术,获取目的基因ANG-1,通过重组DNA技术得到ANG-1与pUC119的重组质粒,采用SalⅠ和BglⅡ双酶将pUCll9中的目的基因ANG-1基因片断切出,再克隆到质粒pSNAV2．0中。用Lipofeetamine将pSNAVANG-1质粒转染293细胞后,用G418选择培养获得293／AAV：ANG—1细胞株,产生了有传染性的病毒颗粒,纯化并进行病毒DNA颗粒滴度测定。分别将绿色荧光蛋白（GFP）基因重组腺相关病毒（rAAV。GFP）及rAAV2 ANG—1感染猪骨髓干细胞,并对转染效率及转染后表达情况进行初步研究。结果：测序证实ANG—1与GenBank提供的原始序列完全-致。重组载体经酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全-致,在新的重组质粒中,ANG-1有-套CMV启动子和PolyA终止子系统。293细胞包装病毒效果良好,携带ANG-1的感染性AAV滴度为9×10^11v．g／ml,用Western杂交法检测显示猪骨髓干细胞中表达ANG—1。1×10^6v．g／mlrAAV2GFP感染CD34阳性细胞48h后55％左右的细胞有明显的荧光。结论：ANG-1基因AAV构建成功,并能在骨髓干细胞中有效表达,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。     

HSV1-TK基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的:构建含单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV1-TK)基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,制备重组腺相关病毒rAAV2/HSV1-TK,并检测HSV1-TK基因在转染晶状体上皮细胞中的整合和表达,为后囊膜混浊的基因治疗奠定基础.方法:用基因重组技术构建含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,并通过PCR和酶切鉴定;将该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选出携带该质粒的载体细胞株BHK-21/TK,在辅助病毒的参与下包装成重组病毒rAAV2/HSV1-TK;用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和高效液相色谱(HPLC)法检测重组病毒rAAV2/HSV1-TK的纯度,用斑点杂交法检测重组病毒的滴度;重组病毒rAAV2/HSV1-TK转染兔晶状体上皮细胞N/N1003A,用PCR和RT-PCR检测HSV1-TK基因的整合和表达.结果:经PCR和酶切鉴定重组质粒pSNAV2.0-TK构建成功;成功制备了重组病毒rAAV2/HSV1-TK,病毒滴度达1×1012v.g./mL;重组病毒转染N/N1003A细胞后,PCR和RT-PCR检测显示HSV1-TK基因在细胞中整合并且有效表达.结论:成功构建了含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒,制备了高滴度重组病毒rAAV2/HSV1-TK,HSV1-TK基因在转染该病毒的晶状体上皮细胞中可有效表达.     

VEGF165基因重组腺相关病毒构建及转染猪骨髓间充质干细胞的研究

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子（hVEGF）的重组腺相关病毒载体,在体外转染猪骨髓间充质干细胞并观察其表达。方法细胞AAV包装质粒pAAV-IRES-ZsGreen及含hVEGF的质粒经EcoRI＋BamHI双酶切、连接,构建pAAV-hVEGF165-IRES-ZsGreen载体,采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获得rAAV2-hVEGF165及对照重组腺相关病毒,real-timePCR法测定病毒效价。Westernblot检测重组rAAV2-hVEGFl65在猪骨髓间充质干细胞的表达,MTS法检测VEGF蛋白活性。结果成功构建rAAV2-hVEGF165重组腺相关病毒载体,rAAV2-hVEGFl65经双酶切和测序鉴定正确,real-timePCR法测定病毒效价为5×10 12vg／ml。转染rAAV2-hVEGF165的猪骨髓干细胞能够有效表达VEGF蛋白,并能促进血管内皮细胞的增殖。结论成功构建rAAV2-hVEGFl65重组腺相关病毒载体,并能在猪骨髓间充质干细胞中有效转染和表达,为进一步探索rAAV2-hVEGF165对治疗缺血性心肌疾病的研究提供实验基础。     

