人Man2c1转基因小鼠模型的建立

目的 为在体内研究MAN2C1的生物学意义而建立转hMan2c1基因的小鼠。方法 构建pIRKS2-EGFP-hMan2c1重组表达载体，经体外转染实验鉴定转染的基因能在COS-7细胞表达后，注射人ICR小鼠受精卵，以制备转基因小鼠。用基因组PCR鉴定目的基因在宿主基因组DNA的整合。用RT-PCR和Westernblot分析hMan2c1在转基因小鼠的表达。结果 在116只原代小鼠中，有7只hMan2c1基因组PCR阳性。在所检测的20只F1代小鼠中，有9只hMan2c1基因组PCR阳性。在所检测的21只F2代小鼠中，有16只基因组PCR阳性。用鼠尾组织RT-PCR和Western blot检测hMan2c1基因表达，确定基因组PCR阳性的7个系中有4个系阳性。结论 建立了4个稳定表达hMan2c1的转基因小鼠系，为深入研究MAN2C1的生物学意义打下了基础。     

条件化转染MT基因小鼠模型的建立

目的建立四环素诱导调控的MT转基因小鼠模型。为血管瘤试验研究及MT致瘤机理研究奠定基础。方法通过PCR方法从鸡的基因组序列中克隆绝缘子元件；构建四环素诱导调控的条件化转基因质粒，并将其调控元件和受控元件串联成一个载体，在两元件之间插入绝缘子，以减轻两者之间的相互干扰。为提高转基因的表达效率，在转基因盒的上游亦插入绝缘子元件；将MT基因亚克隆至此载体；转基因载体功能行细胞瞬转试验及半定量逆转录-PCR验证后，将其在体外扩增、酶切、回收，行小鼠受精卵原核注射，获得转染MT基因阳性小鼠；强力霉素体外诱导部分阳性鼠MT基因表达，使其具有血管瘤表型。结果绝缘子元件成功克隆；成功构建条件化转基因载体；体外试验证实目的基因的表达受强力霉素的严格调控；通过原核注射，获得5只转基因阳性鼠；2只行体外诱导2月后。1只出现血管瘤表型，逆转录．PCR检测证实MT表达。其余3只阳性小鼠在传代建系中。结论条件化MT转基因小鼠模型成功构建，此小鼠模型能够为血管瘤的试验研究及MT致瘤机理的体内研究提供一定的基础。     

MagA转基因小鼠模型的建立

目的建立MagA转基因小鼠,为活体MRI成像系统提供重要的实验动物模型。方法采用显微注射法．将MagA基因导入小鼠受精卵,再培育成转基因小鼠并繁殖传代。利用PCR方法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。结果酶切和DNA测序分析证实MagA基因准确克隆表达载体设计位点,目的基因序列与GenBank中MagA序列完全一致。通过PCR分析,进行转基因整合检测。目前转基因小鼠已稳定传代至第5代。结论MagA基因在转基因小鼠中整合,成功建立了MagA转基因小鼠。MagA转基因小鼠将成为MRI影像系统的重要实验动物模型。     

SV40T胃壁细胞定位表达转基因小鼠的建立

目的 构建胃壁细胞定位表达SV40T的真核表达载体并制备转基因小鼠动物模型,为研究胃癌发病机制提供动物模型.方法 从构建的胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV中酶切回收3.8kb的基因片段H -K ATPase β promoter/SV40T,通过显微注射的方法制备转基因小鼠,PCR和Southern blotting检测阳性转基因小鼠并建系繁殖,RT-PCR检测基因的表达情况.结果 将422枚注射过的受精卵移植给16只假孕雌鼠,共生出77只仔鼠,移植成功率为18.2%.在出生的77只仔鼠中,2#、4#、8#、16#、24#、51#、57#、61#、68#、73#经PCR检测为阳性首建鼠.除68#不育外,其他9个品系首建鼠共生出99只F1代鼠.8#品系23只F1代尚未发现阳性鼠,另8个品系F1代经PCR和Southern blotting检测发现31只阳性鼠,阳性率为40.8%(31/76).RT-PCR检测F1代阳性鼠均仅在胃组织中有SV40T基因的表达,而在心、肝、肾、肺、食道、肠、骨骼肌等组织中均不表达.不育首建鼠处死解剖发现胃组织有肿瘤存在.结论 建立了胃壁细胞定位表达SV40T基因的转基因小鼠动物模型.     