2型腺相关病毒转导人骨髓CD34+细胞与间充质干细胞

目的:探讨2型重组腺相关病毒(AAV2)载体能否有效转导人骨髓CD34 细胞与间充质干细胞。方法:构建、包装、纯化携带绿色荧光蛋白基因的2型重组腺相关病毒(rAAV22/GFP),转染骨髓CD34 造血干/祖细胞和间充质干细胞,转导后48 h在荧光显微镜下观察GFP的表达,并比较羟基脲(HU)处理前后rAAV2/GFP对CD34 细胞的转染效率。结果:rAAV2/GFP对CD34 细胞的转染效率为5.3%±1.7%。经羟基脲预处理后达13.2%±2.8%,rAAV2/GFP对间充质干细胞的转染效率为23%±3.6%。结论:rAAV2对间充质干细胞的转染效率高于骨髓CD34 细胞,羟基脲预处理可以明显提高rAAV2对CD34 细胞的转染效率。     

rAAV-hBMP7的包装纯化及感染滴度的测定

目的:包装纯化具有感染性的腺相关病毒rAAV-hBMP7,检测其包装效率及感染滴度。方法:应用AAV Helper-Free System、磷酸钙三质粒共沉淀法,将病毒质粒pAAVIRES-hrG-FP-hBMP7、辅助质粒pAAV-Helper和包装质粒pAAV-RC转染AAV-293细胞,进行病毒包装,荧光计数法测定病毒包装效率;反复冻融收获病毒液,按氯仿处理、PEG/NaCl沉淀的方法浓缩纯化;纯化的病毒液感染AAV-HT1080细胞观测荧光表达,原位β-半乳糖苷酶染色测定病毒感染效率和滴度。结果:转染AAV-293细胞后6h即有绿色荧光表达,包装效率为94.16±0.13%。纯化的rAAV-hBMP7在HT1080细胞中的感染效率为78%,计算病毒物理滴度为2.34×1011v·g/ml。结论:磷酸钙三质粒共沉淀法可实现病毒在AAV-293细胞中的高效包装,纯化的rAAV病毒载体能介导hBMP7基因转染真核细胞并具有较高的转染效率和感染滴度。     

PSNAV2-CTGF重组质粒构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 构建含人结缔组织生长因子（CTGF）的腺相关病毒（AAV）表达载体,并观察其在人胚肾293（HEK293）细胞中的表达。方法 以含有人CTGF基因序列的质粒pCMV-SPORT6为模板,应用PCR克隆出CTGF基因,采用分子克隆的方法把CTGF克隆到AAV表达载体pSNAV2.0上构建重组质粒pSNAV2-CTGF。把重组质粒转染HEK293细胞,用免疫荧光法对重组质粒目的蛋白的表达进行研究,MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性。结果 成功构建完全正确的CTGF基因序列的AAV表达载体pSNAV2-CTGF,将其转染HEK293细胞后,免疫荧光检测到目的蛋白的表达,转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性。结论 成功构建了真核表达载体pSNAV2-CTGF,转染HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的CTGF蛋白。     

携带血红素加氧酶1基因的重组腺相关病毒的制备

目的:制备携带大鼠血红素加氧酶1(rHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV)。方法:通过RT-PCR的方法,从大鼠脾脏组织中扩增rHO-1基因,克隆入通用型AAV载体质粒pSNAV中构建重组质粒pSNAV-rHO-1,通过酶切和测序鉴定。利用Lipofectamine将pSNAV-rHO-1转染BHK-21细胞,G418筛选得到表达外源基因的细胞系BHK/rHO-1。用具有能表达Rap和Cap及包装重组AAV功能的一种重组单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2分别感染这株细胞系后收获并纯化病毒,DNA斑点杂交检测重组病毒滴度。结果:扩增了rHO-1基因,测序证实与GenBank中的一致,病毒滴度为1.5×1015v.g/L。结论:成功获得了高滴度、高纯度的重组AAV-rHO-1,这为以后心血管系统疾病的基因治疗研究奠定了基础。     

hBMP-7基因重组腺相关病毒载体的构建及人牙髓细胞转染的研究

目的:构建人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因重组腺相关病毒载体,并转染牙髓细胞,为牙组织损伤修复的基因治疗做探索性研究。方法:以含hBMP-7全长cDNA的载体PTcDNA-hBMP-7为模板进行PCR扩增,将回收产物和pAAVIRES-hrGFP分别双酶切后连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒pAAVIRES-hrGFP-hBMP-7。采用磷酸钙共沉淀法转染293细胞进行病毒包装,收获的病毒液按氯仿处理、PEG/NaCl沉淀、酚:氯仿反复抽提法浓缩纯化,斑点杂交法测病毒滴度,并转染体外培养的牙髓细胞。结果:酶切鉴定和测序结果表明,hBMP-7基因成功克隆入pAAVIRES-hrGFP载体中。在293细胞中包装出重组腺相关病毒载体rAAVIRES-hBMP-7,物理滴度为3.0×1011v.g/ml。rAAV转染牙髓细胞后GFP表达逐渐增强,可持续表达到4周以后。结论:重组腺相关病毒载体rAAVIRES-hBMP-7,能有效转染牙髓细胞表达目的基因。可用于牙组织工程基因治疗的研究。     

人对氧磷酶1基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的：构建带有人对氧磷酶1（hPONI）基因的重组腺相关病毒（rAAV）载体,并检测其转染大鼠骨髓内皮祖细胞（EPCs）后hPON1的表达。方法：提取流产胎儿肝脏的总RNA,RT-PCR获得cDNA,设计引物通过PCR获得PON!基因片段,将其与pGEM—TEasy载体连接,将PON1基因片段切下,插入到质粒pAAV—IRES—GFP的多克隆位点,获得质粒pAAV—PON1-IRES—GFP,经酶切和测序鉴定。包装的病毒rAAV—PON1用斑点杂交检测滴度,并用其转染EPCs检测hPON1在mRNA水平的表达。结果：pAAV—PON1-IRES-GFP酶切和测序结果完全正确。斑点杂交检测病毒的滴度为1．7×10^10g／mL,RT—PCR结果显示病毒转染EPCs后存在hPON1的表达。结论：成功构建了pAAV—PON1-IRES—GFP质粒,包装出较高滴度的rAAV—PON1,并且转染EPCs后可以检测到hPON1表达。     

人基质金属蛋白酶组织抑制剂1腺相关病毒表达质粒的构建及检测

目的构建含人基质金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinases1,TIMPl）的腺相关病毒（adenoassociatedvirus,AAV）表达质粒并观察其在人胚肾293（HEK293）细胞中的表达,为进一步逆转椎间盘退变提供依据。方法以含有人TIMP1基因序列的质粒pBLAST49-hTIMP1为模板,通过PCR的方法扩增出TIMP1基因,再采用分子克隆的方法,把TIMP1克隆到AAV表达质粒pSNAV2．0构建重组质粒pSNAV2-TIMP1。把重组质粒转染HEK293细胞,用免疫荧光和Westernblot的方法对重组质粒的表达进行研究,ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP1蛋白的含量。结果PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的TIMP1基因序列的AAV表达质粒pSNAVz-TIMP1。体外成功转染入HEK293细胞,免疫荧光、Westernblot及ELISA的结果表明重组质粒能够高表达TIMP1蛋白。结论成功构建了表达TIMP1的重组质粒pSNAV2-TIMP1,并证实在蛋白质水平获得了表达,为进一步逆转椎间盘退变研究奠定了基础。     

1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究

目的 评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性.方法 rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率.MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响.结果 转染后2 d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90％(MOI=5×103),58.56％(MOI=5×104),68.31％(MOI=5×105).AAV1-EGFP转染ECV304细胞后.细胞生长及形态正常.MTT法显示转染后72、96 h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异.结论 rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体.     

真核表达载体pcDNA3.0-Cx43的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的：构建携带间隙连接蛋白connexin43(Cx43)cDNA的真核表达载体,转染骨髓基质干细胞,观察间隙连接蛋白Cx43在骨髓基质干细胞中的过量表达．方法：目的基因Cx43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pcDNA3．0,转染大鼠骨髓基质干细胞,用G418筛选得到Cx43基因高表达的细胞;对照组为pcDNA3．0直接转染骨髓基质干细胞．结果：酶切电泳结果显示按设计构建的载体pcDNA3．0-Cx43,经G418筛选得到不同抗性的骨髓基质干细胞,免疫细胞化学显示有Cx43蛋白的表达．结论：Cx43可以在骨髓基质干细胞中表达．     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)E2和乙型肝炎病毒(HBV)preS融合蛋白的真核表达载体.方法:用PCR方法扩增HBV preS和HCV E2蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体pcDNA3中,用脂质体转染试剂将其转入COS7细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白.结果:E2-preS融合蛋白基因包括了全长的HBV preS和HCV E2蛋白基因,嵌合基因长度约1.6 kb.表达载体在COS7细胞表达出了E2-preS融合蛋白.结论:构建的E2-preS融合蛋白表达载体能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白,为获得真核表达的融合蛋白及研究此蛋白的免疫原性打下基础.     