携带淀粉样前体蛋白瑞典型突变基因转基因小鼠的制备及体内表达研究

目的 建立携带人类淀粉样前体蛋白瑞典型突变（Swedish mutation of amyloid precursor protein,APPSWE)基因的转基因小鼠模型。方法 采用受精卵原核显微注射法，将人类APPSWE转基因导入C57及昆明种小鼠受精卵内，然后将注射后保持完整的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管内，然后应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR)、荧光原位杂交及逆转录PCR分析子代小鼠中外源基因的整合及表达情况。结果 注射后卵的存活率和幼子出现率分别为76.62%和10.38%；外源基因整合率为35.29%；共获得6只首建小鼠，已稳定传3代，PCR检测共55只阳性；提取阳性小鼠心、脑、肝、肾组织及骨骼肌以人类APPSWE基因外显子特异的引物进行逆转录PCR分析，结果发现其心、脑组织及骨骼肌中具有人类APPSWE基因的表达。结论 说明携带淀粉样前体蛋白瑞典型突变基因的转基因小鼠模型已制备成功。     

GFP／HBVX融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立

目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

慢病毒载体法制备荧光素酶转基因小鼠

目的基于慢病毒介导的转基因方法制备荧光素酶（Luc）转基因小鼠。方法制备携带Luc基因的慢病毒,将其注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,然后将胚胎移植进假孕母鼠体内以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪及PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定Luc转基因小鼠。结果移植慢病毒隙感染后的成活胚胎63枚。将其移植至3只假孕母鼠,其中2只怀孕,共生仔鼠11只;利用小动物活体成像仪检测Luc表达,在蛋白水平证实11只F0代中,3只（命名为S1、S2、S3）表达Luc;DNA水平检测证实,3只Luc阳性小鼠的基因组中整合有外源转基因Luc。此外,Luc转基因首建鼠基因组中整合的Luc转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。Luc转基因小鼠主要脏器如睾丸、肾脏、胃、肠、肺、脑、胸腺、肝脏和心脏等均可见Luc信号,但不同脏器间Luc强度有差异。结论成功制备Luc报告基因转基因小鼠。     

HBD-2转基因小鼠的建立及鉴定

人β防御素2（Human beta defensin 2，HBD-2）是人体抗菌肽的重要分子，体外试验研究证明具有广谱抗微生物活性，为开展其在整体水平上的功能研究，建立HBD-2转基因小鼠模型。用分子克隆方法构建了带CMV启动子的HBD-2全长cDNA真核重组表达质粒pCDNA3．1-HBD2，以此为摸板，PCR扩增出带CMV启动子和BGH polyA尾的HBD-2基因片段，用显微注射技术将此微基因导入小鼠雄原核中，于M16培养液培养后经输卵管移植到受体鼠体内让其怀孕产生子代小鼠。PCR法检测外源基因在小鼠基因组中的整合，RT—PCR和免疫组化法检测HBD-2在小鼠组织的表达。PCR检测结果显示17只F1代转基因鼠中4只检测到阳性信号，RT—PCR和免疫组化检测显示HBD-2在其F1代转基因小鼠生殖道、呼吸道、泌尿道以及血管内皮等组织部位广泛表达。实验表明HBIN2基因已整合到小鼠基因组且广泛表达，为进一步研究HBD-2的生物学功能及基因调控提供了有用的整体动物模型。     

HLA—Ⅱ类基因DRα,DRB1＊0401转基因鼠模型的建立及体内表 …

OBJECTIVE: To construct transgenic mice model on DR alpha and DRB1*0401 of human MHC-II molecules. METHODS: By microinjection techniques on germ nucleus of zygotes, DRalpha and DRB1*0401 genes were injected into zygotes of C57BL/6 x DBA/1 hybrid mice and transplanted into the oviducts of pseudopregnancy female mice. The integration and expression of exogenous genes in offspring were detected by PCR, Southern blot and Northern blot, RT-PCR analysis. RESULTS: There were 5 founders of all injected mice, which had steadily inherited to the fifth generation. It was found that 95 mice were positive by PCR and 68 mice were integrated exogenous gene by Southern blot analysis. DRalpha and DRB1*0401 genes were expressed on spleen and kidney of transgenic mice. CONCLUSION: This experiment on the construction of DRalpha and DRB1*0401 transgenic mice model is a success.     

NK4基因的克隆及其在Raji细胞中的表达

目的： 克隆NK4基因,构建其重组真核表达载体,并观察其在Raji细胞中的表达。方法：从人肝组织中提取总RNA,行RT-PCR获得NK4基因cDNA,与载体pVITRO2-mcs构建重组真核表达载体,转染Raji细胞。潮霉素B筛选后,采用实时荧光定量PCR、ELISA、细胞免疫组化和半固体培养等方法检测NK4基因在Raji细胞的表达,筛选稳定表达的细胞株。结果：NK4基因获成功克隆并构建了重组真核表达载体pVITRO2-mcs-NK4;转染NK4基因后的Raji细胞经RT-PCR发现存在特异性DNA片段。NK4基因在Raji细胞可稳定表达NK4 mRNA和蛋白,且可抑制Raji细胞的增殖、迁徙和侵袭。结论：NK4基因成功克隆并构建了重组真核表达载体,转染Raji细胞后表达稳定。     

mOX40-Fc的真核表达及其对混合淋巴细胞反应的影响

构建重组pcDNA3.1-mOX40-Fc真核表达载体,在CHO细胞中表达,并初步研究融合蛋白mOX40-Fc对MLR中细胞增殖的影响。克隆编码hIgG1Fc基因片段,与编码小鼠OX40胞外段的基因融合,构建mOX40-Fc融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1-mOX40-Fc;转染CHO细胞构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株,用RT-PCR及夹心ELISA检测其表达,纯化后经SDS-PAGE及Western blot法对其进行鉴定,混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果:核苷酸序列测定显示构建的mOX40胞外段和hIgG1Fc段基因序列与GenBank序列一致、阅读框完整;RT-PCR、ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达;功能实验提示mOX40-Fc能抑制MLR中的细胞增殖。成功构建mOX40-Fc真核表达载体并获得高效表达,该重组蛋白可在体外通过抑制OX40/OX40L共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。     

小鼠CD86基因启动子的构建及活性分析

为构建小鼠CD86启动子,并对其特异性调控能力进行鉴定。首先自C57BL/6J小鼠基因组中采用高保真PCR扩增小鼠CD86基因的启动子,经测序鉴定后,插入pCDNA3.1-EGFP重组质粒。然后分别转染小鼠来源细胞株:RAW264.7、NIH/3T3、P815、SP2/0、EL4细胞,观察各细胞内绿色荧光蛋白的表达。结果显示,小鼠CD86基因启动子的序列与GenBank报道一致;双酶切鉴定证实小鼠CD86启动子序列已经克隆入重组载体;小鼠CD86启动子能调控EGFP在巨噬细胞系RAW264.7细胞中表达,不能调控EGFP在NIH/3T3、P815、SP2/0和EL4非抗原提呈细胞内表达。说明成功构建小鼠CD86基因启动子,且该启动子具有特异性调控目的基因表达的活性。     

原核注射产生转基因小鼠中的缺失整合

用心脏特异性启动子肌球蛋白轻链－２（ｍｙｏｓｉｏｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ－２）ＭＬＣ２和糜酶结构基因相拼接构建ＭＬＣ２－糜酶融合基因，通过原核注射法产生转基因小鼠。用特异性引物对新生鼠鼠尾ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增初选，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交确定整合有外源基因的阳性鼠。低熔点琼脂糖凝胶电泳回收阳性鼠ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段，经测序后，与所转外源基因序列比较，发现缺失整合现象。     

葡萄糖调节蛋白78真核表达载体及稳定转染人视网膜色素上皮细胞株的构建

背景：葡萄糖调节蛋白78是存在于内质网上最多的分子伴侣蛋白,具有保护细胞对抗细胞调亡的作用。 目的：构建携带并正确表达外源性人葡萄糖调节蛋白78基因的重组真核表达载体,建立葡萄糖调节蛋白78基因稳定转染的人视网膜色素上皮细胞系。 方法：扩增人葡萄糖调节蛋白78全长编码序列,将该目的基因与真核表达载体PEGFP-N1进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,以PCR方法鉴定阳性克隆,并进行测序和分析比对,获得融合蛋白表达质粒载体pEGFP-grp78。通过阳离子脂质体介导将重组质粒pEGFP-grp78转染入体外培养的人视网膜色素上皮细胞,经G418筛选,建立稳定表达细胞系。 结果与结论：体外培养的人视网膜色素上皮细胞株作为真核细胞表达系统,经荧光显微镜和RT-PCR方法检测,G418筛选的稳定转染细胞系中GFP大量表达,葡萄糖调节蛋白78 mRNA的表达量是正常视网膜色素上皮细胞的4倍左右,表示脂质体介导的pEGFP-grp78质粒成功转染视网膜色素上皮细胞,并高效稳定表达葡萄糖调节蛋白78。     

FcεRⅠ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基，并用重组蛋白制备单克隆抗体。方法用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεRⅠα蛋白基因，经T-A克隆、亚克隆至pET28a（＋）原核表达载体，将重组质粒转化到大肠杆菌BL．21．STAR（DE3），IPTG诱导表达FeaRIOt亚基蛋白，通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白；并用其免疫BALB／c小鼠，运用杂交瘤技术制备抗FeaRIOt亚基单克隆抗体，用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定。结果成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因，且测序正确；构建原核表达质粒FcεRⅠα-pET28a（＋）；成功建立4株稳定分泌抗FcεRⅠα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为G101、C22、G113、G42。通过细胞免疫荧光实验证实，4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠα亚基。结论成功利用基因重组技术制备了FcεRⅠα亚基蛋白，制备了4株效价高、特异性好的抗FcεRⅠα亚基单克隆抗体，为FcεRⅠα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础。