Retroviral-mediated transfer and functional expression of multidrug resistance gene in human placenta mesenchymal stem cells

Background Most of gynecologic malignancies are sensitive to chemotherapy. Myelosuppression is the main dose-related toxicity of many chemotherapeutic drugs. The human multidrug resistance （mdrl） gene is well known for its ability to confer drug resistance. This study aimed to explore the feasibility of expression and resistance of mdrl gene transduction into human placenta mesenchymal stem cells （P-MSCs） by retrovirus vector. Methods Human P-MSCs were isolated from trypsin-digested term placentas, and their immunophenotypes and differentiation potential were evaluated. Human P-MSCs were transduced by reconstructed retroviral vector containing the mdrl gene and green fluorescent protein （GFP） reporter gene. The integration and expression of the mdrl gene were observed indirectly by the expression of GFP, and fluorescence-activated cell sorter was used to evaluate the functional activity of permeability glycoprotein （P-gp） encoded by the mdrl gene. The stimulating test was made in vitro to show pleiotropic drug resistance of transfected cells. Results The isolated, cultured and expanded P-MSCs expressed stem cell markers such as CD29, CD44 and CD73, and showed osteogenic and adipogenic differentiation potentials under appropriate conditions. The expression of P-gp in the non-transfected P-MSCs cells was （0.4±0.1）%, but increased to （28.1±4.7）% after gene transfection （P〈0.01）. And positive staining of P-gp located mainly at cell membrane and cytoplasm. Accumulation and extrusion assays showed that P-gp expressed by the transfected cells had pump-functional activity and could efflux daunomycin out of cells. The analysis of cell survival confirmed that transfected P-MSCs had a characteristic of multidrug resistance with a significant increase in the resistance to anticancer agents. Conclusions Transfer and expression of human mdrl gene mediated by retrovirus vector conferred P-MSCs drug resistance. It might provide a new alternative to chemoprotection strategies.     

构建EGFP-PDX-1融合表达载体电穿孔转染大鼠胎肝干细胞的研究

目的 构建PDX—1绿色荧光蛋白融合表达载体,电穿孔转染人大鼠胎肝干细胞以得到稳定表达。方法 从SK900／BLSCRIPT质粒中扩增PDX—1,将其插入pEGFP-C1的多克隆位点中,构建重组质粒pEGFP—C1-PDX-1;分离培养大鼠胎肝干细胞,经鉴定后用电穿孔法转染;分析转染前后细胞生长曲线,荧光显微镜下观察、RT-PCR鉴定转染结果。结果 重组质粒经酶切鉴定正确无误,经电穿孔转染后GFP和PDX-1基因均能在胎肝干细胞中保持较长时间稳定表达,并对胎肝干细胞的生长增殖影响较小。结论 成功构建了PDX-1绿色荧光蛋白融合表达载体,能在胎肝干细胞中较稳定表达,为研究PDX-1存干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞中的调控作用提供了物质基础。     

过表达牙本质涎磷蛋白的骨髓间充质干细胞部分牙向和骨向分化基因的表达

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSC)过表达牙本质涎磷蛋白(DSPP)后的形态学改变,并研究其部分牙向及骨向分化基因的表达情况。方法体外培养小鼠BM-MSC,通过腺病毒介导的方式将DSPP基因转染小鼠BM-MSC,通过标记基因GFP检测转染效率,观察转染后细胞的形态学改变,RT-PCR方法检测过表达DSPP的BM-MSC有无成牙和成骨基因的mRNA表达。结果成功获得小鼠BM-MSC,经腺病毒介导的DSPP基因转染BM-MSC的转染效率可达42.7%,转染后的细胞出现分化,似成牙本质样细胞。转染后细胞表达DSPP、DMP1、Msx1/2、Pax9、Lhx6/7、Sox9、Cbfα1、Osx、Col等多种牙向和骨向发育分化基因。结论过表达DSPP的BM-MSC出现细胞分化,并可表达多种牙向及骨向发育分化的基因。     

人微小抗肌萎缩蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及其基因表达

目的 构建人微小抗肌萎缩蛋白基因（microdystrophin）的真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）,研究其体外表达情况。方法 限制性酶切PBSK-MICRO质粒的微小抗肌萎缩蛋白基因片段,插入到真核表达质粒poD-NA3．1（＋）的Notl位点内,克隆出真核表达载体pcDNA3．1（＋）／microdystrophin。通过酶切和测序对质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染人rMSCs中,经过G418筛选后。用RT—PCR及间接免疫荧光技术检测表达产物。结果 pcDNA3．1（＋）／microdystrophin经过Notl、HindⅢ酶切鉴定及测序证实插入片断正确。提取转染重组质粒rMSCs的总RNA,进行RT-PCR可见mRNA的转录：对G418筛选后rMSCs进行免疫荧光检测可见细胞内亮丽的红色荧光．说明转染后的rMSCs有微小抗肌萎缩蛋白的表达。结论 成功构建了人microdystrophin基因真核表达载体,将其转染人rMSCs内有微小抗肌萎缩蛋白的表达．为进一步研究体外修饰自体干细胞移植治疗DMD奠定了基础。